Ćw. 7 Metabolizm bakterii - procesy oddechowe

Oddychanie -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej z wykorzystaniem łańcucha transportu elektronów oraz egzogennego ostatecznego akceptora elektornów (organicznego lub nieorganicznego)

Ostateczne akceptory elektronów:

• Egzogenne:

• tlen (oddychanie tlenowe)

• związki nieorganiczne (oddychanie beztlenowe), np. azotany, które są redukowane do azotynów, tlenków azotu i N₂

Egzogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji oksydacyjnej (czyli podczas oddychania)

• Endogenne - związki organiczne powstałe z utlenienia substratu oddechowego, np. fumaran redukowany do bursztynianu, glicyna - do octanu, tlenek trimetyloaminy - do trimetyloaminy,

Endogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji substratowej, czyli np. podczas fermentacji

Mechanizmy tworzenia ATP u chemoorganoheterotrofów:

• Fosforylacja oksydacyjna - jest to mechanizm tworzenia ATP związany z transportem elektronów w łańcuchu oddechowym - w wyniku transportu elektronów powstaje siła protonomotoryczna napędzająca syntetazę ATP.

Aby fosforylacja oksydacyjna mogła zajść potrzeba:

• substratu, który jest donorem elektronów - musi to być związek na tyle zredukowany, żeby mógł być utleniony

• łańcucha transportu elektronów znajdującego się w błonie

• zewnętrznego (egzogennego) akceptora elektronów - może to być tlen (oddychanie tlenowe), związki nieorganiczne (tylko u prokariotów)

• Fosforylacja substratowa - zachodzi w czasie glikolizy i fermentacji. Ostatecznym akceptorem elektronów jest endogenny związek organiczny (jest to związek powstały z utleniania substratu oddechowego)

Fosforylacja substratowa zachodzi bez udziału łańcucha oddechowego -> dużo mniejszy zysk energetyczny niż w przypadku fosforylacji oksydacyjnej.

Podział bakterii ze względu na wymagania tlenowe:

• Tlenowce - wykorzystują tlen jako ostateczny akceptor elektronów

• Bezwzględne - bez tlenu ich rozwój jest niemożliwy

• Względne - nie wymagają tlenu, jednakże ich rozwój lepiej przebiega w środowisku tlenowym, np. Escherichia coli

• Mikroaerofile - mogą wykorzystywać tlen, ale bardzo słabo rosną w stężeniu tlenu z powietrza. Rosną w 1-15% stężeniu tlenu. Np. Enterococcus faecalis, Campylobacter jejuni, Magnetospirillum magnetotacticum

• Beztlenowce - nie wykorzystują tlenu jako akceptora elektronów i nie są zdolne do wzrostu w atmosferze (21% stężeniu tlenu)

• Aerotolerancyjne - tolerują niskie stężenie tlenu

• Bezwzględne - nawet niskie stężenie tlenu jest dla nich letalne

Oddychanie azotanowe - oddychanie w którym azotany są wykorzystywane jako końcowe akceptory elektronów. Bakterie wykorzystujące ten typ oddychania są względnymi tlenowcami - w środowisku z dostępem tlenu wykorzystują go jako akceptor elektronów, dopiero gdy nie ma tlenu wykorzystują azotany.

W oddychaniu azotanowym występuje krótszy niż w oddychaniu tlenowym łańcuch oddechowy - zysk energetyczny jest mniejszy

Jednym ze sposobów tego oddychania jest denitryfikacja

Azotany przyjmują elektrony i są redukowane:

NO₃^- -¹> NO₂^- -²> NO -³> N₂O -⁴> N₂

Zielonym kolorem są oznaczone produkty gazowe.

1 - reduktaza azotowa dysymilacyjna (znajduje się w błonie) -> hamowana przez obecność tlenu

2 - reduktaza azotynowa dysymilacyjna (w cytoplazmie) -> hamowana przez obecność…

3 - reduktaza tlenku azotu

4 - reduktaza podtlenku azotu

W glebie zachodzi denitryfikacja (zubożenie gleby w azotany) w warunkach złego napowietrzenia (ponieważ bakterie denitryfikujące przeprowadzają oddychanie azotanowe tylko w przypadku braku tlenu)

Wzrost stężenia N₂O potęguje efekt szklarniowy.

Ponad to denitryfikacja powoduje zubożenie gleby w związki azotowe

Oddychanie azotanowe może tylko prowadzić do powstania azotynów, np. E. coli u której ostatecznym akceptorem jest azotan - E. coli nie posiada enzymów do dalszej redukcji związków azotowych.

Oddychanie siarczanowe - występuje u niektórych bezwzględnych beztlenowców. Ostatecznym akceptorem elektronów są siarczany a produktem jest H₂S

Fermentacja (występuje u chemooragnotrofów) -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji substratowej.

• Nie ma w niej łańcucha oddechowego

• Związki nie ulegają całkowitemu spalaniu - powstaje produkt który ma jeszcze w sobie energię

• Końcowym akceptorem elektronów jest endogenny związek organiczny

• Jest znacznie mniej wydajna energetycznie od oddychania tlenowego - dlatego procesy fermentacji są bardzo intensywne (każda komórka wymaga takiego samego zapotrzebowania na energię). Mały zysk ponieważ występuje niepełne spalanie związków

• Fermentację przeprowadzają warunkowe tlenowce i beztlenowce

• Produktami fermentacji są:

• Kwasy, np. masłowy, mlekowy

• Alkohole, np. etylowy, izopropanowy, butylowy

• Ketony, np. aceton

• Gazy, np. CO2,

Jeśli jedynym produktem fermentacji jest kwas mlekowy to mówimy o fermentacji homomlekowej.

Jeśli oprócz kwasu mlekowego powstają inne produkty to mówimy o fermentacji heteromlekowej

Większość procesów rozkładu cukrów przebiega do pirogronianu - w wyniku redukcji pirogronianu podczas fermentacji często powstaje kwas mlekowy

Metody hodowania beztlenowców:

1. Całkowite usunięcie O₂ i zastąpienie go mieszaniną gazów obojętnych (Ar, N₂, He). Stworzenie takich warunków jest możliwe w anaerostacie - urządzeniu służącym do hodowania beztlenowców. Tylko w anaerostacie możemy używać metod umożliwiających ilościowe badanie beztlenowców (żeby na płytkach wyrosły kolonie)

2. Niecałkowite usunięcie tlenu - hodowanie warunkowych beztlenowców:

• Stosowanie wysokiego słupa płynnego podłoża - dyfuzja tlenu na sam dół słupa jest słaba

• Usunięcie tlenu rozpuszczonego w podłożu przez zagotowanie przed wysianiem - wraz ze wzrostem temperatury maleje rozpuszczalność tlenu w cieczach

• Dodanie do płynnej pożywki agaru tak by powstał 0,1-0,2% roztwór - zwiększenie lepkości pożywki co skutkuje mniejszym mieszaniem pożywki i tym samym mniejszym rozpuszczaniem tlenu w pożywce

• Dodanie substancji zredukowanych, które obniżają potencjał oksyredukcyjny, np. glukozy, cysteiny

• Tuż po posiewie zalać słupek parafiną - odcinamy tym samym dostęp tlenu

• Stosowanie gazpaków - zamknięty pojemnik z saszetka w której znajduje się substancji powodująca wytwarzanie wodoru - wraz ze wzrostem stężenia wodoru spada stężenie tlenu

W czasie metabolizmu tlenu powstają reaktywne formy tlenu, które są szkodliwe dla komórek:

• O₂^-• rodnik ponadtlenkowy

• H₂O₂ nadtlenek wodoru

Enzymy inaktywujące toksyczne pochodne tlenu:

• Dysmutaza ponadtlenkowa:

2 O₂^-• + 2H⁺ -> O₂ + H₂O₂

• Katalaza:

2H₂O₂ -> O₂ + H₂O

• Peroksydaza:

H₂O₂ + NADH + H⁺ -> 2H₂O + NAD

Bakterie bezwzględnie beztlenowe (np. Clostridium) nie mają lub mają niski poziom aktywności katalazy oraz peroksydazy - dlatego są wrażliwe na tlen

Mikroaerofile nie mają niektórych mechanizmów obronnych przez toksycznymi metabolitami metabolizmu tlenowego - stąd ich gorszy wzrost w warunkach tlenowych (lepiej rosną w obniżonym ciśnieniu tlenu)

1. Określenie stosunku bakterii do tlenu:

Przygotowujemy 2 warianty bulionu odżywczego:

• Bulion odżywczy w postaci niskiego słupa podłoża - dobre warunki tlenowe

• Bulion odżywczy w postaci wysokiego słupa podłoża, które było wcześniej zagotowane, dodano do niego 0,5% glukozy (związek zredukowany), a po wysianiu zalano od góry parafiną - złe warunki tlenowe

Obserwujemy intensywność wzrostu poszczególnych szczepów w obu typach podłoża:

Intensywność wzrostu	dobre natlenienie	Złe natlenienie	Stosunek do tlenu	Obecność katalazy
Micrococcus luteus	++	++	Tlenowiec względny	+
Pseudomonas fluorescens	++	-	Tlenowiec bezwzględny	+
Escherichia coli	++	++	Tlenowiec względny	+
Serratia marcescens	++	++	Tlenowiec względny	+
Bacillus subtilis	++	-	Tlenowiec bezwzględny	+
Paracoccus versutus	++	++	Tlenowiec względny	+
Pseudomonas stutzeri	++	-	Tlenowiec bezwzględny	+
Enterococcus faecalis	+-	++	Mikroaerofil	-

++ - dobry wzrost

+- - słaby wzrost

- - brak wzrostu

Pseudomonas stutzeri - jest denitryfikatorem więc może oddychać beztlenowo. W teście wyszło inaczej ponieważ do oddychania azotanowego potrzebuje on NO₃^- których nie ma w podłożu

Serratia marcescens - w niskiej temperaturze oraz w warunkach tlenowych wytwarza czerwony barwnik - hodowla ma różowy kolor.

W warunkach beztlenowych gatunek ten ma biały wzrost.

Serratia marcescens wykorzystywana jest jako biologiczny test na obecność tlenu.

W jaki sposób Escherichia coli oddycha na wysokim słupie?

Na pewno nie przeprowadza ona fermentacji ponieważ w bulionie odżywczym nie ma ani laktozy ani glukozy.

Wykorzystuje ona fumaran jako zewnętrzny akceptor elektronów. Jest to oddychanie (ponieważ występuje łańcuch oddechowy), tak więc powstaje dużo więcej energii niż w przypadku fermentacji.

Pozostałe względne tlenowce również wykorzystują jakieś egzogenne akceptory elektronów.

2. 24-godzinne hodowle szczepów bakterii na płytkach z agarem odżywczym zalać wodą utlenioną. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności katalazy - enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru na wodę i tlen.

Jedynie na agarze odżywczym z Enterococcus faecalis nie pojawiają się bąbelki - nie posiada on katalazy, ponieważ jest mikroaerofilem

3. Oddychanie bakterii w warunkach beztlenowych - oddychanie azotanowe i denitryfikacja:

Denitryfikacja - redukcja azotanów do wolnego azotu

Oddychanie azotanowe - niepełna denitryfikacja, czyli niepełna redukcja azotanów.

Jako podłoże stosujemy bulion odżywczy z dodatkiem KNO₃ (źródło azotanów) w postaci wysokiego słupa (warunki beztlenowe). W probówce z podłożem umieszczamy rurkę Durham'a - jest to maleńka probówka służąca do zbierania gazów. Obecność gazów w probówce będzie świadczyła o przeprowadzaniu denitryfikacji przez bakterie.

Dodatkowo przeprowadzamy reakcję barwną na obecność azotynów (czy zachodzi oddychanie azotanowe= czy bakterie mają reduktazę azotową dysymilacyjną) - na skutek reakcji NO₂^- z α-naftyloaminą powstaje czerwone zabarwienie.

	Wzrost	Obecność NO2^-	Obecność gazu
Escherichia coli	+	+	-
Pseudomonas stutzeri	+	-	+
Serratia marcescens	+	+	-
Paracoccus versutus	+	-	-
Pseudomonas fluorescens	+	-	-
Micrococcus luteus	+	-	-

Wnioski:

1. Hodowle które po dodaniu α-naftyloaminy zmieniają barwę na czerwoną zawierają azotyny - przeprowadzają oddychanie azotanowe

2. Bakterie w hodowlach w których w rurce Durhama jest gaz (N₂) są denitryfikatorami

4. Fermentacja i peptonizacja mleka - badamy czy bakterie przeprowadzają fermentację mleka (badanie zdolności proteolitycznych)

Bakterie wsiewamy do odtłuszczonego mleka z lakmusem - lakmus nadaje podłożu fioletowe zabarwienie.

Jeśli w hodowli danego szczepu zachodzi fermentacja (laktoza jest rozkładana) to powstaje zakwaszenie, które zmienia barwę lakmusu z fioletowej na różową

Dodatkowo możemy określić typ fermentacji mlekowej:

• Jeśli powstaje jedna „bryła” skrzepu mleka to mamy do czynienia z fermentacją homomlekową

• Jeśli natomiast skrzep mleka jest porozrywany (przez wydzielający się gaz) - fermentacja heteromlekowa

Enterococcus faecalis

1. Mleko jest ścięte w gładki (nieporozrywany) skrzep - homofermentacja mlekowa -> jedyny produktem fermentacji jest kwas mlekowy

2. Lakmus na górze słupa zmienia barwę na różową - powstaje zakwaszenie przez co wytrąca się kazeina (przy pH<4,6) - - powstaje skrzep kwaśny. Powstaje tylko kwas mlekowy - skrzep gładki. Od fosfokazeinianu wapnia odszczepia się wapń, powstaje mleczan wapnia-następuje obniżenie stężenia wapnia w białku, wytrąca się wolna kazeina

3. Od dna probówki lakmus jest odbarwiony - lakmus jest wykorzystywany jako egzogenny akceptor elektronów

4. Innym egzogennym akceptorem elektronów jest pirogronian - ponieważ kwas mlekowy jest jedynym produktem

Escherichia coli

• Lakmus zmienia kolor na różowy w wyniku zakwaszenie - powstaje skrzep kwaśny

• W skrzepie widać pęcherzyki gazu (skrzep poszarpany) - Escherichia coli przeprowadza fermentacje kwasów mieszanych - w wyniku fermentacji laktozy powstaje szereg kwasów. Jako akceptory elektronów wykorzystywane są różne związki -> powstaje dużo CO₂ oraz… w wyniku czego skrzep jest poszarpany

Bacillus subtilis

• Nie ma zmiany barwy na różową -> brak zakwaszenia

• Alkalizacja - na skutek dezaminacji

• Powstaje gąbczasty skrzep (skrzep słodki) - tworzy się w wyniku działania enzymów proteolitycznych

• Na górze mleko jest przejrzyste - na skutek hydrolizy kazeiny

• Bacillus subtilis nie fermentuje laktozy

5. Test redukcji błękitu metylenowego jako demonstracja intensywności procesu oddechowego

Do przygotowanych 5 probówek, wlać równe oobjętośco odpowiednich rozcienczeń młodej hodowli bulionowej E. Coli wg schematu a następnie dodać błękitu metylenowego

Nr probówki	Bulion (ml)	Hodowla (ml)
1	9	1
2	7	3
3	5	5
4	-	10
5 (kontrola)	10	-

Błękit metylenowy jest redukowany jedynie w przypadku braku tlenu. Dlatego w hodowli staraliśmy się utworzyć warunki beztlenowe stosując wysoki słup podłoża, by zaobserwować intensywność procesu oddychania w zależności od stężenia/zagęszczenia hodowli.

Wnioski:

1. W próbie kontrolnej wogóle nie następuje odbarwienie błękitu metylenowego - nie ma tam procesów oddechowych (bo nie ma tam bakterii)

2. Im jest większe stężenie bakterii w pożywce tym szybciej następuje odbarwienie roztworu -? Procesy oddechowe są intensywniejsze

3. Odbarwienie następuje od dna probówki, ponieważ panują tam warunki beztlenowe

4. Po odbarwieniu większości roztworu na szczycie hodowli pozostaje niebieski pierścień - w tym rejonie hodowla cały czas styka się z powietrzem: na skutek dyfuzji cały czas panują tam warunki tlenowe, więc błękit metylenowy nie jest wykorzystywany do redukcji

---