BAKTERIE-LEKCJA 1.

Sposoby barwienia bakterii:

• barwienie proste: jeden barwnik

• barwienie złożone: więcej niż jeden barwnik

Barwniki- są to związki chemiczne, zdolne do adsorbowania na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe barwne połączenia. W cząsteczkach tych związków wyróżniamy grupę chromoforową(barwną) (np. grupy -azo, -nitrozo, -azoksy, tiokarbonylową) i grupę auksochromową zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem (np. aminową, hydroksylową).

Wykonywanie preparatów-technika:

Preparaty mokre i suche. Mokre - do oglądania bakterii przyżyciowo- glonów, drożdży, grzybów nitkowatych, promieniowców. Do ich przygotowania używa się szkiełek podstawowych (umytych chromianką lub detergentem wypłukanych i odtłuszczonych przez przemycie alkoholem etylowym),szkiełek nakrywkowych.

Preparaty suche uzyskiwane są po utrwaleniu oraz wybarwieniu drobnoustrojów na szkiełku.

Utrwalenia dokonać można dzięki czynnikom fizycznym: (ogrzewanie szkiełka z rozmazem w płomieniu palnika) lub chemicznym (alkohol etylowy, metylowy, formalina, kwas osmowy). Materiał utrwalamy w celu zabicia żyjących tam drobnoustrojów, a co za tym idzie dla ułatwienia wnikania barwników do wnętrza komórek bakteryjnych.

BARWIENIE GRAMA:BARWIENIE ZŁOŻONE RÓŻNICUJĄCE

bakterie G+- na fioletowo

bakterie G-- na różowo

PRZEPIS:

1. kropla płynu fizjologicznego

2. analiza bakteryjna

3. suszenie i utrwalanie

4. filolet krystaliczny 3 min

5. płyn Lugola 2min

6. alkohol (funkcja różnicująca)

7. woda - do bezbarwnej kropli

8. suszenie

9. safranina -30 sek

10. płukanie wodą suszenie

11. oglądanie pod mikroskopem

Alkohol powoduje: denaturację białek, rozpuszcza tłuszcz, odwadnia i wytrąca cukry. Po dodaniu alkoholu w barwieniu Grama: Bakterie Gram +-kompleks uwięziony, komórki obkurczone; bakterie Gram - -kompleks wypłukiwany.

Przykłady patogennych bakterii G+ i G-

G+	Gronkowce np. Staphylococcus albus laseczka Bacillus anthracis maczugowiec błonicy paciorkowce pałeczka tężca prątek Kocha prątek trądu paciorkowce Bacillus subtilis
G-	krętek blady pałeczka duru brzusznego pałeczka Helicobacter pylori pałeczka okrężnicy-Escherichia coli pałeczka Y. pestis pałeczki z rodzaju Brucella pałeczki z rodzaju Shigella przecinkowiec cholery

Różnica w barwieniu bakterii G+ i G- wynika z budowy ściany komórkowej bakterii.

Bakterie Gram (+).Ściana komórkowa:

• błona cytoplazmatyczna

• gruba warstwa mureiny(20-30 warstw)- warstwa sztywna

• kwasy lipotejchojowe i tejchojowe( na rysunku powinno być „tejchojowe”)-warstwa plastyczna. Tejchojowe łączą się w ścianie z kwasem N - acetylomuraminowym, a kwasy lipotejchojowe są przyłączone do błony cytoplazmatycznej.

• U niektórych bakterii G + -kwas tejchuronowy;mogą też być oligosacharydy bądź białka warunkujące właściwości chorobotwórcze bakterii

Bakterie Gram (-).ściana komórkowa:

• błona cytoplazmatyczna

• 1-3 warstw mureiny

• Błona zewnętrzna ma 2 warstwy: dolną stanowią fosfolipidy a górną LPS (lipopolisacharyd). LPS pełni funkcje ochronne, jest antygenem i endotoksyną, której mała ilość we krwi może dać szok toksyczny lub śmierć. Ponadto w błonie zewnętrznej są pory, zwane porynami. Są to białka tworzące kanały przez które przechodzą substancje do wnętrza komórki.
  

Peptydoglikan -mureina, glikopeptyd, mukopeptyd, muropeptyd. Występuje u G+ i G- brak go u form L, Archeabacteriae, Mycoplasmatales. Tworzy on warstwę sztywną ściany kom. Zbudowany jest z łańcucha cukrowego i peptydowego. Głównymi składnikami peptydoglikanu są
N-acetyloglukozamina i kwas N-acetylomuraminowy. Połączone one są wiązaniem glikozydowym β-1,4. Liczba podjednostek cukrowych powyższych związków jest różna u różnych gatunków drobnoustrojów. Przez wolną grupę karboksylową reszty kwasu mlekowego kwas
N-acetylomuraminowy łańcuch wielocukrowy łączy się z pentapeptydem o składzie aminokwasów charakterystycznym dla gatunku bakterii. Wyróżniamy 5 typów pentapeptydów oznaczonych A-E. W pozycji 3 pentapeptydu zawsze występuje aminokwas zasadowy (lub DAP) z wolną grupą aminową dzięki której tworzą się krzyżowe wiązania międzypeptydowe lub mostki międzypeptydowe pomiędzy poszczególnymi łańcuchami peptydoglikanu. Połączenia krzyżowe mają charakter mostków peptydowych składających się z jednego rodzaju aminokwasu. Obecność mostków międzypeptydowych lub krzyżowych wiązań bezpośrednich w peptydoglikanie warunkuje stopień jego usieciowania, u g- 20-30%, u g+ 100%.

Sieciowanie polega na wiązaniu ze sobą komórek drobnoustroju różnymi reagentami, zdolnymi do reakcji z grupami funkcyjnymi ich ściany komórkowej.

Mureina typu A np. u Escherichia coli, sieciowanie przez wiązanie krzyżowe i przez mostki peptydowe.

Mureina typu B np. u Corynebacterium

BARWIENIE ZIEHL-NIELSENA:BARWIENIE DIAGNOSTYCZNE RÓŻNICUJĄCE

* Stosuje się je dla drobnoustrojów kwasoopornych (Mycobacterium-prątki, Nocardia-promieniowce, Corynebacterium- maczugowce, przetrwalniki laseczek). Posiadają one odmienną chemicznie ścianę komórkową w porównaniu z bakteriami niekwasoopornymi(Escherichia coli, Staphylococcus albus ).Zawierają dużą ilość lipidów w zewnętrznej osłonie (kwas mykolowy-warunkuje kwasoodporność) oraz woski. Cecha ta może być uwidoczniona dzięki tej metodzie barwienia- wprowadzenie do komórek na gorąco roztworu fuksyny karbolowej. W tej metodzie nie można wypłukać tego barwnika dzięki alkoholowi etylowemu zakwaszonemu kwasem solnym. Dobarwia się tutaj również barwnikiem kontrastowym- błękitem metylenowym co ułatwia rozpoznawanie prątków (czerwone na niebieskim tle preparatu).

PRZEPIS:

1. fuksyna karbolowa na gorąco

2. woda

3. alkohol SOLNY

4. błękit metylenowy

5. woda

POŻYWKI:

1. M9:

-podłoże syntetyczne minimalne

Na2HPO4 6g

KH2PO4 3g

NaCl 0.5g

NH4Cl 1g

MgSO4 0.5g

CaCl2 11mg

agar 15g

10ml 15%wej glukozy

woda do 1000 ml

2. podłoże LEVINA:

-półsyntetyczne

-substancją różnicującą jet laktoza lub sacharoza

-daje ciemnofioletowe kolonie

pepton 10g

KH2PO4 2g

laktoza 5g

sacharoza 5g

eozyna Y 1% wodny r_rór 30ml

0.2% ro-ru wodnego błękitu metylenowego 32. 5ml

agar 20g

woda do 1000 ml

III.podłoże SIMMONSA:

-całkowicie syntetyczne

-źródłem wegla jest cytrynian sodu

NaCl 5g

(NH4)H2PO4 1g

KH2PO4 1g

MgSO4 0.2g

0.4% r_rór błękitu bromotymolowego 20 ml

agar 20 g

woda do 1000 ml

3. Podłoże McConkeya:

-półsyntetyczne

pepton 17g

laktoza 10g

dezoksycholanina 1.5g

czerwień obojętna 1% wodny r-rór 5ml

fiolet krystaliczny 1ml

agar 17g

woda do 1000ml

PSEUDOMONAS, SALMONELLA,ENTEROBACTER:

1. PSEUDOMONAS:

*bakteria G-

*mała pałeczka

2. SALMONELLA:

*bakteria G-

*pałeczka

3. ENTEROBACTER:

*bakteria G-

*mniejszy niż Salmonella

• malutka pałeczka

BAKTERIE CHOROBOTWÓRCZE SPOTYKANE W KOSMETYKACH TO BAKTERIE GRAM (-) Z RODZ. ENTEROBACTER ORAZ PSEUDOMONAS (NAJBARDZIEJ SZKODLIWY)!!!!ZDARZAJĄ SIĘ BAKTERIE G+(PACIORKOWCE, GRONKOWIEC ZŁOCISTY,BACILLUS)..

W KOSMETYKACH POWINNY ZNAJDOWAĆ SIĘ WYŁĄCZNIE BAKTERIE !!!NIECHOROBOTWÓRCZE!!!

PODŁOŻA MIKROBOLOGICZNE:

CECHY:

*jałowe

*ciśnienie osmotyczne 0.75 NaCl

*musi zawierać źródło azotu, węgla

*pH podłoża ok 7, 7.2, 7.3

*klarowne

*odpowiedni zasób soli mineralnych

PODŁOŻA-PODZIAŁ

*ze wzgl. Na zawartość składników odżywczych

**minimalne (niezbędne do podtrzymania wzrostu bakterii; dla autotrofów i prototrofów)

**pełne (dobrze dostarczalne źródło węgla i azotu, dodatkowe składniki wzrostowe; dla auksotrofów)

** wzbogacone (dodatkowe sustancje tkankowe:żółtko, płyny wysiękowe, mleko; dla bakterii chorobotwórczych)

*ze wzgl. Na zawartość związków chemicznych:

** naturalne (LB)

**półsyntetyczne (McConkey)

** syntetyczne (M9)

*ze wzgl Na konsystencję:

**płynne 0.1-0.7% agaru

** półpłynne 0.8-1.4% agaru -> badanie ruchu bakterii

** stałe 1.5-2% agaru -> do identyfikacji

*ze względu na zastosowanie podłóż:

** namnażające (zaw. zw.chem pozwalające na wzrost 1 grupy bakterii, hamujące wzrost innych grup)

**transportowe

**selektywne

** różnicujące (zaw.indykator, substancję zmieniającą kolor pod wpływem pH)

CHARAKTERYSTYKA KOLONII:

1. Bacillus subtilis:

-śr. 2-10mm

-okrągła z pomarszczonym brzegiem

-wzniesienie płaskie

-brzeg falisty

-kolor beżowy

2. Sarcina lutea:

-pakietowiec

-śr. 2-5mm

-okrągła z wałem brzeżnym

-wzniesienie pępkowate

-brzeg falisty

-ciemnożółte matowe woskowe nieprzejrzyste

3. Staphylococcus aureus:

-śr. 3Mm

-okragła

-lekko wypukła

-brzeg gładki

-ciemnożółty błyszczący nieprzejrzysty

4. Micrococcus luteus:

-śr. 3-4mm\

-okrągła z wałem brzeżnym

-wzniesienie pępkowate

-brzeg falisty

-cytrynowe

-błyszczące nieprzezroczyste

5. Nocardia coralis

-śr. 1Mm

-złożona kolonia

-wzniesienie kraterowate

-brzeg lokowaty

-pomarańczowa matowa krucha struktura

6. Pseudomonas aerubinosa:

-śr. 3-4mm

-okrągła z pomarszczonym brzegiem

-lekko wypukłe wzniesienie

-zapach charakterystyczny parafiny z plastikiem

-brzeg falisty

-środek ciemnozielony,lekko brązowy

-obrzeże beżowe

-kolonizuje środowisko

-wydziela do podłoża zielony barwnik o charakterze antybiotyku

7. Seratia marcescens:

-śr.2-5mm

-okrągła z pomarszczonym brzegiem

-brzeg flisty

-kolor od beżowego do czerwonawego (zmienia kolor pod wpływem UV)

8. Salmonella:

-śr.2-3mm

-wzniesienie pępkowate

-okrągła z wałem brzeżnym

-brzeg falisty

-beżowa nieprzejrzysta ewentualnie półprzejrzysta

---