www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

Mikrobiologia – materiały II semestr

SEMINARIUM 1

Metody klasyczne w diagnostyce mikrobiologicznej:

–

mikroskopia

–

hodowla

–

serologia

Materiał diagnostyczny do diagnostyki mikrobiologicznej:

–

mocz (środkowy strumień za wyjątkiem testów na Chlamydie i Ureoplasma – w ich
przypadku wyjątek! – pierwszy strumień moczu)

–

krew obwodowa

–

nasienie

–

płyn owodniowy

–

kał

–

wymazy ginekologiczne

–

włosy

–

bloczki parafinowe

PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy:

–

powiela się tą metodą określony fragment DNA (konserwatywny dla danego gatunku

bakterii)

–

urządzenie które ją przeprowadza to termocycler (czyt. termosajkler)

–

etapy procesu:

1. pobranie materiału

2. ekstrakcja DNA:

− najpierw niszczy się komórki (możliwe metody: fizyczna, chemiczna, enzymatyczna), z

reguły enzymem (proteinazą K) w temp. 70-90°C

− potem przenosi się to na podłoże z krzemem, który wiąże DNA (tzw. „sitko/sączek

krzemowy”)

− potem oczyszczanie i zagęszczanie DNA (alkohole w różnych stężeniach)

− potem uwolnienie DNA z kompleksu z krzemem

− tak przygotowane DNA możemy przechowywać w zamrażarce:

)

gdy do miesiąca – to temp. –20°C

)

gdy chcemy dłużej niż miesiąc to temp. –70°C

3. przepis „na PCR”:

− składniki: przygotowane DNA + zestaw odczynników:

)

10× „bufor PCR” (zawiera jony Mg

2+

, bo polimeraza ich potrzebuje do działania)

)

dNTP (trifosorany wszystkich deoksynukleotydów)

)

primer 1 (komplementarny do jednego końca kopiowanego regionu DNA)

)

primer 2 (komplementarny do drugiego końca kopiowanego regionu DNA)

)

Taq-polimeraza (polimeraza z bakterii termofilnej)

)

H

2

O

− mechanizm reakcji (to przeprowadza termocycler):

1. wstępna denaturacja – ok. 90°C przez 2 min.

2. właściwa denaturacja – 94°C przez 30-60 sek.

3. przyłączanie primerów (annilling) – 55-65°C przez 30-60 sek.

4. synteza łańcucha przez polimerazę – 72°C przez 60 sek.

5. powtórzenie 30-40× punktów od 2 do 4 (denaturacja → annilling → synteza)
6. dokończenie syntezy – 10 min.

Uwaga – dopiero od 3 cyklu otrzymujemy „w pełni zdefiniowane produkty PCR”.

4. detekcja DNA (kontrola, czy PCR zaszedł) – elektroforeza na żelu z dodatkiem bromku

etydyny, który wciskając się między zasady (inkorporując z DNA) uwidacznia po
elektroforezie miejsca, gdzie jest DNA na agarze

5. odczyt

Podczas samego PCR też odbywa się kontrola (np. czy nie było kontaminacji, czyli

zanieczyszczeń):

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

–

kontrola pozytywna (bada, czy warunki dla reakcji PCR były odpowiednie – tu do zestawu
użytych odczynników zamiast DNA pacjenta dodaje się DNA kontrolne)

–

kontrola negatywna (zamiast DNA dodaje się wody, po to, żeby zbadać, czy użyte
odczynniki nie były zanieczyszczone) – tu po elektroforezie nie powinno być żadnego prążka

Elektroforeza detekcyjna – na I kanał zawsze nakłada się specjalne „markerowe DNA”, ono po

elektroforezie daje prążki w określonych miejscach, stanowi jakby „linijkę” do oceny
następnych kanałów.

Na drugim i trzecim kanale umieszcza się z reguły kontrolę pozytywną i kontrolę negatywną
(na tym kanale nie powinno być żadnego prążka, jeśli jest to odczynniki były „brudne”).

ODMIANY PCR:

–

NESTER PCR:

)

inaczej wewnętrzny PCR

)

używa się dwóch zestawów primerów (razem 4 sztuki)

)

drugi zestaw primerów jest komplementarny do odcinka DNA, który wcześniej

ograniczał pierwszy zestaw primerów, jest tu więc jakby podwójna kontrola, czy
powiela się konkretnie zdefiniowany odcinek DNA

–

PCR MULTIPLEX:

)

używa się wielu zestawów primerów

)

kopiuje wiele odcinków DNA, lub DNA różnych bakterii za jednym razem

METODA FISH = HYBRYDYZACJA FLUORESCENCYJNA IN SITU

–

używa się tu komplementarną do fragmentu DNA znakowaną fluorescencyjnie sondę

–

jest mniej specyficzna niż PCR

–

ją się najczęściej robi na skrawku parafinowym

RFLP = POLIMORFIZM FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH

–

stosujemy enzymy (restryktazy) tnące DNA w miejscach o specyficznej sekwencji

–

stosowana do celów epidemiologicznych

–

porównujemy rozkład prążków między poszczególnymi pacjentami

BLOTTING – tzw. bloty = metoda kanapkowa

Southern Blot

Western Blot

Northern Blot

− dotyczy DNA

− elektroforeza w poziomie

(horyzontalna)

− dotyczy białka

− elektroforeza w pionie

(wertykalna)

− STS-page (na żelu poli-

akrylamidowym)

− wykorzystywany np. do

potwierdzenia HIV

− dotyczy RNA

− elektroforeza w poziomie

(horyzontalna)

OPIS Western Blottingu:

–

najpierw izolacja białka (z reguły metodą enzymatyczną lub chemiczną)

–

potem elektroforeza na żelu STS (tu prąd płynie wzdłuż żelu)

–

„transfer na mikrocelulozę” – przenoszenie (uporządkowanych przez elektroforezę) białek z

żelu na błonę z mikrocelulozy (tu prąd przepuszczany jest prostopadle do żelu i przyłożonej
do niego błony z mikrocelulozy)

Elektroforeza

Transfer

–

uwidocznienie białek:

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

2

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

)

dodanie znakowanego przeciwciała, np. enzymem (fosfatazą alkaliczną)

)

inubacja

)

zmycie nadmiaru przeciwciał

)

dodanie barwnego substratu dla enzymu

)

inkubacja

)

obserwujemy zmianę koloru – natężenie zabarwienia jest wprost proporcjonalne do

ilości przeciwciał, co się mierzy spektrofotometrycznie

ODMIANA – Western-Immuno-Blotting:

–

szukamy przeciwciał

–

dodajemy znakowane czymś przeciwciało łączące się z poszukiwanym przeciwciałem, czyli

tzw. antyglobulinę

Wykorzystanie w/w metod:

a) identyfikacja bakterii:

ƒ

M. tuberculosis, Borelia burgdorferi, Treponema pallidum, Helicobacter pylori,

Chlamydia pneumonice, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalum, Ureoplasma
ureolyticum i inne

b) identyfikacja wirusów:

ƒ

HIV, HPV, EBV, HCV, HIV i inne

c) wykrywanie genów oporności:
ƒ

gen mecA – u szczepów MRSA (metycylinoopornych szczepów gronkowca złocistego)

ƒ

gen tetM – u paciorkowców (oporność na tetracykliny)

d) wykrywanie genów kodujących wytwarzanie egzotoksyn:

ƒ

enterotoksyny E. coli

ƒ

toksyna V. cholerae

ƒ

toksyna A u Cl. difficile

ƒ

inne

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

3

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

SEMINARIUM 2

Odczyny serologiczne:

–

są to takie odczyny, w których zachodzi reakcja serologiczna (reakcja antygen-przeciwciało)

–

wykorzystujemy je in vitro dwojako:

1. gdy chcemy wykrywać antygeny (stosujemy wtedy specjalną surowicę z przeciwciałami

specyficznymi dla poszukiwanego antygenu)

2. gdy chcemy znaleźć przeciwciała we krwi pacjenta

–

większość to metody swoiste – wg schematu klucz-zamek

–

są też metody nieswoiste, gdy wykorzystujemy coś, co „symuluje” właściwy antygen, np.

ƒ

kardiolipina (przy badaniu na kiłę – „symuluje” antygeny Treponema pallidum)

ƒ

Proteus OX-19 (przy badaniu na riketsje – dur plamisty, gorączka plamista Gór

Skalistych) = odczyn Weil-Felixa

–

w zależności od typu reakcji mamy różne odczyny:

a) odczyn precypitacji:

ƒ

w tej reakcji używany jest nieupostaciowany antygen – jest on małą cząsteczką (np.

elementem wyciągu z tkanek, komórki bakteryjnej), zwie się go „precypitynogenem”

ƒ

przeciwciała wykorzystywane w tej reakcji to „precypityny”

ƒ

w zależności od użytego sprzętu mamy różne metody:

METODA PROBÓWKOWA:

np. odczyn Ascoliego (na wąglika)
w probówce mamy surowicę z przeciwciałami anty-wąglik i nakrapiamy na tę surowicę
przesącz z mięsa podejrzanego o zakażenie wąglikiem

Reakcja jest dodatnia, gdy widzimy na powierzchni surowicy tzw. „pierścień precypi-
tacyjny”

METODA W ŻELU = IMMUNODYFUZYJNA

np. do poszukiwania toksyn bakteryjnych
Wycinamy w środku żelu kółko i nakrapiamy tam surowicę z przeciwcia-
łami, dookoła nakrapiamy wyciąg z podejrzanej o wytwarzanie toksyn

hodowli bakteryjnej.
Reakcja jest dodatnia, gdy obserwujemy „łuki precypitacyjne” w miejscu

wyrównania stężeń antygenu i przeciwciał w żelu

Modyfikacją metody immunodyfuzyjnej jest próba Eleka na toksynę maczugowca błonicy
(Corynebacterium diphteriae):

na płytkę z żelem nakładamy paseczek bibuły nasączony surowicą z

przeciwciałami przeciw toksynie błoniczej
prostopadle do paseczka wysiewamy badany szczep maczugowca
błonicy podejrzany o wytwarzanie toksyny

reakcja jest dodatnia, gdy obserwujemy „łuki precypitacyjne” w
miejscu wyrównania stężeń toksyny i przeciwciał w żelu

[nie wszystkie C. diphteriae wytwarzają toksynę – tylko te, które

mają zintegrowane DNA bakteriofaga ze swoim DNA, w ten sposób
zyskując gen „tox” warunkujący powstawanie toksyny]

b) odczyn aglutynacji:

ƒ

jest odczynem przebiegającym w dwóch fazach:

1. faza – dochodzi do swoistego połączenia się antygenu z przeciwciałem (Ig)

2. faza – dochodzi do wypadania konglomeratów na skutek utraty hydrofilności

cząsteczki

ƒ

przeciwciała użyte w tej reakcji to „aglutyniny”

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

4

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

ƒ

antygen jest tu dużą cząsteczką upostaciowaną (np. komórka bakteryjna lub fragment

krwinki)

ƒ

wymaga obecności elektrolitów!!!

ƒ

w wyniku reakcji aglutynacji ustalamy miano – to jest największe rozcieńczenie

surowicy, w którym stwierdzamy, że zachodzi jeszcze aglutynacja

ƒ

w zależności od użytego sprzętu mamy różne metody:

METODA SZKIEŁKOWA:

WYKRYWA ANTYGEN!!!
− np. test na obecność Salmonella

− na szkiełko nakraplamy surowicę z przeciwciałami do wykrywania

antygenów bakteryjnych

− w teście na Salmonella najpierw stosujemy tzw. surowicę HM (równoważną) reagującą z

wszystkimi grupami Salmonella

− potem na innych szkiełkach nakrapiamy surowice z przeciwciałami swoistymi grupowo – A,

B, C, D… (ale oczywiście tylko wtedy, gdy próba z surowicą równoważną wyszła „+”)

− reakcja jest dodatnia, gdy obserwujemy „kłaczki”

METODA PROBÓWKOWA:
WYKRYWA PRZECIWCIAŁA!!!

− np. odczyn Widala (do diagnozy

durów i paradurów – przeciwciał

anty-S.typhi i anty-S.paratyphi
A, B, C)

− odczyn Widala jest odczynem

swoistym

− wykonujemy go dopiero w 2-3 tyg. od zachorowania – organizm musi mieć czas na

wytworzenie przeciwciał

− wykonujemy w dwóch rzędach szereg geometrycznych rozcieńczeń surowicy badanej

− do każdej probówki w pierwszym rzędzie dodajemy antygenu somatycznego O

(lipopolisacharyd)

− do każdej probówki w drugim rzędzie dodajemy antygenu rzęskowego H

− inkubujemy i odczytujemy wynik – trzeba lekko wstrząsnąć probówką i patrzeć czy coś

unosi się nad osadem – NIE ZA MOCNO, żeby nie rozpuścić osadu!

− reakcja jest dodatnia, gdy w probówce widzimy wykładniki aglutynacji:

)

w probówkach z antygenem O zachodzi aglutynacja grudkowa (takie „kłaczki”)

)

w probówkach z antygenem H zachodzi aglutynacja obłoczkowa (taka „mgiełka”)

− dalej określamy miano odczynu, czyli najwyższe rozcieńczenie surowicy, gdzie widać jeszcze

aglutynację, fizjologiczne jest od 1:100 do 1:200, gdy mamy wynik > 1:200 ponawiamy
badanie po 10/14 dniach, gdy ktoś aktualnie choruje, to miano wzrośnie, gdy podwyższenie

jest efektem dawnego przechorowania – to miano będzie stało w miejscu

− formą odczynu Widala jest odczyn Widala-Wrighta na brucelozę

analogiczny jest też odczyn Weil-Felixa na dur plamisty i na gorączkę plamistą Gór Skalistych;
jest on jednak odczynem nieswoistym, gdyż zamiast riketsji stosujemy szczep Proteus OX-19

c) odczyn neutralizacji toksyny – odczyn ASO:

ƒ

bada poziom antystreptolizyn [przeciwciał przeciw toksynom St. pyogenes (gr.A)] w

surowicy pacjenta

ƒ

po przechorowaniu choroby, której przyczyną jest St. pyogenes (β-hemoliozujące gr.A)

możliwymi powikłaniami są kłębuszkowe zapalenie nerek i reumatoidalne zapalenie
stawów

ƒ

St. pyogenes (gr.A) wytwarzają szereg toksyn – m.in. hemolizyny (substancje

powodujące hemolizę erytrocytów) zwane streptolizynami (są dwie: „O” oraz „S”); tylko

jedna z nich („O”) jest immunogenna i przeciwko niej nasz układ immunologiczny
wytwarza przeciwciała – antystreptolizynę

ƒ

przepis:

)

wykonujemy szereg rozcieńczeń surowicy badanej

)

do każdej probówki dodajemy po 1 j.m. streptolizyny

)

inkubujemy w cieplarce

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

5

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

)

aby uwidocznić reakcję dodajemy erytrocytów króliczych, które hemolizują pod

wpływem streptolizyny O (która jest hemolizyną i leukocytotoksyną)

)

gdy w surowicy jest wystarczająca ilość antystreptolizyn aby zneutralizować

podaną streptolizynę, to erytrocyty nie rozpadną się (nie dojdzie do hemolizy),

tylko opadną na dno probówki, a rozwór będzie klarowny – taki wynik
odczytujemy jako dodatni

)

gdy w surowicy jest niewystarczająca ilość antystreptolizyn aby zneutralizować

podaną streptolizynę, to ten nadmiar streptolizyny spowoduje rozpad erytrocytów

(zajdzie hemoliza) i roztwór w probówce stanie się czerwony – taki wynik
odczytujemy jako ujemny

)

odczytujemy miano odczynu – tj. największe rozcieńczenie surowicy badanej, w

którym nie ma jeszcze hemolizy (na rys. miano = 1:75)

)

gdy miano odczynu ASO = 1:200 – świadczy to o przebytym procesie chorobowym

)

gdy miano odczynu ASO = 1:160 – wynik wątpliwy i należy powtórzyć test

)

gdy miano odczynu ASO >> 1:200 – świadczy o tym, że niedawno toczył się

proces chorobowy

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

6

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

SEMINARIUM 3 – Diagnostyka kiły

1. ODCZYNY NIESWOISTE:

–

nieswoiste dlatego, bo wykorzystujemy w nich „antygeny zastępcze” – w przypadku kiły
kardiolipinę jako antygen zamiast krętków bladych (Treponema pallidum)

–

kardiolipina jest to frakcja lipidowa z serca wołu

–

stosujemy kardiolipinę dlatego, ponieważ nie umiemy w warunkach laboratoryjnych
namnażać krętków bladych (możemy je jedynie hodować na jądrach królików)

–

jeżeli wyjdzie wynik dodatni – to postępujemy wg zasady: „każdy dodatni odczyn nieswoisty
musi być potwierdzony odczynem swoistym”, czyli w naszym przypadku takim, w którym
używa się jako antygenu krętków

–

wyniki mogą być fałszywie dodatnie przy:

)

zakażeniach innymi krętkami

)

gruźlicy czynnej

)

stosowaniu leków sterydowych

)

u kobiet ciężarnych

a) odczyn Wassermanna:

–

już się go nie stosuje, bo za często daje wyniki fałszywie dodatnie

–

my go jednak zrobimy, bo jest to przykład na odczyn wiązania dopełniacza (komplementu)

–

przepis:

)

do kardiolipiny dodajemy surowicę pacjenta, w której poszukujemy przeciwciał (Ig)

kiłowych, musi to być tzw. surowica inaktywowana (tzn. pozbawiona dopełniacza)

)

dodajemy dopełniacz (komplement) – z reguły otrzymywany z krwi świnki morskiej

)

jeżeli surowica pacjenta zawierała Ig przeciw kile to dopełniacz zareaguje i złączy się z

kompleksem antygen-przeciwciało i po 30 min. inkubacji powstanie trzyskładnikowy

kompleks antygen-przeciwciało-dopełniacz

)

jeżeli surowica pacjenta nie zawierała Ig przeciw kile to nie doszło do powstania

kompleksu antygen-przeciwciało i dopełniacz nie ma się do czego dołączyć i
pozostanie wolny

)

następnie uwidacznia się reakcję, czyli dodaje się „amboceptor hemolityczny” i krwinki

baranie

)

amboceptor jest to surowica królicza z przeciwciałami przeciwko krwinkom baranim

–

gdy dopełniacz jest nie związany z kompleksem kardiolipina-przeciwciało, to zareaguje z
amboceptorem doprowadzając do hemolizy erytrocytów baranich

–

gdy dopełniacz jest związany w kompleks kardiolipina-przeciwciało-dopełniacz, to już nie ma
co zareagować z amboceptorem i nie obserwujemy hemolizy erytrocytów baranich

–

wynik jest dodatni, gdy nie zachodzi hemoliza

–

wynik jest ujemny, gdy hemoliza zajdzie

–

jak dla mnie to to był fajny test… trzeba było 5 zwierzaków: wołu (kardiolipina), królika
(amboceptor), świnkę morską (dopełniacz) i owcę (erytrocyty), no i człowieka (surowica

badana)… Podziwiam pana Wassermanna, ja bym na to nie wpadł…

b) odczyny kłaczkujące (flokulacyjne):

–

wykrywają reaginy w krwi badanej

–

są to VDRL i jego modyfikacja – UPR oraz odczyn RPR

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

7

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

1. test VDRL (veneral disease reserch laboratory)

)

jest przykładem na zjawisko precypitacji

)

na szkiełko nakrapiamy kroplę badanej surowicy pacjenta – jest to tzw. surowica

inaktywowana (czyli pozbawiona dopełniacza)

)

dodajemy kroplę kardiolipiny

)

patrzymy, czy wytrącają się kłaczki

)

jeśli nie ma kłaczków – wynik ujemny, gdy są – to dodatni (przy czym wynik

podaje się stopniując: jeden plus (+) – gdy są pojedyncze kłaczki; dwa plusy

(++), gdy są wyraźne kłaczki, ale rozwór jest mętny; trzy plusy (+++), gdy są
wyraźne kłaczki i roztwór jest klarowny

)

gdy dostajemy wynik dodatni, to rozcieńczamy surowicę i przeprowadzamy po

kolei (tak samo jak wyżej) próby z różnym stężeniem surowicy i ustalamy miano

2. test UPR

)

jest to modyfikacja VDRL

)

test przeprowadza się tak samo jak VDRL

)

jednak udogodnieniem jest to, że kardiolipina zawiera już substancję inaktywującą

dopełniacz i nie trzeba wcześniej inaktywować surowicy badanej

3. test RPR (rapid plasma reagin)

)

w tym teście kardiolipina opłaszczona jest na cząsteczkach węgla

)

na białą kartkę nakraplamy inaktywowaną surowicę pacjenta, dodajemy kroplę

kardiolipiny

)

wynik jest dodatni, gdy obserwujemy wyraźne czarne strąty

2. ODCZYNY SWOISTE:

–

swoiste dlatego, bo wykorzystujemy w nich jako antygen krętki blade

–

mają jedną subtelną wadę – drogie…

a) test TPHA = odczyn hemaglutynacyjny (Treponema pallidum hemagglutination

assay):

–

jest najczęściej stosowanym odczynem swoistym

–

jest przykładem zjawiska aglutynacji

–

stosuje się tu krwinki spłaszczone antygenami Treponema pallidum, pochodzącymi ze
„szczepu Nicolsa”

–

do kropli krwinek dodaje się kroplę rozcieńczonej 1:10 surowicy pacjenta i odstawia na

15 min., gdy w surowicy są przeciwciała kiłowe dochodzi do aglutynacji krwinek

–

stosując fabrycznie przygotowany bufor rozcieńczający dokonujemy rozcieńczeń surowicy i
przeprowadzamy po kolei ten test, aby ustalić miano

–

wynik ujemny wygląda „jak guziczek”, wynik dodatni wygląda jak „rozproszone czerwone
plamki”

b) test immunofluorescencji pośredni:

–

antygenem są tu całe krętki blade

–

ich zawiesinę rozprowadza się na szkiełku i to musi trochę podeschnąć

–

nakrapia się na to kroplę surowicy badanej i inkubuje w wilgotnej komorze przez 30 min.

–

potem płuczemy preparat BPS’em (buforowanym roztworem soli fizjologicznej)

–

uwidaczniamy reakcję dodając antyglobuliny (czyli przeciwciała przeciw przeciwciału
ludzkiemu), które wyznakowane są izotiocyjanianem fluoresceiny (prościej: fluoresceiną)

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

8

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

–

znów płuczemy BPS’em

–

oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym – gdy krętki świecą na zielono to wynik jest

dodatni, gdy nie ma świecenia – ujemny

–

mechanizm testu: do krętków przyłączają się przeciwciała kiłowe z surowicy pacjenta (jeżeli
je ma), potem wypłukujemy nadmiar niezwiązanych przeciwciał BPS’em, potem do

przeciwciał złączonych z krętkami przyłączają się znakowane fluoresceiną antyglobuliny
ludzkie, ich nadmiar spłukujemy i zostają tylko te, które związały się w kompleks krętek-

przeciwciało-znakowane przeciwciało, taki kompleks widoczny jest pod mikroskopem
fluorescencyjnym. Gdy w surowicy pacjenta nie ma przeciwciał kiłowych, znakowane

przeciwciała się spłuczą, bo nie będą miały do czego się przykleić, stąd nie będzie świecenia

–

UWAGA! W kile I-rzędowej nie przeprowadza się tego testu, bo jeszcze nie ma przeciwciał,
wykonuje się test immunofluorescencji bezpośredni

ƒ

różnica między pośrednim a bezpośrednim jest taka, że w pośrednim szukamy

przeciwciał w badanym materiale, a w bezpośrednim – antygenu (u nas krętków)

ƒ

w bezpośrednim jedynym odczynnikiem jest znakowane fluoresceiną przeciwciało

przeciwkrętkowe, po spłukaniu nadmiaru którego BPS’em preparat ogląda się pod
mikroskopem fluorescencyjnym

c) odczyn enzymatyczny ELISA:

–

robi to aparat Beringa

–

na „płytkę plexi” z gotowymi antygenami kiłowymi dodajemy surowicę pacjenta

–

inkubujemy → płuczemy

–

dodajemy antyglobulinę ludzką (anty-Ig) powiązaną z enzymem (albo peroksydazą

chrzanową, albo alkaliczną fosfatazą)

–

inkubujemy → płuczemy

–

dodajemy barwny substrat dla enzymu

–

obserwujemy zmianę koloru – natężenie zabarwienia jest wprost proporcjonalne do ilości

przeciwciał, co się mierzy spektrofotometrycznie

–

mechanizm testu: gdy w surowicy pacjenta znajdowały się przeciwciała przeciwkrętkowe, to
połączyłyby się one z antygenami kiłowymi na „płytce plexi”, reszta jest taka sama jak w

teście immunofluorescencji pośrednim, tylko jedyna różnica jest taka, że tam antyglobuliny
znakowane były fluoresceiną, a tu – enzymem

d) odczyn immobilizacyjny Nelsona:

–

uważany za historyczny

–

jest to odczyn, w którym obserwuje się unieruchomienie krętków z powodu obecności
immobilizyn krętkowych w surowicy pacjenta

–

bardzo drogi, bo krętki muszą być żywe

–

robi się to tak:

ƒ

bierze się dwa szkiełka, na oba nakłada krętki i dodaje dopełniacz

ƒ

na jedno szkiełko nakrapia się badaną surowicę, a na drugie – rozwór soli (NaCl)

ƒ

to drugie szkiełko służy jako kontrola („próba ślepa”)

ƒ

porównuje się po pewnym czasie ruchliwość krętków na obu szkiełkach

ƒ

gdy przynajmniej 60% krętków w „próbie właściwej” (pierwsze szkiełko) jest

unieruchomione w porównaniu do „próby ślepej” (drugie szkiełko) test uważa się za

dodatni

www.lek2002.prv.pl | lek2002.xoopiter.net

9