1

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok II stopnia

Biochemia

ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM

Wstęp

Elektroforezę można najogólniej określić jako ruch fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej

zachodzący pod wpływem przyłożonej zewnętrznie różnicy potencjałów.

Istotę elektroforezy stanowi wędrówka w polu elektrycznym cząsteczek posiadających ładunek elektryczny

(dodatni lub ujemny) i proces rozdzielania tych cząsteczek na skutek różnicy szybkości ich wędrowania w

roztworze (elektroforeza swobodna) lub w nośnikach (tzn. w roztworach wypełniających kręte kapilary

nośników). Nośnikami mogą być takie substancje, jak np. bibuła, agar, skrobia, żel agarozowy, żel

poliakrylamidowy.

Jedną z najczęściej stosowanych obecnie metod elektroforetycznych jest elektroforeza żelowa. Pozwala

ona na uzyskanie lepszych wyników rozdziału mieszaniny związków niż stosowana dawniej elektroforeza

bibułowa. Środowisko żelowe w przeciwieństwie do bibuły nie przejawia własności adsorpcyjnych i

charakteryzuje się większą zdolnością rozdzielczą, gdyż cząsteczki wędrujące w polu elektrycznym z różną

szybkością zależną od ich ładunku, podlegają w żelu "przesiewaniu molekularnemu". Rolę "sita" spełniają pory

w sieci żelu, których wielkość zależy od rodzaju i sposobu przygotowania żelu.

Najbardziej selektywną i bardzo czułą metodą analitycznego rozdziału mieszanin białkowych jest

elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE - polyacrylamide gel electrophoresis). Stosowana jest ona min.

jako dogodne kryterium czystości enzymów. Rozdział ten może jednak ulegać zaburzeniom, jeżeli w

mieszaninie poddawanej elektroforezie istnieją tendencje do tworzenia kompleksów między cząsteczkami tych

samych lub różnych białek. Stosowanie środków denaturujących (jak mocznik lub chlorowodorek guanidyny)

bądź detergentów zapobiega agregacji. Powszechnie stosowana jest elektroforeza w obecności

dodecylosiarczanu sodu (SDS) - anionowego detergentu, który wiążąc się z białkami wiązaniami jonowymi jak

też poprzez oddziaływania hydrofobowe, rozszczepia ich kompleksy (SDS-PAGE). SDS nadając białkom silny

ładunek ujemny powoduje, że wszystkie wędrują do anody, z szybkością zależną od wielkości cząsteczek.

Elektroforeza w warunkach denaturujących i w obecności SDS jest stosowana do badania homogennosci białek,

oznaczania ich masy cząsteczkowej i liczby podjednostek w białkach oligomerycznych.

Żel poliakrylamidowy powstaje w procesie kopolimeryzacji akrylamidu (H

2

C=CH-CO-NH

2

) z N,N’-

metyleno-bis-akrylamidem [(H

2

C=CH-CO-NH)

2

CH

2

] w obecności odpowiednich katalizatorów. Zwykle do

polimeryzacji stosuje się nadsiarczan amonu (NH

4

)

2

S

2

O

8

i TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminę).

Inhibitorem reakcji polimeryzacji jest tlen cząsteczkowy obecny w powietrzu, dlatego roztwory żelu

należy odpowietrzyć przed polimeryzacją, a po uformowaniu warstwy żelu na jego powierzchnię nawarstwić

wodę (lub n-butanol nasycony wodą).

Wielkość porów żelu zależy przede wszystkim od stężenia akrylamidu, ale także od proporcji akrylamid

: bisakrylamid i ustala się ją w zależności od masy cząsteczkowej badanych białek. Najczęściej stosuje się

stężenie 7-10%, przy którym można uzyskać dobre wyniki w przypadku białek o masie cząsteczkowej 20 – 150

2

kDa. Do elektroforezy białek o mniejszej cząsteczce stosuje się żel o wyższym stężeniu akrylamidu, np. 15-20%,

a w przypadku bardzo dużych - o niższym stężeniu akrylamidu, nie niższym jednak niż 3,5%.

Rozdział białek przebiega wewnątrz słupka żelu zamkniętego w rurce szklanej („elektroforeza

rurkowa”) lub w cienkiej warstwie (elektroforeza płytowa). Żel może być jednorodny lub złożony z dwu warstw

o różnej gęstości i pH, przez które kolejno przechodzi rozdzielany materiał. W tym ostatnim przypadku, warstwa

lub słupek żelu składa się z dolnej części "rozdzielającej" i umieszczonej ponad nią części "zagęszczającej", w

której próbka ulega zagęszczeniu przed wniknięciem do warstwy separującej.

W zależności od wartości punktu izoelektrycznego (pI) nakładanych białek stosuje się żel rozdzielający

o różnym pH (3,0-9,0), zaś pH żelu zagęszczającego wynosi zwykle 6,0-7,0. Stężenie akrylamidu w tej ostatniej

warstwie żelu wynosi 2-5%. Elektroforezę białek o niskim pI przeprowadza się w środowisku alkalicznym

(tzw. elektroforeza anodowa), zaś białek o wysokim pI - w środowisku kwaśnym (tzw. elektroforeza katodowa).

Próbkę nakłada się albo w roztworze zawierającym monomery akrylamidowe, które polimeryzują

tworząc trzecią warstwę żelu zamykającą badany materiał, albo też roztworze sacharozy lub glicerolu (5-25%).

Ilość białka, jaką się zwykle stosuje, wynosi 10-100 µg/żel.

Białka rozdzielone podczas elektroforezy uwidacznia się w żelu przez wybarwianie czernią amidową

(Amido Black), błękitem Coomassie (Coomassie Brilliant Blue R250) lub jonami srebra. Niektóre białka

enzymatyczne można również uwidocznić w żelu wykorzystując ich aktywność katalityczną. W tym celu stosuje

się po elektroforezie barwienie substratowe. W najprostszym przypadku, kiedy enzym przekształca bezbarwny

substrat w barwny produkt, stosuje się inkubację żelu w roztworze substratu zawierającym bufor o odpowiednim

pH oraz dodatkowe potrzebne składniki (np. donory lub akceptory elektronów, koenzymy). Substrat dyfunduje

w głąb żelu i w miejscu, gdzie znajduje się enzym zostaje przekształcony w barwny produkt.

Taką metodą uwidacznia się m. in. lakazę, stosując do barwienia po elektroforezie roztwór gwajakolu. Wymaga

to jednak przeprowadzenia procesu elektroforetycznego w warunkach pozwalających na zachowanie aktywności

badanych enzymów (elektroforeza natywna). Nie można więc stosować środków denaturujących, a proces

rozdziału należy przeprowadzać w niskiej temperaturze.

Wykonanie ćwiczenia:

Elektroforezę białek przeprowadzamy w nieciągłym systemie buforowym. Jako bufor elektrodowy

stosuje się bufor: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, o pH 8,3. Żel składa się z dwóch warstw: warstwy żelu

rozdzielającego (10%) oraz warstwy żelu zagęszczającego (3%).

Do przygotowania żelu rozdzielającego (10%) należy użyć:



1 000 mg akrylamidu (UWAGA! NEUROTOKSYNA)



33 mg bisakrylamidu



14 mg nadsiarczanu amonu

dopełnić do 10 ml 0,375 M buforem Tris-HCl, pH 8,8.

Składniki rozpuścić, odpowietrzyć i bezpośrednio przed naniesieniem między płytki aparatu do

eletroforezy pionowej (PAGER MINI) dodać 7µl TEMED-u.

Uformować warstwę żelu rozdzielającego i nawarstwić wodą destylowaną w celu odcięcia powietrza.

3

Pozostawić do polimeryzacji (ok. 0,5 - 1 godz.).

Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, usunąć wodę i wprowadzić roztwór żelu zagęszczającego

(3%) przygotowanego według podanego poniżej przepisu. Następnie umieścić w nim grzebień formujący

studzienki na próbki, w taki sposób, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się pod ząbki grzebienia.

Przygotowanie żelu zagęszczającego (3%):



150 mg akrylamidu (UWAGA! NEUROTOKSYNA)



10 mg bisakrylamidu



7 mg nadsiarczanu amonu

dopełnić do 5 ml 0,125 M buforu Tris-HCI, pH 6,8.

Po rozpuszczeniu składników, roztwór żelu odpowietrzyć i dodać 7 µl TEMED-u Czas polimeryzacji

tego żelu wynosi min. 30 min.

Rozdział elektroforetyczny

Po spolimeryzowaniu żelu zagęszczającego należy wlać bufor elektrodowy do obu ("górnego" i

"dolnego") zbiorników aparatu i ostrożnie wyjąć grzebień formujący, uważając by nie oderwać części żelu

rozdzielających poszczególne studzienki. Przy napełnianiu zbiorników buforem elektrodowym zwrócić uwagę,

by drut elektrody był całkowicie zanurzony w buforze.

Próbki białka (preparat lakazy), zagęszczone 2% sacharozą lub 20% gliceryną i zabarwione 0,03%

błękitem bromofenolowym nanieść do odpowiednich studzienek w objętości: 5 µl, 10 µ1, 15 µl, 20 µl, 25 µl.

Aparat do elektroforezy połączyć przewodami z zasilaczem i rozpocząć proces rozdziału - początkowo przy

napięciu 100 V (żel zagęszczający), a po wniknięciu próbek do warstwy żelu rozdzielającego zwiększyć napięcie

do 150 V.

Zasilacz odłączyć, gdy czoło barwnika znajdzie się w odległości ok. 5 mm od końca żelu. Wylać bufor,

otworzyć aparat, przeciąć żel wzdłuż na 2 części i odpowiednio wybarwić.

Barwienie białek metodą srebrową (Fast Protocol Zakład Bioch. Univ. Iowa (2001)):

1) Zanurzyć żel na 30 minut w kąpieli „fiksującej” zawierającej:

 40ml metanolu

 13,5ml formaldehydu

 46,5ml H

2

O (MilliQ)

2) Zanurzyć żel na 1 minutę w 0,02% Na

2

S

2

O

3

3) Barwienie:



Zanurzyć żel na 10 minut w 0,1% azotanie srebra (0,lg/100 ml) UWAGA: roztwór nietrwały sporządzić

tuż przed barwieniem!



Spłukać wodą (MilliQ)

4) Rozwijanie:



Zanurzyć żel w kąpieli rozwijającej zawierającej:

 3% Na

2

CO

3

 50 µl formaldehydu

 2 ml 0,02% Na

2

S

2

O

3

4



Reakcję zatrzymać dodatkiem kwasu cytrynowego in substancia



Przenieść do wody MilliQ.

Barwienie substratowe:

Żel umieścić w kąpieli zawierającej 1 ml gwajakolu w 100 ml 0,1M buforu Mc Ilvaine’a pH 5,3

Obserwować pojawiające się prążki.

Zaliczenie ćwiczenia:

Zamieścić w zeszycie opis ćwiczenia. Przerysować do zeszytu wybarwiony elektroferogram (uwzględniając

obie metody ujawniania rozdzielonych substancji).

5

Odczynniki i sprzęt:



aparat do elektroforezy i przewody przyłączające zasilacz



pompa olejowa rotacyjna



kolbki ssawkowe 100 ml - 2 szt.



korki do kolbek ssawkowych



cylinder 25 ml - 2 szt;



strzykawki 2 ml i 10 ml z igłami



pojemniki do barwienia



mini-strzykawka do nawarstwiania próbek



kolbka lub zlewka 100 ml



bufor elektrodowy: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyną, pH 8,3



akrylamid - stosować rękawiczki 1-razowe i maseczkę



N,N’-metyleno-bis-akrylamid



nadsiarczan amonu



TEMED



Bufor żelu rozdzielającego: 0,375 M bufor Tris-HCI, pH 8,8



Bufor żelu zagęszczającego: 0,125 M bufor Tris-HCI, pH 6,8



Barwienie białka: UWAGA: wszystkie roztwory odczynników w wodzie milliQ!

 metanol,

 formaldehyd

 0,02% Na

2

S

2

O

3

(0,02g/100 ml)

 azotan srebra

 3% Na

2

CO

3

,

 kwas cytrynowy

 woda milliQ



Barwienie substratowe:

 gwajakol 1g/100ml etanolu

 0,1M bufor Mc Ilvaine’a pH 5,3

Piśmiennictwo:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa