Wp³yw antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton

mentagrophytes na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

The influence of Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes on lymphocytes

blastic transformation

Anita Hryncewicz-GwóŸdŸ, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda

Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii AM we Wroc³awiu

Porównano zdolnoœæ antygenów T. rubrum i T. mentagrophytes do stymulowania transformacji blastycznej (TB) limfocytów

zdrowych dawców. Stwierdzono, ¿e T. rubrum by³ s³abszym aktywatorem. Indeks transformacji blastycznej dla T. mentagrophytes

by³ trzykrotnie wy¿szy ni¿ dla T. rubrum. Oceniano wp³yw ekstraktów grzybni (A) i substancji uwalnianych do pod³o¿a (B), które

uzyskano z hodowli p³ynnej T. rubrum, oraz ich frakcji na TB limfocytów aktywowanych PHA (fitohemaglutynin¹). Wykazano,

¿e zarówno ekstrakty, jak i ich frakcje wyraŸnie hamowa³y proliferacjê limfocytów. Ekstrakty A i B w stê¿eniu 500 µg/ml hamowa³y

94 i 90% transformacji blastycznej. Ekstrakt A oddzia³ywa³ jeszcze w stê¿eniu 1 µg/ml, a ekstrakt B – w stê¿eniu 10 µg/ml.

Frakcje A1 i A2 hamowa³y odpowiedŸ limfocytów stymulowanych PHA w 75 i 70%. Pozosta³e frakcje dzia³a³y wyraŸnie s³abiej.

S³aba immunogennoœæ oraz w³aœciwoœci hamowania procesów immunologicznych przez T. rubrum mog¹ sprzyjaæ rozwojowi

przewlek³ej dermatofitozy.

S³owa kluczowe: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, transformacja blastyczna limfocytów

Lymphocyte transformation to T. rubrum and T. mentagrophytes antigens was assessed. T. rubrum was worse activator

than T. mentagrophytes. The influence of T. rubrum on proliferation of lymphocytes stimulated by PHA was examined. An

inhibitory effect on lymphoproliferation of mycelium (A), exoantigen (B) and their fractions was observed. Extracts A and B

at 500 µg/ml concentration inhibited 94 and 90% of lymphocyte transformation. Inhibitory effect was observed in concentration

of 10 µg/ml (extract A) and 1 µg/ml (extract B). A1 and A2 are the most active fractions inhibiting proliferation of stimulated

lymphocytes. The low immunogenicity and the inhibiting property of lymphoproliferation by the antigen of T. rubrum can play

a role in the generation of chronic infections with scanty symptoms.

Key words: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, lymphocyte blastic transformation

Prace oryginalne

Mikol. Lek. 1998, 5 (3): 141-148

ISSN 1232-986X

Wstêp

Dermatofity powoduj¹ce infekcjê naskórka i zrogo-

wacia³ych przydatków skóry mog¹ wywo³ywaæ u cz³o-

wieka zaka¿enia o ró¿nym przebiegu. Trichophyton ru-

brum, zaliczany do dermatofitów antropofilnych, jest

przyczyn¹ przewlek³ej i nawrotowej grzybicy skóry oraz

paznokci, któr¹ cechuje s³abo rozwijaj¹cy siê odczyn

zapalny (4). Dermatofitoza wywo³ana przez grzyby zoo-

filne przebiega odmiennie. Infekcja powoduje mianowi-

cie powstanie nasilonego stanu zapalnego, który mo¿e

doprowadziæ do eliminacji czynnika patogennego i sa-

mowyleczenia (12, 15, 16). Przyczyny wystêpowania

u niektórych osób infekcji o charakterze przewlek³ym

nie s¹ do koñca poznane. Pewn¹ rolê mog¹ odgrywaæ

warunki œrodowiskowe, jak wilgotne mikroœrodowisko

zwi¹zane z noszeniem nieprzewiewnego obuwia, oraz

w³aœciwoœci osobnicze, jak np. szybkoœæ podzia³ów ko-

mórek naskórka i z³uszczania jego powierzchownych

warstw (1). Nieprawid³owoœci dotycz¹ce specyficznej

komórkowej odpowiedzi immunologicznej mog¹ rów-

nie¿ wp³ywaæ na przebieg schorzenia. W trakcie infekcji

T. rubrum znacznie rzadziej ni¿ w grzybicy odzwierzêcej

dochodzi do pozytywizacji póŸnego odczynu skórnego

na trichofitynê (8, 13-15, 21). Poziom transformacji bla-

stycznej limfocytów u chorych, u których stwierdzono tê

infekcjê, pod wp³ywem antygenów grzybiczych mo¿e

byæ równie¿ niski (8, 10). W publikowanych w ostat-

141

142

Anita Hryncewicz-GwóŸdŸ, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda

Mikol. Lek. 1998, 5 (3)

nich latach pracach próbowano wyjaœniæ przyczyny s³a-

bego rozwoju specyficznej odpowiedzi komórkowej

w przebiegu dermatofitoz antropofilnych. Byæ mo¿e, ma

znaczenie s³absza zdolnoœæ T. rubrum do indukowania

pewnych procesów immunologicznych, a tak¿e dzia³anie

hamuj¹ce antygenów tego dermatofita na uk³ad odpor-

noœciowy (2, 4, 7, 18, 23).

Celem pracy by³o porównanie w³aœciwoœci immuno-

gennych T. rubrum, wywo³uj¹cego 90% dermatofitoz

przewlek³ych (18), oraz T. mentagrophytes – czynnika

patogennego grzybicy z nasilonym stanem zapalnym.

Zbadano transformacjê blastyczn¹ limfocytów od zdro-

wych osób pod wp³ywem ekstraktów grzybni obu der-

matofitów. Oceniono równie¿ wp³yw T. rubrum na od-

powiedŸ immunologiczn¹ na podstawie testu trans-

formacji blastycznej limfocytów zdrowych dawców

aktywowanych PHA (fitohemaglutynin¹) w obecnoœci

ekstraktów mycelium i metabolitów wydzielanych do

po¿ywki.

Materia³ i metody

Do badania wp³ywu antygenów dermatofitów na

transformacjê blastyczn¹ limfocytów u¿yto krwi zdro-

wych dawców, którzy w wywiadzie nie podawali za-

chorowania na dermatofitozê.

Badaniom poddano szczepy dermatofitów zoofil-

nych (T. mentagrophytes) i antropofilnych (T. rubrum),

które pochodzi³y z kolekcji Pracowni Mikologicznej

Kliniki Dermatologii we Wroc³awiu i by³y izolowane

z przypadków chorobowych. Z wyhodowanych szcze-

pów wykonano ekstrakty i frakcje.

Przygotowanie ekstraktów dermatofitów

T. mentagrophytes i T. rubrum

wed³ug Helandera (10)

Czterotygodniow¹ hodowlê (w temperaturze 20°C)

dermatofitów na pod³o¿u p³ynnym Sabourauda odwiro-

wano, po czym trzykrotnie przemyto roztworem soli fiz-

jologicznej. Uzyskany osad zawieszono w 0,1 M buforze

glicynowym o pH 9,0 i rozbijano ultradŸwiêkami trzykrot-

nie przez 10 minut. Sonifikat pozostawiono na 12 godzin

w temperaturze 4°C, a nastêpnie odwirowano z prêdko-

œci¹ 3 000 obrotów na minutê przez 20 minut. Do super-

natantu dodano 7,5 g octanu sodu/l. Nastêpnie dodano

dwie objêtoœci acetonu i precypitowano przez 2 godziny

w temperaturze 4°C. Precypitat uzyskany po wirowaniu

przy 3 000 obrotów na minutê rozpuszczono w wodzie

destylowanej, przes¹czono i sprawdzono ja³owoœæ na

pod³o¿u sta³ym Sabourauda.

Przygotowanie ekstraktu grzybni

T. rubrum (A) wed³ug Hanna (9)

Hodowlê T. rubrum prowadzono na pod³o¿u p³yn-

nym, uzyskuj¹c wzrost g³êbinowy. Inokulat przygotowa-

no w 10 bakteriologicznych probówkach, które zawiera³y

po 10 ml ja³owego pod³o¿a p³ynnego Sabourauda, i in-

kubowano przez 3 tygodnie. Hodowlê g³êbinow¹ prowa-

dzono na pod³o¿u Sabourauda przez 4 tygodnie w tem-

peraturze 27°C. W czasie inkubacji kolby wstrz¹sano

mechanicznie.

Osad grzybni przemyto wod¹ destylowan¹, a na-

stêpnie 400 ml acetonu i wysuszono na szalkach Pe-

triego (w temperaturze oko³o 37°C). Suchy materia³ roz-

tarto w porcelanowym moŸdzierzu, po czym traktowano

400 ml glikolu etylenowego. Czynnoœæ tê powtórzono

dwukrotnie. Ekstrakt glikolowo-etylenowy dializowano

przez 3 doby w du¿ej iloœci wody (ka¿dorazowo w oko-

³o 12 litrach wody). Po dializie zawartoœæ worków liofili-

zowano.

Przygotowanie ekstraktu substancji

wydzielanej do po¿ywki T. rubrum (B)

wed³ug Garga (6)

Nads¹cz czterotygodniowej hodowli na p³ynnym

pod³o¿u Sabourauda przefiltrowano przez bibu³ê What-

man 3. Filtrat zagêszczono 20 razy przez ultrafiltracjê,

przep³ukano dwiema objêtoœciami wody destylowanej,

a nastêpnie dodano 95% alkoholu etylowego, aby uzy-

skaæ 80-proc. stê¿enie. Po 24 godzinach przechowywa-

nia w temperaturze 4°C i sta³ego mieszania na miesza-

de³ku magnetycznym precypitat oddzielono przez wiro-

wanie przy 6 000 obrotów na minutê przez 30 minut.

Osad rozpuszczono w 60 ml demineralizowanej wody

destylowanej, wirowano przy 2 000 obrotów na minutê,

aby usun¹æ nierozpuszczalne cz¹steczki, a nastêpnie

liofilizowano.

Analiza i rozdzia³ chromatograficzny

ekstraktów T. rubrum wed³ug metody HPLC

Analizê i rozdzia³ chromatograficzny ekstraktów

grzybni i substancji uwalnianych do po¿ywki prowadzo-

no przy u¿yciu chromatografu Waters, wyposa¿onego

w detektor fotodiodowy PDA Waters 996 oraz pompê

wysokociœnieniow¹ sterowane za pomoc¹ programu

Millenium 2010. Stosowano kolumny Spherisorb C8

250×4 mm ID (Knauer) i C18, przy przep³ywie 1 ml na

minutê, oraz uk³ad rozpuszczalników metanol–woda

w stosunku 80:20 w systemie izokratycznym.

Oznaczanie cukrów

Cukry ca³kowite neutralne oznaczano metod¹ fenol/

/kwas siarkowy (5).

Monocukry przeprowadzone w lotne pochodne octa-

nów alditoli identyfikowano wed³ug metody chromato-

grafii gazowo-cieczowej sprzê¿onej ze spektrometri¹

masow¹. Do analizy u¿yto chromatografu gazowego

sprzê¿onego ze spektrometrem masowym firmy Hew-

lett-Packard HP 5971 z kolumn¹ kapilarn¹ o wymiarach

0,22 mm×12 m. Pomiary prowadzono w temperaturze

wynosz¹cej 150-270°C (8°C na minutê), u¿ywaj¹c helu

jako gazu noœnego (20).

Oznaczanie iloœci bia³ka

Bia³ka w preparatach grzybiczych oznaczano wed³ug

metody Lowry’ego i wsp. (17).

Ocena toksycznoœci ekstraktów grzybiczych

Toksycznoœæ oceniano in vitro. Sporz¹dzano roz-

cieñczenia preparatu i dodawano zawiesinê limfocytów

ludzkich (PBL), a nastêpnie inkubowano przez 24 go-

dziny. ¯ywotnoœæ komórek oceniano wed³ug metody

MTT, porównuj¹c z ¿ywotnoœci¹ komórek, do których

nie dodano preparatu.

Izolacja limfocytów

Masê leukocytarn¹ po lizie erytrocytów przemy-

wano dwukrotnie, a nastêpnie zawieszono w p³ynie

143

Wp³yw antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

Hanksa, nawarstwiano na glikol

z dodatkiem uropoliny i wirowa-

no przez 15 minut przy 3 000 ob-

rotów na minutê (3). Pierœcieñ

zawieraj¹cy komórki zbierano,

przemywano trzy razy p³ynem

Hanksa. Do osadu dodawano

po¿ywki RPMI-1640 z dodatkiem

10% FCS i gentamycyny w stê-

¿eniu 10 µg/ml. Komórki liczo-

no i doprowadzano do gêstoœci

2×10

6

/ml.

Transformacja blastyczna

limfocytów (TB)

Limfocyty o gêstoœci 2×10

6

/

ml zawieszono w po¿ywce RPMI

z dodatkiem 10% FCS, 2 mM

glutaminy i 10 µg/ml gentamy-

cyny rozlano po 100 µl do p³a-

skodennych mikrop³ytek sk³a-

daj¹cych siê z 96 do³ków (Fal-

kon). Nastêpnie dodawano po

100 µl odpowiednio rozcieñczo-

nych w po¿ywce preparatów (ka¿-

de stê¿enie do 3 do³ków). P³ytki

inkubowano w atmosferze 5%

CO

2

w temperaturze 37°C przez

72 godziny. Wynik proliferacji

komórek mierzono wed³ug meto-

dy izotopowej. Do do³ków, 20 go-

dzin przed zakoñczeniem hodowli, dodawano po 1 uCi

3

H tymidyny (Amersham, specyficzna aktywnoϾ 6,9 Ci/

mM). Komórki zbierano pó³automatycznym harweste-

rem na bibu³ê Whatman 934-AH. Radioaktywnoœæ ozna-

czono w p³ynnym scyncylacyjnym liczniku (Beckman

LS7500) liczb¹ impulsów na minutê (LI). Komórki sty-

mulowane fitohemaglutynin¹ 10 µg/ml (PHA „P” Sigma)

stanowi³y kontrolê dodatni¹, a próbki bez preparatów –

kontrolê ujemn¹.

Badanie wp³ywu preparatów grzybiczych

na transformacjê blastyczn¹ (TB) limfocytów

stymulowanych PHA

Limfocyty o gêstoœci 2×10

6

/ml zawieszano w po¿yw-

ce RPMI z dodatkiem 10% FCS, 2 mM glutaminy i 10

µg/ml gentamycyny rozlewano po 100 µl do p³askoden-

nych mikrop³ytek sk³adaj¹cych siê z 96 do³ków (Falkon).

Nastêpnie dodawano po 50 µl odpowiednio rozcieñczo-

nych w po¿ywce preparatów grzybiczych i 50 µl PHA

o stê¿eniu 20 µl/ml do 3 do³ków. Dalej postêpowano tak

samo, jak podczas badania TB. Proliferacjê limfocytów

oznaczano wed³ug metody MTT (11).

Test MTT. Metoda kolorymetryczna

s³u¿¹ca do oceny ¿ywotnoœci komórek

Do ka¿dego do³ka zawieraj¹cego limfocyty dodawa-

no po 10 µl MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphe-

nyl-tetrazolium bromide) o stê¿eniu 5 mg/ml, a po 3 go-

dzinach inkubacji (37°C, 5% CO

2

) dodawano p³yn lizu-

j¹cy o sk³adzie: 20% lauryl sulfate (SDS, Sigma) w 50%

N-N-dimethyl formamide (DMF, Sigma) rozcieñczony

w wodzie dejonizowanej z dodatkiem kwasu octowego.

P³yn lizuj¹cy rozpuszcza kryszta³ki formazanu wypro-

dukowanego z MTT przez ¿ywe komórki. Próbki po do-

daniu p³ynu lizuj¹cego inkubowano przez 20 godzin

w tych samych warunkach. Ekstynkcjê odczytywano

w czytniku Dynatech przy fali 550 nm (19).

Wyniki

Stymulacja transformacji blastycznej

przez ekstrakty acetonowe grzybni

T. mentagrophtes i T. rubrum

Wykazano, ¿e antygeny grzybicze w s³abym stopniu

indukuj¹ limfoproliferacjê, a indeksy transformacji bla-

stycznej s¹ o wiele ni¿sze ni¿ po stymulacji PHA. Eks-

trakty obydwu dermatofitów w stê¿eniu 100 i 50 µg/ml nie

stymuluj¹ transformacji blastycznej. Optymaln¹ dawk¹

T. rubrum stymuluj¹c¹ limfoproliferacjê jest 0,1 µg/ml

i 1 µg/ml, a indeksy transformacji wynosz¹, odpowiednio:

1,76 i 1,43. Trichophyton mentagrophytes jest najbardziej

aktywny w stê¿eniach 0,1-10 µg/ml (indeksy transforma-

cji wynosz¹ 3,6-2,8). W miarê wzrostu stê¿eñ obu anty-

genów, ich aktywnoœæ stymuluj¹ca TB zmniejsza siê

(tab. I).

Wp³yw antygenów T. rubrum

na transformacjê blastyczn¹

Wp³yw ekstraktu glikoloetylenowego grzybni (A)

i etylowego substancji uwalnianych do po¿ywki hodowla-

nej (B) T. rubrum na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

aktywowanych PHA badano u¿ywaj¹c stê¿eñ 1-500

µg/ml. Wykazano, ¿e obydwa ekstrakty hamuj¹ trans-

formacjê blastyczn¹ limfocytów. Stopieñ zahamowania

Tabela I: Transformacja blastyczna limfocytów pod wp³ywem ekstraktów acetonowych

grzybni T. rubrum i T. mentagrophytes wyra¿ona liczb¹ impulsów na minutê

(LI) i indeksem transformacji (IT)

Table I: Lymphocyte transformation induced by T. rubrum and T. mentagrophytes

mycelium extracts expressed as count per minute (LI) and transformation

index (IT)

Stê¿enie ekstraktu

Extract concentration

[µg/ml]

100

50

10

1

0,1

PHA

10 µg/ml

TB spontaniczna

Tb spontaneous

LI

IT

LI

IT

LI

IT

LI

IT

LI

IT

LI

IT

LI

Ekstrakt grzybni

Mycelium extract

T. rubrum

2898

0,86

2966

0,93

4078

1,16

4631

1,43

6291

1,76

35744

17,8

3245

Ekstrakt grzybni

Mycelium extract

T. mentagrophytes

2506

0,8

2920

1,1

9004

2,8

11592

3,6

9354

3,2

35744

18,0

3240

Podano wartoœæ œredni¹ z trzech doœwiadczeñ / Mean value from three asseys was stated

144

Anita Hryncewicz-GwóŸdŸ, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda

Mikol. Lek. 1998, 5 (3)

Tabela II: Hamowanie transformacji blastycznej (TB)

limfocytów zdrowych osób stymulowanych

PHA przez ekstrakt grzybni (A) T. rubrum

Table II: Inhibition of lymphoproliferation stimulated

by PHA in presence of mycelium (A) extract

of T. rubrum

Antygen i dawka [µg/ml]

Antigen and dose

[µg/ml]

A 500

A 100

A 10

A 1

PHA

TB spontaniczna

Tb spontaneous

WartoϾ ekstynkcji

Extinction value

274

288

310

339

372

274

% zahamowania TB

TB Inhibition %

94

84

61

32

Podano wartoœæ œredni¹ z trzech doœwiadczeñ

Mean value form three asseys was stated

Tabela III: Hamowanie transformacji blastycznej (TB)

limfocytów zdrowych osób stymulowanych PHA

przez ekstrakt (B) substancji uwalnianych przez

T. rubrum do pod³o¿a

Table III: Inhibition of lymphoproliferation stimulated by

PHA in presence of exoantigen (B) of T. rubrum

Antygen i dawka [µg/ml]

Antigen and dose

[µg/ml]

B 500

B 100

B 10

B 1

PHA 10

TB spontaniczna

Tb spontaneous

WartoϾ ekstynkcji

Extinction value

293

338

411

502

472

282

% zahamowania TB

TB Inhibition %

90

70

31

0

Podano wartoœæ œredni¹ z trzech doœwiadczeñ

Mean value form three asseys was stated

Tabela IV: Sk³ad chemiczny ekstraktu grzybni (A) i ekstraktu substancji wydzielanych do po¿ywki (B) T. rubrum

Table IV: Chemical constitution of mycelium (A) and exoantigen (B) extracts of T. rubrum

Preparat

Preparation

A

B

Cukier ca³kowity

a

[%]

Total sugar [%]

20

1

Bia³ko

b

[%]

Protein

b

[%]

24

47

WydajnoϾ [%]

Output [%]

0,92

c

1,9

d

a

oznaczany metod¹ wykrywaj¹c¹ cukry obojêtne za pomoc¹ fenol/kwas siarkowy / determined by a method detecting neutral sugars using phenol/sulphur acid

b

oznaczane wed³ug metody Lowry i wsp. / determined using Lowry et al. method

c

w mg preparatu z 100 mg grzybni / in mg of preparation out of 100 mg mycelium

d

w mg preparatu z 100 ml nads¹czu grzybni / in mg of preparation out of 100 ml mycelium supernatant

Tabela V: Wyniki analizy jakoœciowej i iloœciowej cukrów ekstraktu grzybni (A) i ekstraktu substancji wydzielanych do po¿ywki (B)

T. rubrum

Table V: Quantity and quality analysis of sugar in mycelium (A) and exoantigen (B) extracts of T. rubrum

Sk³adnik cukrowy*

Sugar constituent*

Ryboza

Ribose

Arabinoza

Arabinose

Ksyloza

Xylose

Mannoza

Mannose

Glukoza

Glucose

Galaktoza

Galactose

Glukozoamina

Glucoseamine

Galaktozoamina

Galactoseamine

Razem

Total

Czas retencji [min]

Retention time [min]

6,82

6,93

7,17

9,83

9,94

10,03

11,60

11,87

–

1,94

Œlad

Trace

9,94

2,96

6,67

0,49

0,06

22,01

1,20

0,47

–

1,52

3,14

1,15

0,71

0,31

8,50

IloϾ w preparacie [%]

Amount in preparation [%]

* sk³adniki cukrowe jako pochodne octanów alditoli cukrów oznaczane wed³ug metody chromatografii gazowo-cieczowej po³¹czonej ze spektrometri¹ masow¹

(GC-MS) / Sugar constituents as derivatives of sugar aldithol acetate determined with GC-MS method

– brak sk³adnika / no consitituent

A

B

Wp³yw antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

proliferacji aktywowanych PHA limfocytów zale¿a³

od stê¿enia wykorzystanych ekstraktów. Najsilniejsze

hamowanie stwierdzono, gdy stê¿enie wynosi³o 500

µg/ml. Ekstrakt substancji uwalnianej do pod³o¿a ha-

mowa³ limfoproliferacjê jeszcze w stê¿eniu 10 µg/ml,

ekstrakt grzybni natomiast nawet w stê¿eniu 1 µg/mI

(tab. II, III).

Okreœlenie sk³adu chemicznego

ekstraktów A i B i ich frakcji

W celu scharakteryzowania czynnika odpowiedzial-

nego za hamowanie limfoproliferacji przez ekstrakty

A i B, do dalszych badañ u¿yto ich frakcji. Oba ekstrakty

rozdzielono na frakcje wed³ug metody cieczowej chroma-

tografii wysokociœnieniowej (HPLC). Uzyskano po szeœæ

frakcji z ka¿dego preparatu (A1-A6 otrzymano z grzyb-

ni i B1-B6 – z substancji uwalnianej do pod³o¿a).

Ekstrakty wyjœciowe i ich frakcje poddano analizie

cukrowej (wed³ug metody kolorymetrycznej i chroma-

tografii gazowej po³¹czonej ze spektrometri¹ maso-

w¹) oraz okreœlono zawartoœæ bia³ka (wed³ug metody

Lowry’ego i wsp.). Stwierdzono, ¿e ekstrakt grzybni

zawiera podobne iloœci cukru i bia³ka, a przewa¿a-

j¹cym sk³adnikiem ekstraktu substancji uwalnianych

145

Tabela VI: Procentowa zawartoœæ bia³ka i cukru w po-

szczególnych frakcjach ekstraktu grzybni (A)

i ekstraktu substancji wydzielanych do po¿ywki (B)

Table VI: Protein and sugar constituents on fractions of

mycelium (A) and exoantigen (B) extracts

of T. rubrum [%]

Frakcje

Fractions

A1

A2

A3

A4

A5

A6

B1

B2

B3

B4

B5

B6

Bia³ko

Protein

0

17,87

1,02

Œlad /Trace

2,55

2,55

22,74

7,58

7,58

7,58

1,52

0,20

Tabela VII: Sk³ad cukrowy frakcji (A1-A6) otrzymanych z glikolowego ekstraktu grzybni T. rubrum

Table VII: Sugar constituents in mycelium fractions (A1-A6) of T. rubrum

A1

A2

A3

A4

A5

A6

Procentowa zawartoœæ w ekstrakcie grzybni cukrów

zidentyfikowanych w poszczególnych jego frakcjach

Percentual contents in mycelium extract of sugers identified in its individual fractions

Frakcje ekstraktu

Extract fractions

A

Arabinoza

Arabinose

0,06

–

–

–

–

–

Ksyloza

Xylose

–

–

–

–

0,02

–

Mannoza

Mannose

0,35

2,49

0,30

0,13

0,32

1,06

Glukoza

Glucose

0,41

4,16

2,80

0,10

0,21

1,23

Galaktoza

Galactose

0,27

3,70

0,41

0,19

0,50

1,44

Glukozoamina

Glucoseamine

–

6,26

0,36

0,62

0,72

2,78

Galaktozoamina

Galactoseamine

–

0,84

–

0,06

0,08

0,53

– brak sk³adnika / no constituent

Tabela VIII: Sk³ad cukrowy frakcji (B1-B6) otrzymanych z etanolowego ekstraktu substancji uwalnianych do po¿ywki T. rubrum

Table VIII: Sugar constituents in exoantigen fractions (B1-B6) of T. rubrum

B1

B2

B3

B4

B5

B6

Procentowa zawartoœæ w ekstrakcie substancji wydzielanych do po¿ywki cukrów

zidentyfikowanych w poszczególnych jego frakcjach

Percentual contents in extract of substances secreted to the medium

of sugars identified in its individual fractions

Frakcje ekstraktu

Extract fractions

B

Arabinoza

Arabinose

–

–

–

–

–

16

Ryboza +

Ramnoza

Ribose +

Ramnose

–

–

–

–

–

30

Mannoza

Mannose

0,07

0,03

0,01

0,008

0,0004

0,009

Glukoza

Glucose

0,31

0,18

0,02

0,09

0,01

0,02

Galaktoza

Galactose

0,15

0,06

0,02

0,01

–

0,01

Glukozoamina

Glucoseamine

0,18

0,11

0,05

0,02

–

0,02

Galaktozoamina

Galactoseamine

–

0,02

0,004

–

–

0,002

– brak sk³adnika / no constituent

Cukier

Sugar

1,03

10,03

3,5

0,41

1,03

3,71

4,6

2,30

0,40

0,66

0,10

0,40

146

Anita Hryncewicz-GwóŸdŸ, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda

Mikol. Lek. 1998, 5 (3)

do po¿ywki jest bia³ko (tab. IV). G³ównym sk³adni-

kiem cukrowym ekstraktu grzybni jest mannoza, a eks-

traktu substancji uwalnianych do po¿ywki – glukoza

(tab. V).

Analizuj¹c sk³ad cukrowy frakcji ekstraktu grzybni,

wykazano, ¿e dominuj¹cym sk³adnikiem poszczegól-

nych frakcji jest glukoza lub gIukozoamina. Ró¿nice

w rezultatach badañ sk³adu cukrowego ekstraktu

grzybni i jego frakcji mog¹ wynikaæ z adsorpcji nie-

których sk³adników wielkocz¹steczkowych, np. manna-

nu, na filtrach w kolumnach rozdzielaj¹cych oraz roz-

padu wiêkszych cz¹steczek i uwolnienia cukrów pro-

stych. Stwierdzono równie¿, ¿e g³ównym sk³adnikiem

cukrowym frakcji ekstraktu substancji uwalnianych do

po¿ywki, podobnie jak ekstraktu wyjœciowego, jest glu-

koza i glukozoamina (tab. VI-VIII).

Wp³yw frakcji ekstraktów

na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

aktywowanych PHA

Podczas wy¿ej opisanych doœwiadczeñ wykaza-

no, ¿e ekstrakty grzybni i substancji uwalnianych do

pod³o¿a T. rubrum wywo³uj¹ najwiêksze zahamowa-

nie transformacji blastycznej w stê¿eniu wynosz¹cym

500 µg/ml. Dlatego, prowadz¹c badania nad wp³y-

wem frakcji tych ekstraktów na TB, u¿yto stê¿eñ od-

powiadaj¹cych zawartoœci danej frakcji w 500 µg/ml

ekstraktu wyjœciowego.

Stwierdzono, ¿e frakcje obu ekstraktów (A i B)

w ró¿nym stopniu hamuj¹ transformacjê blastyczn¹ lim-

focytów stymulowanych PHA. Najsilniej hamuj¹co dzia-

³aj¹ frakcje A1 i A2 (75 i 70%). Doœæ znaczne hamowa-

nie obserwowano równie¿ w obecnoœci frakcji A3 i A6

(37 i 34%). Spoœród frakcji ekstraktu B najsilniej hamuj¹

TB frakcje B1, B2 i B3 (33, 41 i 38%). Pozosta³e frakcje

w mniejszym stopniu wp³ywaj¹ na odpowiedŸ limfocy-

tów stymulowanych PHA (13-27%) (tab. IX, X).

Omówienie

Komórkowa odpowiedŸ immunologiczna odgrywa

du¿¹ rolê w eliminacji czynnika patogennego w prze-

biegu dermatofitozy. W czasie infekcji grzybami antro-

pofilnymi, która cechuje siê przewlek³ym, nawrotowym

przebiegiem oraz s³abo rozwijaj¹cym siê stanem za-

palnym, podczas badañ in vivo, na podstawie póŸne-

go testu œródskórnego (DTH), obserwowano u wielu

pacjentów brak reaktywnoœci komórkowej na antyge-

ny dermatofitów, przy prawid³owej odpowiedzi na inne

antygeny niespecyficzne, jak tuberkulina i kandydyna

(8, 13-15, 21). Przyczyna s³abej selektywnej odpowie-

dzi komórkowej w dermatofitozach przewlek³ych nie

zosta³a do koñca wyjaœniona. Wyniki naszych badañ,

uzyskane na podstawie testu transformacji blastycz-

nej, wskazuj¹, ¿e T. rubrum jest s³abszym aktywato-

rem limfocytów ni¿ T. mentagrophytes. S³aba immuno-

gennoœæ dermatofitów antropofilnych mo¿e byæ zatem

przyczyn¹ rozwoju przewlek³ego i sk¹poobjawowego

przebiegu schorzenia. Doniesienia na temat badañ in

vitro reaktywnoœci komórkowej u chorych na przewle-

Tabela IX: Wp³yw frakcji (A1-A6) ekstraktu grzybni na trans-

formacjê blastyczn¹ (TB) limfocytów zdrowych

osób stymulowanych PHA

Table IX: Inhibition of lymphoproliferation stimulated by

PHA in presence of mycelium extract fractions

(A1-A6) of T. rubrum

Frakcje ekstraktów A zastosowano w stê¿eniach odpowiadaj¹cych zawarto-

œci danej frakcji w 500 µg/ml ekstraktu. Podano wartoœæ œredni¹ z trzech do-

œwiadczeñ

Fractions of A extracts were used in concentrations corresponding to the

contents of a given fraction in 500 mg/ml of extract. Mean value from three

asseys was stated

Antygen

Antigen

A 500 µg/ml

Frakcja A1

Fraction A1

Frakcja A2

Fraction A2

Frakcja A3

Fraction A3

Frakcja A4

Fraction A4

Frakcja A5

Fraction A5

Frakcja A6

Fraction A6

PHA

TB spontaniczna

Tb spontaneous

WartoϾ ekstynkcji

Extinction value

285

333

344

418

452

450

429

477

278

% zahamowania TB

TB Inhibition %

97

75

70

37

17

22

34

Tabela X: Wp³yw frakcji (B1-B6) ekstraktu substancji

uwalnianych do po¿ywki T. rubrum na transforma-

cjê blastyczn¹ (TB) limfocytów zdrowych osób

stymulowanych PHA

Table X: Inhibition of lymphoproliferation stimulated by PHA

in presence of exoantigen extract fractions (B1-B6)

of T. rubrum

Frakcje ekstraktów B zastosowano w stê¿eniach odpowiadaj¹cych zawarto-

œci danej frakcji w 500 µg/ml ekstraktu. Podano wartoœæ œredni¹ z 3 do-

œwiadczeñ

Fractions of B extracts were used in concentrations corresponding to the

contents of a given fraction in 500 mg/ml of extract. Mean value from 3 as-

seys was stated

Antygen

Antigen

B 500 µg/ml

Frakcja B1

Fraction B1

Frakcja B2

Fraction B2

Frakcja B3

Fraction B3

Frakcja B4

Fraction B4

Frakcja B5

Fraction B5

Frakcja B6

Fraction B6

PHA B 10 µg/ml

TB spontaniczna

Tb spontaneous

WartoϾ ekstynkcji

Extinction value

293

421

395

404

450

435

452

469

282

% zahamowania TB

TB Inhibition %

90

33

41

38

15

27

13

147

Wp³yw antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformacjê blastyczn¹ limfocytów

k³¹ dermatofitozê s¹ niejednoznaczne. Niektórzy auto-

rzy wykazali na podstawie testu transformacji bla-

stycznej os³abion¹ proliferacjê limfocytów pod wp³y-

wem antygenów grzybiczych, a nawet jej brak (8, 10).

Inni natomiast donosz¹ o prawid³owej proliferacji lim-

focytów pod wp³ywem antygenów dermatofitów u cho-

rych na przewlek³¹ grzybicê, równie¿ u pacjentów,

u których odczyn DTH jest ujemny (18, 22). Istnienie

czynników pochodzenia grzybiczego, które hamuj¹

procesy immunologiczne, mo¿e mieæ znaczenie w ogra-

niczeniu rozwijaj¹cej siê odpowiedzi komórkowej. Lokal-

ne oddzia³ywanie tych czynników u chorych na przewle-

k³¹ dermatofitozê, u których reaktywnoœæ limfocytów

krwi kr¹¿¹cej w teœcie TB jest prawid³owa, mog³oby ha-

mowaæ odpowiedŸ immunologiczn¹ w miejscu infekcji

i ograniczaæ mo¿liwoœæ eliminowania czynnika pato-

gennego z powierzchni skóry. W trakcie swoich badañ

McGregor, Blake i Grando stwierdzili, ¿e antygeny T.

rubrum oraz mannan wyizolowany z grzybni T. rubrum

w odpowiednich stê¿eniach hamuj¹ proliferacjê limfo-

cytów aktywowanych mitogenami (2, 7, 18). Wyniki

naszych badañ s¹ podobne. Ekstrakty T. rubrum uzy-

skane z grzybni i substancji wydzielanych do po¿ywki

dodane do stymulowanych PHA limfocytów zdrowych

osób hamuj¹ TB. Najsilniejsze hamowanie wywieraj¹

obydwa ekstrakty wyjœciowe w stê¿eniu wynosz¹cym

500 µg/ml (90 i 94% zahamowania TB). W mniejszych

stê¿eniach ekstrakt grzybni oddzia³uje silniej ni¿ eks-

trakt substancji uwalnianej do po¿ywki. Przy u¿yciu

100, 10 i 1 µg/ml zahamowanie wywo³ane przez eks-

trakt grzybni wynosi³o, odpowiednio: 84, 61 i 32%,

a przez ekstrakt substancji uwalnianych do po¿ywki –

70, 31 i 0%.

Ró¿nice w sile oddzia³ywania na procesy immuno-

logiczne mog¹ byæ zwi¹zane z budow¹ chemiczn¹ obu

badanych ekstraktów. Oznaczono ich sk³ad chemiczny

i stwierdzono, ¿e: ekstrakt grzybni zawiera du¿¹ iloœæ

cukru (20%) i podobn¹ iloœæ bia³ka (24%), a ekstrakt

substancji uwalnianej do po¿ywki sk³ada siê z przewa-

¿aj¹cej iloœci bia³ka (47%) i niewielkiej iloœci cukru

(8,5%). Silniejsze hamowanie TB wywo³ane przez eks-

trakt grzybni jest, byæ mo¿e, zwi¹zane z wiêksz¹ za-

wartoœci¹ cukrowców, których g³ównym sk³adnikiem

jest mannoza.

Zarówno ekstrakt grzybni, jak i substancji uwalnia-

nych do pod³o¿a rozdzielono wed³ug metody HPLC

i uzyskano po szeϾ frakcji. Oznaczono zawartoϾ bia-

³ek i cukrów we frakcjach oraz badano ich wp³yw na

TB. Jakoœciowy sk³ad cukrowy wszystkich frakcji jest

podobny. Dominuj¹ heksozy oraz wystêpuje znaczna

iloœæ glukozoaminy. Najsilniejsze dzia³anie hamuj¹ce

wywiera³y dwie frakcje ekstraktu grzybni: A1 (75%) i A2

(70%), co potwierdza wczeœniejsze wyniki o silniej-

szym hamowaniu TB przez ekstrakt grzybni ni¿ sub-

stancji uwalnianych do po¿ywki. Pozosta³e frakcje obu

ekstraktów obni¿a³y poziom TB s³abiej (13-41%).

Frakcja A1 sk³ada siê jedynie z cukru, a frakcja A2

ma du¿¹ zawartoœæ cukru i bia³ka. Byæ mo¿e, brak bia³-

ka w A1 i obecnoœæ najwiêkszej ze wszystkich frakcji

czêœci cukrowej w A2 warunkuje mo¿liwoœæ dzia³ania

hamuj¹cego cukru. W pozosta³ych frakcjach natomiast

stosunki iloœciowe bia³ka i cukru nie sprzyjaj¹ silnemu

oddzia³ywaniu na TB.

Wnioski

1. Antygeny T. rubrum s³abiej ni¿ T. mentagrophy-

tes stymuluj¹ transformacjê blastyczn¹ limfocytów.

2. Ekstrakty grzybni i substancji uwalnianych do

pod³o¿a przez T. rubrum oraz ich frakcje wp³ywaj¹ ha-

muj¹co na proliferacjê limfocytów stymulowanych PHA.

3. S³aba immunogennoœæ oraz w³aœciwoœci hamo-

wania procesów immunologicznych przez T. rubrum

mog¹ sprzyjaæ rozwojowi przewlek³ej dermatofitozy.

Piœmiennictwo

1. Aly R.: Dr Raza Aly o immunologii grzybic. Przegl. Mikol.,

1997, 1, 1-2.

2. Blake J.S., Dahl M.V., Herron M.J., Nelson R.D.: An immu-

noinhibitory cell wall glycoprotein (mannan) from Tricho-

phyton rubrum. J. Invest. Dermatol., 1991, 96, 657-661.

3. Boyum A.: Isolation of mononuclear cells and granulo-

cytes from human blood. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 28

(supl. 97), 77-89.

4. Dahl M.V., Grando S.A.: Chronic dermatophytosis: what

is special about Trichophyton rubrum? Adv. Dermatol.,

1994, 9, 97-109.

5. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Robers P.A.,

Smith F.: Colorimetric method for determination of su-

gars and related substances. Anal. Chem., 1956, 28,

350-356.

6. Garg A.P., Muler J.: Preparation of antigens from Tri-

chophyton mentagrophytes using a new semi-solid cul-

ture medium and their characterization by SDS-PAGE

and immunological techniques. Mycoses, 1992, 35,

349-355.

7. Grando S.A., Hostager B.S., Herron M.J., Dahl M.V.,

Nelson R.D.: Binding of Trichophyton rubrum mannan

to human monocytes in vitro. J. Invest. Dermatol., 1992,

98, 876-880.

8. Hanifin J.M., Ray L.F., Lobitz W.C.: Immunological reacti-

vity in dermatophytosis. Br. J. Dermatol., 1974, 90, 1-7.

9. Hann P., Raay-Helmer E.M.H., Boorsma D.M.: Diversity

of antigenic extracts from the dermatophyte Trichophyton

rubrum. Mykosen, 1986, 9, 427-433.

10. Helander I.: The lymphocyte transformation test in der-

matophytoses. Mykosen, 1978, 21, 71-80.

11. Hussain R.F., Nouri A.M.E., Oliver R.T.D.: A new ap-

proach for measurement of cytotoxicity using colorime-

tric assay. J. Immunol. Methods, 1993, 160, 89-96.

12. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: Acquired im-

munity to dermatophytes. Arch. Dermatol., 1974, 109,

840-848.

13. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: A clinical, my-

cologial, and immunological survey for dermatophyto-

sis. Arch. Dermatol., 1973, 108, 61-65.

14. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: Immunologic

susceptibility to chronic dermatophytosis. Arch. Derma-

tol., 1974, 110, 213-220.

15. Jones H.E., Reinhard J.H.: Model dermatophytosis in

naturaly infeceted subjects. Arch. Dermatol., 1974, 110,

369-374.

16. Jones H.E.: Immune response and host resistance of

humans to dermatophyte infection. J. Am. Acad. Derma-

tol., 1993, 28, S12-S18.

17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fowr A.L., Randall R.J.: Pro-

tein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol.

Chem., 1951, 193, 265-275.

148

Anita Hryncewicz-GwóŸdŸ, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda

Mikol. Lek. 1998, 5 (3)

18. McGregor J.M., Hamilton A.J., Hay R.J.: Possible mecha-

nism of immune modulation in chronic dermatophytoses

an in vitro study. Br. J. Dermatol., 1992, 127, 233-238.

19. Mosmann T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth

and cytotoxity assays. J. Immunol. Methods, 1983, 65,

55-63.

20. Sawardeker J.S., Slonker J.H., Jeanes A.R.: Quantitati-

ve determination of monosaccharides as their alditol

acetates by gas-liquid chromatography. Anal. Chem.,

1965, 37, 1602-1624.

21. Sorensen G.W., Jones H.E.: Immediate and delayed

hypersensitivity in chronic dermatophytosis. Arch. Der-

matol., 1976, 112, 40-42.

22. Svejgaard E.: Immunologic Investigations of Dermato-

phytes and Dermatophytosis. Semin. Dermatol., 1985,

4, 201-221.

23. Weitzman I., Summerbell R.C.: The dermatophytes.

Clin. Microbiol. Rev., 1995, 8, 240-259.

Adres do korespondencji:

Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii AM

ul. Cha³ubiñskiego 1

50-368 Wroc³aw

Praca wp³ynê³a do Redakcji: 9 czerwca 1998 r.

Zaakceptowano do druku: 26 czerwca 1998 r.