Współczesne metody badania enzymów:

•

Dichroizm kołowy:

•

Służy do badania struktury drugorzędowej białek

•

Większość cząsteczek jest asymetryczna – gdy absorbują światło, wykazują preferencje w
stosunku do absorpcji, w prawo lub w lewo, kołowo spolaryzowanego światła

•

Badania w podczerwieni:

•

Są stosowane do badania konformacji cząsteczek białek

•

Białka i kwasy nukleinowe wykazują wiele rodzajów molekularnych wibracji i oscylacji

•

Określone pozycje pasm podczerwieni odpowiadające wibracjom w szkielecie
polipeptydowym są czułe na konformacyjną formację cząsteczki

•

Widmo Ramana:

•

Służy do analizy jakościowej i ilościowej mieszanin i określania struktury cząsteczek

•

To rozpraszanie światła połączone ze zmianą jego częstości

•

Występują linie widma Ramana - ich liczba i położenie zależą od budowy cząsteczek
substancji rozpraszającej

•

Site-directed mutagenesis, deletional mutagenesis:

•

Manipulując sekwencją aminokwasową można zidentyfikować grupy chemiczne biorące
udział w wiązaniu ligandów i etapach katalizy

•

Jeśli np. interesująca nas seryna jest kodowana przez kodon TCT, to należy zmienić C na G
żeby uzyskać kodon cysteinowy TGT

•

NMR (spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego):

•

Umożliwia badania struktur przestrzennych białek i ich dynamiki w roztworze

•

Opiera się na zjawisku rezonansu między stanami spinowych poziomów energetycznych, a
zewnętrznym polem magnetycznym

•

Sposób oddziaływania spinów sąsiadujących ze sobą jąder daje informacje o strukturze
białek

•

Spektrometria mas:

•

Pozwala na analizę zjonizowanych form cząsteczek w fazie gazowej

•

Pomiar masy cząsteczkowej odbywa się przez wyznaczenie przyśpieszenia uzyskanego
przez jony w polu elektrycznym

Działanie enzymów:

•

Zwiększają szybkość reakcji 10

12

razy w porównaniu z reakcją niekatalizowaną

•

Wynika to z ustawienia obok siebie grup reaktywnych w miejscu aktywnym enzymu w taki sposób,
że ułatwiają etapy reakcji prowadzące do powstania produktu

Orbitale atomowe:

•

Wiązania chemiczne w cząsteczkach są pochodnymi wiązań między atomami, a ściślej – między
orbitalami poszczególnych atomów, których oddziaływania tworzą orbitale molekularne

•

Elektrony wypełniają te orbitale zgodnie z energią potencjalną przypisaną danemu orbitalowi –
orbitale o niższej energii zostają wypełnione najpierw, po nich następuje wypełnianie orbitali o
energii wyższej

•

Dla każdego z atomów pierwiastków biogennych elektrony na najwyższych poziomach
energetycznych orbitali s i p są zdolne do udziału w reakcjach chemicznych – są to elektrony
walencyjne

Orbitale molekularne:
Jeśli dwa atomy znajdą się w bliskiej odległości od siebie i jeśli ich orbitale walencyjne mają odpowiednią
energię i symetrię, to dwa walencyjne orbitale atomowe (każdy z jednego atomu) mogą połączyć się
(elektrony stają się wspólne dla obu jąder – tworzy się wiązanie), by utworzyć dwa orbitale molekularne
(wiążący σ i antywiążący σ

*

)

Orbital wiążący ma niższą energię niż oryginalne dwa orbitale atomowe, dlatego zajmowanie miejsca na tym
orbitalu promuje wiązanie między atomami w celu stabilizacji systemu (cząsteczki)
Orbital antywiążący ma wyższą energię niż oryginalne orbitale atomowe – destabilizacja cząsteczki

Orbitale zhybrydyzowane:

•

W atomach C, N i O orbitale 2s i 2p mają podobne wartości energii, co powoduje że mogą
oddziaływać tak, żeby utworzyć orbitale o charakterze mieszanym (sp)

•

Te orbitale hybrydowe pozwalają na utworzenie maksymalnej liczby wiązań jaką może utworzyć
atom, jednocześnie utrzymując największy dystans między wiązaniami, co pozwala na minimalizację
sił odpychających

•

Możliwe są trzy typy hybrydyzacji:

•

sp, gdy orbital 2s łączy się z orbitalem 2p (kąt między wiązaniami – 180°)

•

sp

2

, gdy orbital 2s łączy się z 2 orbitalami 2p – pozwala to na utworzenie trzech wiązań

leżących w płaszczyźnie trójkąta (kąt między wiązaniami – 120°)

•

sp

3

, gdy orbital 2s łączy się z 3 orbitalami 2p – daje to możliwość 4 wiązań σ, które leżą

wzdłuż wierzchołków czworościanu (kąt między wiązaniami – 109°)

Termodynamika reakcji chemicznych:

•

Pierwsza – zasada zachowania energii:

•

W każdym procesie całkowita ilość energii systemu wraz z otoczeniem pozostaje stała

•

Chociaż energia ani nie powstaje ani nie ulega zniszczeniu w danym procesie, to mogą
zachodzić transformacje jednej jej formy w inną (na przykład energia chemiczna może być
zamieniana w energię cieplną, radiacyjną, elektryczną lub mechaniczną)

•

Druga – we wszystkich procesach entropia (nieuporządkowanie) systemu wraz z otoczeniem
zwiększa się aż do osiągnięcia równowagi w punkcie w którym entropia jest największa w danych
warunkach ciśnienia i temperatury

•

Energia swobodna Gibbsa (G): ta forma energii jest zdolna do wykonania pracy w stałej
temperaturze i ciśnieniu, jakie są np. w komórce

Stan przejściowy reakcji chemicznych:

•

Taka forma molekularna, która ma stare wiązania i nowe częściowo uformowane – jest to stan, w
którym stare i nowe wiązania są jednocześnie rozrywane i tworzone

•

Reprezentuje barierę energetyczną, która musi zostać pokonana, żeby reakcja mogła przebiegać
dalej

Energia aktywacji:

•

Energia potrzebna do osiągnięcia stanu aktywacji:

•

Różnica energii swobodnej między stanem reagentów a stanem przejściowym

•

Wielkość energii aktywacji jest bezpośrednio powiązana z szybkością reakcji chemicznej – w miarę
jak rośnie energia aktywacji, szybkość reakcji spada wykładniczo

Strukturalne składniki enzymów:

•

Aminokwasy:

•

Hydrofilowość – Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg

•

Aromatyczność – His, Phe, Tyr, Trp

•

Zawierające siarkę – Cys, Met

•

Inne – Pro

•

Donorami protonów dla wiązania wodorowego są: Tyr, Ser, Thr, Trp, His, Cys, w niskim pH
łańcuchy boczne Glu i Asp

•

Akceptorami wiązania wodorowego mogą być: Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, His, Cys, Met

•

Oddziaływania elektrostatyczne - zachodzą między ujemnie i dodatnio naładowanymi aminokwasami
w białkach

•

Łańcuchy boczne aminokwasów mogą brać udział w reakcjach elektrofilowego i nukleofilowego
podstawienia w cząsteczkach substratu, co prowadzi do powstawania i rozkładu wiązań

•

Ustawienie grup kwasowych i zasadowych w pozycjach istotnych dla katalizy w centrum aktywnym
enzymu jest powszechnym mechanizmem wykorzystywanym przez enzymy dla ułatwienia szybkich
reakcji chemicznych z cząsteczkami wiążącymi się w centrum aktywnym

•

Modyfikacje łańcuchów bocznych mają krytyczne znaczenie dla mechanizmu katalitycznego
enzymów:

•

Tworzenie wiązań siarczkowych

•

Fosforylacje

•

Glikozylacje

•

Upakowanie łańcuchów bocznych aminokwasów w centrum aktywnym enzymu daje ogólny kształt i
rozmiar kieszeni, do czego przystosowuje się cząsteczka substratu

Jony metali (Fe, Cu, Ni, Co):

•

Domeny białek wiążących kwasy nukleinowe zawierają palce cynkowe, cynk jest centrum
strukturalnym insuliny, a kalmodulina wiąże jony wapnia

•

Metale biorą udział w reakcjach chemicznych katalizowanych przez enzym

•

Stanowią centra redox (hem-Fe, żelazo niehemowe, Cu)

Struktury białek:

•

Prawoskrętna helisa:

•

Jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między tlenem karbonylowym jednej reszty (i)
a protonem azotu

•

Wiązania wodorowe są możliwe z powodu ułożenia grup C=O i N–H wzdłuż osi helisy

•

Struktura β-kartki:

•

Przedstawia w pełni rozciągnięte łańcuchy polipeptydowe połączone wiązaniami
wodorowymi między sobą:

•

Ustawienie wiązań C=O i N–H pozwala na dokładanie łańcuchów polipeptydowych z lewej i
z prawej strony konstrukcji

•

Zwrot β:

•

Są to krótkie segmenty łańcuchów polipeptydowych, co pozwala na zmianę kierunku – obrót
wokół siebie

•

Zwroty β składają się z 4 reszt aminokwasowych w zwartej konfiguracji, w której
interamidowe wiązanie wodorowe tworzy się między pierwszą i czwartą resztą, co stabilizuje
strukturę

•

Odgrywa znaczącą rolę dla trójwymiarowej struktury białka

Stuktura trzeciorzędowa:

•

Fałdowanie takie zbliża odległe aminokwasy, co pozwala na utworzenie reaktywnych chemicznie
centrów, jak centra aktywne enzymów

•

Trzeciorzędowa struktura białka pozwala na tworzenie fałdów i kieszeni, które mieszczą małe
cząsteczki, i dyktuje ich formację przestrzenną

Centrum aktywne:

•

Wiązanie cząsteczki substratu

•

Doprowadzenie do bliskiego sąsiedztwa chemicznie reaktywnych grup, co ułatwi przemianę
substratów w produkty katalizowanej reakcji

•

Zajmuje tylko niewielką część molekuły

•

Aminokwasy i kofaktory w centrum aktywnym są precyzyjnie utrzymywane

•

W większości wypadków wiązanie substratu z enzymem zachodzi przy pomocy wiązań
niekowalencyjnych

•

Mieści się zwykle w bruzdach i szczelinach cząsteczki białka - jest ono praktycznie izolowane od
rozpuszczalnika, który zmniejszałby aktywność enzymatyczną enzymu

E + S -> ES -> ES* -> EP -> E + P

Reakcja enzymatyczna:

1. Enzym i substrat muszą się zetknąć (poprzez molekularne kolizje w roztworze), żeby utworzyć

kompleks ES

2. Po związaniu substratu, struktura centrum aktywnego ułatwia tworzenie stanu przejściowego
3. Kompleks ES++ może powrócić do struktury ES lub przekształcić się w EP
4. Jeśli został uformowany, kompleks EP musi ostatecznie zdysocjować prowadząc do uwolnienia

produktu i wolnego enzymu obecnego na starcie reakcji

•

Enzym nie zmienia równowagi między produktami i substratami

Działanie enzymów:

•

Wiele reakcji niekatalizowanych przebiega zbyt wolno, bo muszą pokonać dużą barierę
energetyczną, aby osiągnąć stan przejściowy

•

Jeśli jakimś sposobem bariera ta zostanie obniżona przez stabilizację stanu przejściowego to
reakcja będzie przebiegać szybciej

Mechanizmy działające w centrum aktywnym:

•

Siły wewnątrz centrum aktywnego enzymu mogą powodować ustawienie grup reaktywnych enzymu i
cząsteczki substratu we właściwej orientacji dla przebiegu reakcji

•

Wiązania wodorowe, elektrostatyczne, hydrofobowe i van der Vaalsa mogą odkształcać cząsteczkę
substratu w kierunku stanu przejściowego

•

Interakcje w miejscu aktywnym mogą powodować perturbacje orbitali molekularnych substratu,
przez ułożenie ich w jednej linii z grupami reaktywnymi

Entropia:

•

Jest głównie determinowana przez stopnie swobody ruchu rotacyjnego i ruchu przez przeniesienie

•

Jest miarą stopnia nieuporządkowania układu

Modele kompleksu enzym-substrat:

•

Model Koshlanda - oparty na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu ich w
produkty

•

Model zamka i klucza - enzym musi być dopasowany swoim kształtem do substratu, by móc
przekształcić go w produkt.

•

Model trzypunktowego przyłączenia - do specyficznego związania substratu przez enzym wystarczą
tylko trzy miejsca wiązania

•

Model indukowania molekularnych napięć - grupy boczne aminokwasów je tworzące podlegają
rearanżacjom przestrzennym, ściśle dopasowując swe pozycje do wiązanego substratu, co dopiero
umożliwia przeprowadzenie katalizy

Rodzaje enzymów:

1. Oksydoreduktazy – reakcje red-ox
2. Transferazy – przenoszenie grup chemicznych
3. Hydrolazy – hydrolityczne rozerwanie wiązań
4. Liazy – niehydrolityczne rozerwanie wiązań
5. Izomerazy – zmiany w ustawieniu atomów i cząsteczek
6. Ligazy – łączenie 2 lub więcej cząsteczek razem

Kataliza rozpadu wiązania peptydowego:

•

Proteazy serynowe - enzymy, które katalizują rozpad wiązań peptydowych w peptydach i białkach

•

Reszta serynowa działa jako główny nukleofil do ataku nukleofilowego na wiązanie peptydowe

•

Nukleofilowość seryny potęgują interakcje z łańcuchem bocznym histydyny, która oddziałuje z
łańcuchem bocznym asparaginy

•

Proteazy serynowe pełnią rolę nie tylko w procesach trawiennych, ale także w krzepnięciu krwi,
zapaleniu i szeroko pojętej odpowiedzi immunologicznej

•

Proteaza musi rozpoznać i związać region łańcucha polipeptydowego, w którym znajduje się
wiązanie do przecięcia

•

Trzy klasy proteaz serynowych:

•

Chymotrypsyn, subtylizyn i karboksypeptydaz II

•

Triada Ser, His, Asp jest konserwatywna

•

Mechanizm katalizy wspólny

Wahadło protonowe:

•

Ułatwia szybką regenerację aktywnej formy enzymu

•

Podstawowym składnikiem tego wahadła jest His 64

Kataliza nukleofilowa:

•

Tworzy się wiązanie kowalencyjne między nukleofilem enzymu i grupą na cząsteczce substratu w
stanie przejściowym reakcji

•

Jest czynnikiem, który najbardziej zwiększa reaktywność stanu przejściowego substratu w stosunku
do stanu podstawowego

•

Nukleofilowy atak reszty Ser na karbonyl substratu proteazy serynowej z utworzeniem pośrednika
enzym- acyl jest przykładem katalizy tego typu

Kataliza elektrofilowa:

•

Tworzą się pośredniki między kationowym elektrofilem enzymu i bogatą w elektrony częścią
cząsteczki substratu

•

Grupy elektrofilowe pochodzą od kofaktorów organicznych

Kinazy monofosforanów nukleozydów:

•

Enzymy te katalizują przeniesienie końcowej grupy fosforanowej z trójfosforanu nukleozydu ATP na
grupę fosforanową monofosforanu nukleozydu

•

Proces musi tak przebiegać żeby fosforan nie został przeniesiony na cząsteczkę wody; ATP zostałby
wtedy zhydrolizowany

•

Enzymy te są nie aktywne, gdy brak Mg2+ Mn2+

Rzędowość reakcji:

•

Mówi nam o tym jak na szybkość reakcji wpływają stężenia substratów w danych warunkach

•

Reakcje pierwszego rzędu to reakcje, których szybkość jest proporcjonalna do stężenia jednego
substratu

•

Reakcje drugiego rzędu to takie, których szybkość jest proporcjonalna do stężenia produktu
utworzonego przez dwa substraty lub kwadratu stężenia jednego substratu

•

Reakcje pseudo pierwszego rzędu - jeśli stężenie B jest bardzo wysokie , a stężenie A bardzo niskie
to taka reakcja wydaje się, że jest I-rzędu , ponieważ jej szybkość będzie prawie proporcjonalna do
stężenia A

•

Reakcje trzeciego rzędu są stosunkowo rzadkie, ich szybkość jest proporcjonalna do ilości produktu
powstałego z trzech stężeń substratów

•

Reakcje zerowego rzędu - niezależne od stężenia jakichkolwiek substratów

Czas połówkowy:

•

Mówi nam o tym w jakim czasie połowa substratu została przekształcona w produkt

•

W reakcjach I-rzędu czas połówkowy nie zależy od początkowego stężenie substratu

Kinetyka stanu stacjonarnego:

•

Przy niskim stężeniu substratu początkowa szybkość reakcji jest prawie proporcjonalna do stężenia
substratu

•

W miarę jak rośnie stężenia substratu, szybkość początkowa rośnie wolniej, co znaczy, że nie jest
już proporcjonalna do stężenia substratu, a jej rzędowość mieszana

•

Z dalszym wzrostem stężenia substratu reakcja staje się niezależna od jego stężenia i
asymptotycznie osiąga stała szybkość

•

Gdy stężenie substratu jest tak wysokie, że cały enzym jest związany w kompleksie z substratem
(nasycenie), wtedy szybkość początkowa staje się szybkością maksymalną

Równanie Michaelisa-Menten:

•

Wyraża matematyczną zależność między szybkością początkową reakcji enzymatycznej , stężenie
substratu i niektórymi cechami enzym

•

Vo=Vmax [S] /(Km +[S])

Stała Michaelisa-Menten:

•

Nie jest stałą wartością, zależy od rodzaju substratu, zmienia się wraz z pH i temperaturą

•

Jest ważna nie tylko dlatego, że opisuje matematycznie kinetykę enzymu, ale także dla ilościowego
pomiaru aktywności enzymów w tkankach i w trakcie oczyszczania białka

•

Jest też wskaźnikiem istnienia mechanizmów regulujących

•

Wskazuje na panujące w komórce stężenie substratu

•

Można porównywać enzymy z różnych organizmów albo z różnych tkanek tego samego organizmu

•

Można wskazać fizjologiczne inhibitory enzymu

•

Wskazuje na dopasowanie alternatywnego substratu do enzymu

•

Jest wielkością wyznaczoną eksperymentalnie, zdefiniowaną ilościowo jako stężenie substratu przy,
którym szybkość reakcji stanowi połowę szybkości maksymalnej

Stała substratowa:

•

Stała dysocjacji kompleksu ES

Wykres Eadie-Hofstee:

•

Wykres nie tylko, że dostarcza Vmax i Km ale ułatwia dostrzeżenie odchyleń od liniowości, czego
można nie zobaczyć na wykresie podwójnie odwrotnościowym Lineweavera-Burka

•

Pomnożenie obu stron równanie Lineweavera-Burka przez Vmax

Wpływ pH na aktywność enzymów:

•

III rzędowa struktura białka jest wrażliwa na pH, przy skrajnych pH następuje denaturacja enzymu

•

większość enzymów stabilna w pH około 7,4

•

Wpływ pH na szybkość katalizy, szybkość tworzenia produktu wskazuje na zaangażowanie grup
kwasowo-zasadowych w etap katalityczny substrat – produkt

Wpływ temperatury na aktywność enzymów:

•

Reakcje enzymatyczne tak jak reakcje chemiczne zwiększają swoja szybkość pod wpływem
temperatur

•

Enzymy są białkami i ulegają denaturyzacji pod wpływem wysokiej temperatury

Czynniki wpływające na szybkość reakcji:

•

temperatura

•

siła jonowa

•

stężenie anionów i kationów

•

pH

Wyrażanie aktywności enzymów:

•

V

0

i V

max

wyrażamy w molach/jednostkę czasu

•

K

m

w molach/litr czyli w M

•

k

cat

1/min, min

-1

s

-1

•

Jedna jednostka międzynarodowa (1U) to taka ilość enzymu, która katalizuje utworzenie 1 mola
produktu na minutę w określonych warunkach

•

Liczba obrotów (aktywność cząsteczkowa) to liczba moli substratu przemienionego w ciągu min
przez mol enzymu (jednostki/ mol enzymu) w warunkach optymalnych



Aktywność specyficzna enzymów:

•

Stężenie enzymu w nieoczyszczonym preparacie podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg
białka)

•

Aktywność specyficzna białka enzymatycznego rośnie w miarę tego jak coraz większą masę białka
enzymatyczngo stanowi nasz enzym, czyli w miarę jak postępuje oczyszczanie

Sposoby pomiaru aktywności enzymów:

•

Spektroskopia

•

Polarografia

•

Rozpad radioaktywny

•

Rozdział elektroforetyczny

•

Rozdział chromatograficzny

•

Immunoreaktywność

•

Można także mierzyć interesujący nas produkt przy pomocy reakcji sprzężonych, z których ta druga
jest łatwa do mierzenia

Przesunięcie Stokesa

:

•

Jest to przesunięcie maksimum pasma absorpcji względem pasma emisji dla tego samego stanu
wzbudzonego

•

Przesuniecie to może być wyrażone w długościach fali, nm, liczbach falowych lub hercach

Zastosowanie izotopów radioaktywnych:

•

Podstawowa strategia wykorzystania izotopów do pomiarów szybkości reakcji to inkorporacja w
strukturę substratu składnika radioaktywnego, który po katalizie można odzyskać w produkcie

•

Dzięki temu można mierzyć ilość radioaktywności we frakcjach substratu i produktu wnioskując z
tego o ubytku substratu i przyroście produktu.

Inne metody detekcj

i:

•

Metody immunologiczne: śledzenie proteolizy białek przy pomocy przeciwciał przeciw substratowi
białkowemu

•

Metody polarograficzne: wiele oksydaz wykorzystuje tlen cząsteczkowy do katalizy, mierzy się
ubytek O

2

z roztworu, w którym zachodzi kataliza przy pomocy elektrody tlenowej

Oczyszczanie białe

k:

•

Do separacji cząsteczek wykorzystuje się różnice w ich wielkości, masie, ładunku elektrycznym lub
powinowactwie do innych cząsteczek

•

Pierwszy krok do izolacji białek, wiec enzymów, polega na skutecznym uszkodzeniu komórek i
tkanek i oddzieleniu białek rozpuszczalnych od jąder, fragmentów ścian komórkowych i innych
struktur

•

Sedymentacja przy użyciu rotora o określonym kącie położenia probówek

•

Dializa:

•

Pozbawia białka substancji niskocząsteczkowych stosowanych na różnych etapach
oczyszczania

•

Stosowane są tu półprzepuszczalne pory maja pory wystarczająco duże, żeby mogły przez
nie przechodzić małe cząsteczki.

•

Białka i inne duże cząsteczki pozostają w worku dializacyjnym

Metody chromatograficzne:

•

Chromatografia jonowymienna:

•

Polega na wymianie zdolnych do wymiany jonów (+ lub -) jonitu na inne jony o tym samym
ładunku zawarte w roztworze

•

Jonity to substancje wielkocząsteczkowe, w których wyodrębnia się matryce w postaci
gąbczastej sieci przestrzennej oraz grupy chemicznie czynne, g. funkcyjne, kwasowe lub
zasadowe, połączone z jonami o znaku przeciwnym

•

Kationy wymieniają kationy, które oddysocjowują od anionów.

•

Aniony wymieniają aniony, które oddysocjowują od kationów.

•

Filtracja żelowa:

•

Do rozdzielenia składników mieszaniny o różnych cząsteczek można stosować struktury
porowate (żele), pełniące w procesie rozdziału rolę sita

•

Jony oraz substancje drobnocząsteczkowe dyfundują łatwo wgłąb ziaren żelu

•

Sefadeks jest odpowiednio chemicznie zmienionym dekstranem

•

Chromatografia powinowactwa:

•

Wykorzystuje powinowactwo białek do specyficznych grup chemicznych

•

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa HPLC:

•

Nośniki muszą być odporne na ściskanie

•

W wysokim ciśnieniu do 5000 psi można zastosować szybki przepływ

•

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych HIC:

•

Jest wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych

•

Białka adsorbują się na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów
białka z silnie hydrofobowymi grupami ligandów trwale umocowanych na powierzchni
nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego

Elektroforeza:

•

SDS-PAGE do rozdziału peptydów i białek na podstawie ich mas cząsteczkowych

•

SDS (detergent anionowy) nadaje im podobną gęstość ładunku (-)

•

Nałożona na żel mieszanina białek i peptydów migruje do anody w polu elektrycznym podłączonym
do żelu Migrację cząsteczek opóźnia spolimeryzowany żel

•

Stopień opóźnienia zależy od masy cząsteczkowej białek

Inhibitory:

•

Są narzędziem do badania mechanizmów reakcji enzymatycznych

•

Stanowią mechanizmy kontrolne w biologii

Inhibicja nieodwracalna:

•

Tworzenie kowalencyjnych wiązań między określonymi grupami enzymu i inhibitora

•

Inhibitory ciasno wiązane

Inhibicja odwracalna:

•

Współzawodnicza i niewspółzawodnicza

•

Inhibitory odwracalne wiążą się z enzymami szybko i szybko dysocjują

Stała inhibicji:

•

Mierząc obniżanie się szybkości początkowej reakcji wraz ze wzrostem stężenia inhibitora można
wyznaczyć K

i

•

Czynnik alfa odzwierciedla wpływ inhibitora na powinowactwo enzymu do substratu i wpływ
substratu na powinowactwo enzymu do inhibitora

•

Czynnik beta odzwierciedla zmianę szybkości tworzenia produktu jaką powoduje inhibitor

Inhibicja kompetycyjna:

•

Inhibitor wiąże się bezpośrednio do miejsca wiązania substratu lub na tyle blisko żeby zablokować to
miejsce

•

Inhibitor kompetycyjny musi mieć strukturalne podobieństwo do substratu

•

Zwiększenie stężenia substratu powoduje zmniejszenie inhibicji na skutek współzawodnictwa
inhibitora i substratu o miejsce wiązania

Inhibicja niekompetycyjna:

•

Inhibitor tego typu wiąże się z enzymem w miejscu innym niż to wiążące substrat i hamuje reakcję
przez jeden z wielu różnych mechanizmów

•

Zwiększenie stężenia substratu nie zmniejsza stopnia inhibicji, bo ligandy nie współzawodniczą o to samo
miejsce wiązania

Inhibicja akompetycyjna:

•

Inhibitor akompetycyjny wiąże się w miejscu innym niż miejsce wiążące substrat, ale raczej do kompleksu
enzym-substrat niż do wolnego enzymu

Inhibitory

oparte na mechanizmie reakcji:

•

Inhibitory wywołujące samobójstwo enzymu

•

Inhibitor wiąże się do enzymu jak substrat, co początkowo prowadzi do normalnego mechanizmu katalitycznego

•

Tworzy się aktywny intermedia, który hamuje enzym przez modyfikację kowalencyjną

•

Kowalencyjnie zmodyfikowana grupa enzymu jest aktywna katalitycznie, na co wskazuje fakt, że enzym
uczestniczy we własnej nieodwracalnej inhibicji.

Penicylina:

•

Jest pierwszym odkrytym antybiotykiem

•

Penicylina blokuje ostatni etap biosyntezy ścian bakteryjnych, reakcję tworzenia wiązań poprzecznych między
różnymi łańcuchami peptydoglikanu

I nhibicj

a

ciasno związan

a:

•

Wiążą się z enzymem z tak wysokim powinowactwem, że wiązanie inhibitora przez enzym w istotny sposób
zmienia stężenie wolnego inhibitora

•

W bardzo wysokim stężeniu substratu wykres obniża się, a krzywe w różnych stężeniach inhibitora zbiegają się
na osi y

Inhibitor powoli wiązany:

•

Powstawanie produktu w reakcji hamowanej inhibitorem powoli wiązanym nie przebiega liniowo

•

W czasie preinkubacji enzymu z inhibitorem ustala się między nimi równowaga i dodanie substratu ją zaburza

Aktywność enzymów regulują:

•

Inhibitory i aktywatory

•

Oddziaływania allosteryczne - kontrola aktywności enzymu za pomocą substratu

•

Wiązanie białek stymulujących i hamujących

•

Odwracalne modyfikacje kowalencyjne – np. fosforylację

•

Aktywacja proteolityczna (proenzym)

•

Regulacja syntezy i rozkładu enzymu

Hemoglobina i mioglobina:

•

Hemoglobina wykorzystuje 90% swych możliwości przenoszenia tlenu, a mioglobina w podobnych warunkach
tylko 7% potencjału

•

Cząsteczka hemoglobiny jest zbudowana z czterech łańcuchów polipeptydowych, a mioglobiny z jednego

•

Hemoglobina swoją efektywność zawdzięcza oddziaływaniom między łańcuchami, które powodują, że
związanie tlenu w swoistym miejscu jednego łańcucha zwiększa prawdopodobieństwo, że pozostałe łańcuchy
zwiążą tlen również (kooperatywne wiązanie ligandów)

•

Hemoglobina składa się z dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów β. Białko funkcjonuje jako para dimerów αβ.

•

Cząsteczki w stanie R (relaxed) mają większe powinowactwo do tlenu niż w stanie T (tense) - cząsteczki
przechodzą ze stanu T do R w miarę wiązania cząstek tlenu

•

W modelu sekwencyjnym związanie ligandu do jednego miejsca w układzie zwiększa możliwość związania w
miejscach sąsiednich bez uruchamiania pełnego przekształcania stanu T do stanu R - związanie ligandu
zmienia konformację podjednostki, do której się związał

•

Zerwanie wiązań między Hb i 2,3 BPG powoduje przejście stanu T w stan R

•

Obecność CO2 zmniejsza powinowactwo Hb do tlenu w stopniu wykraczającym poza wpływ pH

Hem – grupa prostetyczna hemoglobiny:

•

Zdolność hemoglobiny i mioglobiny do wiązania tlenu zależy od hemu, grupy prostetycznej,
zawierającej atom żelaza

•

Związaniu tlenu z żelazem w hemie towarzyszy częściowe przeniesienie elektronów na tlen

W

pływ p

H

na powinowactwo

H

b do tlenu:

•

Powinowactwo Hb do tlenu zmniejsza się wraz z obniżaniem pH z 7,4 do 7,2

Wykres Hilla:

•

Współczynnik Hilla jest miarą kooperatywności wiązania tlenu

Efekt Bohra:

•

Zjawisko występujące w fizjologii, polegające na zmniejszaniu powinowactwa hemoglobiny do tlenu
w warunkach obniżonego pH

•

Powoduje to, że tlen jest łatwiej oddawany przez hemoglobinę (dysocjacja) tlenu