Katedra Mikrobiologii

Uniwersytet Gda

ń

ski

Instrukcja do

ć

wicze

ń

z immunologii

dla studentów II roku Biologii studiów
stacjonarnych

Anna-Karina Kaczorowska

Instrukcje do

ć

wicze

ń

z immunologii

Katedra Mikrobiologii UG

Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.

-2-

Ć

WICZENIE 1

(V tydzie

ń

semestru letniego)

Reakcje serologiczne w diagnostyce bakterii z rodzajów
Staphylococcus i Streptococcus

Jedn

ą

z podstawowych umiej

ę

tno

ś

ci ka

ż

dego mikrobiologa jest zdolno

ść

do szybkiej identyfikacji bakterii

wyizolowanych z ich naturalnego

ś

rodowiska. Diagnostyka mikrobiologiczna w pierwszym rz

ę

dzie zakłada

wyodr

ę

bnienie drobnoustroju w postaci czystej kultury. Potrzebna jest do tego umiej

ę

tno

ść

wykonywania

prawidłowego posiewu izolacyjnego. Obserwacje morfologii pojedynczych kolonii, techniki barwienia bakterii,
testy biochemiczne, oporno

ść

na antybiotyki oraz reakcje serologiczne pozwalaj

ą

na szybk

ą

identyfikacj

ę

wyizolowanego mikroorganizmu.

Instrukcje do

ć

wicze

ń

z immunologii

Katedra Mikrobiologii UG

Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.

-3-

Na dzisiejszych zaj

ę

ciach przedstawione zostan

ą

zasady identyfikacji bakterii z rodzajów Staphylococcus i

Streptococcus, w oparciu o pewne cechy biochemiczne oraz obecno

ść

charakterystycznych antygenów.

Ka

ż

da para studentów otrzyma płytk

ę

z hodowl

ą

bakteryjn

ą

. Jedynie prowadz

ą

cy b

ę

dzie wiedział, czy jest to

hodowla gronkowców czy paciorkowców. Zadanie polega na zidentyfikowaniu bakterii. Schemat przebiegu
poszczególnych etapów procesu identyfikacji bakterii podano na rys. 1.

Pierwszym krokiem b

ę

dzie przeprowadzenie barwienia metod

ą

Grama i okre

ś

lenie na podstawie testu na

katalaz

ę

, czy Wasze bakterie wytwarzaj

ą

ten enzym. Dalsza identyfikacja bakterii b

ę

dzie polegała

przeprowadzeniu odpowiedniego testu aglutynacji lateksowej i okre

ś

leniu wła

ś

ciwo

ś

ci antygenowych bakterii.

Do

ś

wiadczenia wykonujemy w parach.

Do

ś

wiadczenie 1.1

Barwienie metod

ą

Grama bakterii z podło

ż

a stałego

1)

Nanie

ś

bakterie na odtłuszczone szkiełko podstawowe

W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podło

ż

ach stałych nale

ż

y materiał pobra

ć

jałow

ą

ez

ą

(czyli opalon

ą

w

płomieniu palnika), a nast

ę

pnie zawiesi

ć

bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe. W przypadku

wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanie

ść

na szkiełko kropl

ę

hodowli lub pobra

ć

odrobin

ę

bakterii jałow

ą

ez

ą

i

rozprowadzi

ć

zawiesin

ę

na powierzchni szkiełka). Zabiegi te maj

ą

na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt g

ę

stej zawiesiny.

2)

Po wysuszeniu, utrwal preparat przez przeci

ą

gniecie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika.

Nale

ż

y uwa

ż

a

ć

, by nie trwało to zbyt długo.

3)

Na utrwalone bakterie nakropl fiolet krystaliczny w ten sposób, aby pokrył on powierzchni

ę

, na któr

ą

naniesiono bakterie. Barwnik pozostawi

ć

na 2 minuty. Po tym czasie zmy

ć

fiolet wod

ą

destylowan

ą

.

4)

Nanie

ś

płyn Lugola na 1 minut

ę

. Płyn nale

ż

y obficie spłuka

ć

, najpierw alkoholem etylowym, a pó

ź

niej

wod

ą

destylowan

ą

5)

Nanie

ś

na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40 sekund. Po tym czasie spłucz szkiełko wod

ą

destylowan

ą

i wysusz preparat.

6)

Przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu nanie

ś

na szkiełko kropl

ę

olejku immersyjnego.

Ogl

ą

daj u

ż

ywaj

ą

c obiektywu daj

ą

cego stukrotne powi

ę

kszenie.

Do

ś

wiadczenie 1.2

Test na obecno

ść

katalazy

1) Na szkiełko podstawowe nanie

ś

ez

ą

kropl

ę

jałowego roztworu soli fizjologicznej (0,85%
NaCl) i równomiernie zawie

ś

w nim niewielk

ą

ilo

ść

masy bakteryjnej pobranej z podło

ż

a

stałego.

2) Do otrzymanej zawiesiny bakteryjnej dodaj

kilka kropli wody utlenionej (3% r-r H

2

O

2

).

Obserwuj preparat (gołym okiem).

Pojawienie si

ę

piany (b

ą

belków)

w preparacie

ś

wiadczy o obecno

ś

ci katalazy

(wynik dodatni).

Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, wyst

ę

puje

u niemal wszystkich organizmów oddychaj

ą

cych

tlenowo.

szczepy katalazo-dodatnie: rodzaj

Staphylococcus, Enterobacter, Pseudomonas,
Citrobacter, Escherichia, Klebsiella,

szczepy katalazo-ujemne: rodzaj

Enterococcus, Streptococcus, Aerococcus,
Lactococcus oraz wi

ę

kszo

ść

bakterii

beztlenowych (jeden znany wyj

ą

tek)

Instrukcje do

ć

wicze

ń

z immunologii

Katedra Mikrobiologii UG

Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.

-4-

→

Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecno

ść

skupie

ń

Gram-dodatnich ziarniaków

oraz uzyskali dodatni wynik w te

ś

cie na katalaz

ę

wykonuj

ą

t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u

ż

y c i u z e s t a w u

M i c r o g e n S t a p h firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania). Test ten słu

ż

y do wykrywania na

drodze reakcji serologicznej obecno

ś

ci białka A oraz czynnika koaguluj

ą

cego.

→

Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecno

ść

Gram-dodatnich bakterii w postaci

ła

ń

cuszków oraz uzyskali ujemny wynik w te

ś

cie na katalaz

ę

wykonuj

ą

t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u

ż

y c i u

z e s t a w u M i c r o g e n S t r e p firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania).

Do

ś

wiadczenie 1.3a

Identyfikacja szczepów Staphylococcus aureus - wykrywanie obecno

ś

ci czynnika

koaguluj

ą

cego i białka A przy pomocy testu aglutynacji Microgen Staph

W te

ś

cie Microgen Staph cz

ą

steczki lateksu opłaszczone s

ą

króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec czynnika koaguluj

ą

cego oraz

białka A unikatowego dla bakterii Staphylococcus ureus

1) Temperatur

ę

odczynników z zestawu do aglutynacji

Microgen Staph (Emapol) nale

ż

y doprowadzi

ć

do

temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane
s

ą

w temp. 4°C.

2) Na pole testowe nakropl roztwór przeciwciał swoistych

wobec białek wytwarzanych przez bakterie gronkowca
złocistego: białka A oraz czynnika koaguluj

ą

cego

osocze. Obok nanie

ś

ez

ą

niewielk

ą

obj

ę

to

ść

roztworu

soli fizjologicznej.

3) W roztworze soli zawie

ś

niewielk

ą

ilo

ść

masy

bakteryjnej (4-5 kolonii bakterii pobranych z podło

ż

a

stałego).

4) Obydwie krople wymieszaj ez

ą

(za ka

ż

dym razem ez

ę

nale

ż

y wy

ż

arzy

ć

i schłodzi

ć

) i obserwuj, delikatnie

kołysz

ą

c płytk

ą

.

Odczyt: Obecno

ść

kłaczków (widocznych

gołym okiem)

ś

wiadczy o zaj

ś

ciu aglutynacji.

W przypadku braku aglutynacji obserwuje si

ę

jednolit

ą

mieszanin

ę

o mlecznym zabarwieniu.

Białko A i czynnik koaguluj

ą

cy osocze

(CF) s

ą

jednymi z wielu czynników

wirulencji gronkowca złocistego.

Białko (SpA) wi

ąż

e si

ę

z fragmentem Fc

przeciwciał IgG uniemo

ż

liwiaj

ą

c tym

samym wi

ą

zanie si

ę

tych przeciwciał z

receptorami Fc

γ

R obecnymi na

powierzchni komórek

ż

ernych. Chroni to

bakterie przed fagocytoz

ą

.

Czynnik koaguluj

ą

cy osocze (CF) ułatwia

gronkowcom kolonizacj

ę

gospodarza,

swoj

ą

nazw

ę

zawdzi

ę

cza zdolno

ś

ci do

koagulacji osocza. Zwi

ą

zany jest z

obecno

ś

ci

ą

dwóch niezale

ż

nych białek -

adhezyn ClfA i ClfB, które s

ą

zakotwiczone w

ś

cianie bakterii. ClfA

wi

ąż

e si

ę

z fibrynogenem, ClfB wi

ąż

e poza

fibrynogenem tak

ż

e cytokeratyn

ę

10.

Instrukcje do

ć

wicze

ń

z immunologii

Katedra Mikrobiologii UG

Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.

-5-

Test aglutynacji Microgen Staph

Dodatni: Staphylococcus aureus

Ujemny: gronkowce koagulazo-ujemne:

Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus

Do

ś

wiadczenie 1.3b

Serotypowanie paciorkowców nale

żą

cych do grup A, B lub D

przy pomocy testu aglutynacji Microgen Strep

W te

ś

cie Microgen Strep cz

ą

steczki lateksu opłaszczone s

ą

króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec antygenów paciorkowców grup

A, B, C, D, F, G.

Kolonie paciorkowców pobrane ez

ą

z płytki inkubowane s

ą

w roztworze enzymu pochodz

ą

cego ekstrahuj

ą

cego antygeny izolowanego z

promieniowców Streptomyces globisporus. Ekstrakt anygenowy mo

ż

e by

ć

równie

ż

otrzymywany przez traktowanie bakterii takimi

zwi

ą

zkami jak azotyn sodu i kwas octowy, kwas hydrochlorowy, kwas azotowy czy formamid. Wyekstrahowane antygeny s

ą

nast

ę

pnie

testowane na płytce przy u

ż

yciu 6 opłaszczonych przeciwciałami cz

ą

steczek reagentów lateksowych (ka

ż

dy swoisty wobec jednej z grup

A, B, C, D, F lub G paciorkowców).

1) Temperatur

ę

odczynników z zestawu do aglutynacji Microgen Strep (Emapol) nale

ż

y doprowadzi

ć

do

temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane s

ą

w temp. 4°C.

2) Do próbówki Eppendorfa przenie

ś

0,4 ml roztworu zawieraj

ą

cego substancje ekstrahuj

ą

ce antygeny

paciorkowcowe (odczynnik M47x).

3) W roztworze zawie

ś

4-5 kolonii bakterii pobranych z podło

ż

a stałego. Uzyskan

ą

mieszanin

ę

inkubuj w

ła

ź

ni wodnej w temp. 37°C przez 5 min. Po tym czasie w strz

ąś

nij zawarto

ść

próbówki.

4) Na ka

ż

de pole czarnej płytki pipet

ą

automatyczn

ą

nanie

ś

po 1 kropli inkubowanej mieszaniny (ok. 10

µ

l).

Obok, przy pomocy kroplomierza, nanie

ś

zawiesin

ę

cz

ą

steczek lateksowych opłaszczonych

przeciwciałami swoistymi wobec okre

ś

lonego antygenu grupowego paciorkowców.

5) Obydwie krople wymieszaj ez

ą

(za ka

ż

dym razem ez

ę

nale

ż

y wy

ż

arzy

ć

i schłodzi

ć

) i obserwuj, delikatnie

kołysz

ą

c płytk

ą

.

Odczyt: Obecno

ść

kłaczków (widocznych gołym

okiem)

ś

wiadczy o zaj

ś

ciu aglutynacji.

W przypadku braku aglutynacji obserwuje si

ę

jednolit

ą

mieszanin

ę

o mlecznym zabarwieniu.

Bakterie wykorzystane w do

ś

wiadczeniach:

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus
pyogenes, Enterococcus (Streptococcus) faecalis, S. agalactiae.

Stosowane skróty:

SpA – S. aureus protein A
CF – clumping factor

Grupa serologiczna

Przedstawiciele

paciorkowce grupy A

S. pyogenes

paciorkowce grupy B

S. agalactiae

paciorkowce grupy C

-

paciorkowce grupy D

Enterococcus
(Streptococcus) faecalis,
Enterococcus faecium

paciorkowce grupy F

-

paciorkowce grupy G

-

System klasyfikacji paciorkowców w oparciu
o ich wła

ś

ciwo

ś

ci antygenowe zaproponowała

w 1933 r. Rebecca Lancefield. Na podstawie
reakcji serologicznej bakterii paciorkowców
z odpowiedni

ą

surowic

ą

grupow

ą

oznacza si

ę

przynale

ż

no

ść

do jednej z grup serologicznych

(od A do V).

O przynale

ż

no

ś

ci paciorkowców do grupy

A, B, C, F, G decyduje budowa
polisacharydów wchodz

ą

cych w skład

ś

ciany bakteryjnej paciorkowców.

O przynale

ż

no

ś

ci paciorkowców do grupy D

decyduje struktura kwasów
lipotejchojowych.