Konstrukcja wektora plazmidowego

DNA do klonowania genów

i/lub wektora plazmidowego

do sekrecji w bakteriach

mlekowych

Promotor: doc. dr hab. Jacek Bardowski, IBB
Promotor: dr hab. Edward Darżynkiewicz, prof. nadzw. UW

Łukasz Tranda

Co to jest plazmid?

Charakteryzacja bakterii fermentacji mlekowej.

Dlaczego warto skonstruować własny wektor?

Jak wygląda wektror plazmidowy?

Co to jest plazmid?

Plazmidy są to autonomiczne, pozachromosalne elementy

genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych

i niektórych eukariotów. Charakterystyczną ich cechą jest:

fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego

utrzymywania i replikowania się w komórce.

Plazmid nie koduje funkcji, które byłyby konieczne do jej życia.

Zwiększa natomiast różnorodność zajmowanych środowisk.

Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą

rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych komórek, w których

się znajdują.

Cząsteczki są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte,
koliste i superzwinięte. U pewnych bakterii i drożdży
stwierdzono również plazmidy liniowe.

Struktura przestrzenna plazmidu:

Wielkość:

plazmid

2-100 kb

i większe

chromosom

1,8 – 2,5 Mb

Replikacja plazmidów:

Replikacja plazmidu odbywa się niezależnie
od replikacji chromosomu komórki. Uznaje się je
za pasożyty wewnątrzkomórkowe, które nadają komórce
korzystny, w specyficznych warunkach, fenotyp.

Replikację możemy podzielić na:

Horyzontalną czyli poziomą;

Wertykalną czyli pionową;

Małe cząsteczki korzystają z systemu replikacyjnego gospodarza

i jedynie potrzebują fragmentu zawierającego geny replikacji (rep).
Jest to miejsce przyłączania się polimerazy DNA i wszystkich
elementów potrzebnych do replikacji. Podczas podziału komórki małe
fragmenty są rozdzielane losowo wraz z podziałem cytoplazmy.

Replikacja Pionowa:

dotyczy przekazania genów w obrębie tego samego gatunku:

Duże plazmidy, mogą nieść geny, kodujące potrzebne składniki

do replikacji. Podczas podziału komórki, po wcześniejszym powieleniu
się plazmidów, są one rozdzielane jak chromosom, dzięki powiązaniu się
z błoną poprzez mechanizm segregacji.

Istnieją również plazmidy mogące integrować do chromosomu

bakterii i ich replikacja zachodzi podczas powielania chromosomu.

Replikacja Pozioma:
dotyczy przekazania genów pomiędzy różnymi gatunkami:

Koniugacja to mechanizm przenoszenia marteriału

genetycznego z komórki do komórki, z udziłem plazmidu.
Komórka zwierająca plazmid koniugacyjny (F+, płodna)
tworzy pary koniugacyjne z komórkami nie zawierającymi
takiego plazmidu (F-, niepłodna). Wytwarzając pilus, mostek
łączący dwie komórki, który kurczy się powodując zbliżenie się
koniugujących komórek. Dzięki takiemu połączeniu
przenoszony jest DNA od dawcy F+ do biorcy F-. Geny
tra niesione przez plazmid F zawierają pełną informację
dotyczącą procesu koniugacji.

Transfer genów bakteryjnych z jednej komórki do drugiej przez

pakowanie ich w DNA faga. Tego typu przekaz genów nazywamy
transdukcją.

Komórki mogą pobierać nowe geny przez pobranie nagiego

DNA z otaczającego podłoża. Ten proces nazywamy transformacją.
Zdolność komórki do pobrania DNA zależy od jej szczególnego stanu,
który nazywamy kompetencją.
Przykładem jest elektroporacja, która jest sztucznym procesem
wstrzelanie plazmidu do komórki. Swobodne plazmidy wraz
z komórkami mającymi przyjąć DNA umieszczamy w impulsie
pola elektrycznego. W wyniku przepływu prądu powstają dziury
w ścianie komórkowej i plazmid wnika do komórki.

Krótka charakterystyka bakterii fermentacji mlekowej:

gram dodatnie;

fermentacja cukrów do kwasu mlekowego;
obniżaanie pH środowiska do wartości 4,5-3,5;

Fakultatywne życie beztlenowe;

optymalna temperatura wynosi 30st C lub 37-45st C;

czas generacji wynosi od 30 do 60 minut;

Posiadanie statusu GRAS;

ważne w biotechnologii, stosowane w przemyśle rolno-spożywczym;

wykorzystywanie w parafarmacji;

zapobiegają niektórym schorzenią (np. alergia);

komórki mogą być pałeczkowate lub ziarniaki;

Lactobacillus delbrueckii

Streptococcus thermophilus

Lactococcus lactis

Lactobacillus casei

Bifidobacterium longum

Leuconostoc mesenteroides

Wykorzystanie bakterii mlekowych

jako model badawczy i aplikacyjny:

Konstrukcja wektorów szczepionkowych w bakteriach

jako adiowanty.

Odgrywają one rolę w immunostymulacji układu

odpornościowego;

Jako GMO (genetycznie modyfikowane) produkują antygen

i stymulują odporność;

Jako probiotyki w hodowli zwierząt, którym

nie będzie można aplikować antybiotyków;

Zastosowanie probiotyków jest obecnie bardzo ograniczone ;

Biotechnologia w produkcji rolno-spożywczej;

Dlaczego warto się zająć konstrukcją

własnych wektorów plazmidowych?

Dokonywanie zmian w bakteriach to pewne narzędzie do celów
badawczych, ale również aplikacyjnych. W późniejszym okresie
korzystanie z tych plazmidów jest bezproblemowe.
Posiadając własny obiekt badawczy znika kwestia patentu.
Plazmidy bakteryjne na bazie, których będziemy
konstruować wektory będą pochodzić z własnej kolekcji
IBB lub zostaną wizolowane ze szczepów naturlnych, na które
nikt nie posiada patentu.

Typy genów obecnych w plazmidach:

Pierwsze są niezbędne do funkcjonowania jako niezależny

replikon, występujący na wszystkich plazmidach. Są to geny
niezbędne do replikacji i utrzymania plazmidu w komórce
nazywane genami rep.

Plazmidy zawierające tylko pierwszy typ genów nie będą

wyróżniały komórek bakteryjnych, które nazwano kryptycznymi.
Ta sama nazwa odnosi się do plazmidów, których funkcji
jeszcze nie znamy.

Drugim typem są geny, stanowiące dodatkowe wyposażenie w

plazmidzie. Odpowiadają one za różnorodność fenotypów

kodowanych przez plazmidy:

Oporność na antybiotyki;
Oporność na jony metali ciężkich;
Produkcja bakteriocyn;

Biodegradacja toksycznych związków organicznych;

Cechy związane z patogennością bakterii wobec człowieka i zwierząt;

Interakcje bakterii z komórkami roślinnymi;

Efekt ochrony przed UV; itp.

Przetwarzanie substancji organicznych

Odporność na wysoką temperaturę;

Pozwalające żyć w nietypowym pH środowiska;

Podstawowe geny, jakie powinien posiadać

plazmid do klonowania:

Geny rep, który powinien

posiadać każdy plazmid

Gen oporności na antybiotyk,

aby można było identyfikować
bakterie zawierające ten plazmid,

Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen,

który ma zostać sklonowany.

np. tet.

rep

MCS

tra

Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji.

np. tet.

MCS

rep

Geny, jakie powinien posiadać

wektor plazmidowy do sekrecji:

Geny rep, który powinien

posiadać każdy plazmid

Gen oporności na antybiotyk,

aby można było
identyfikować bakterie
zawierające ten plazmid

Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen,

który koduje białko przeznaczone
do sekrecji

Gen kodujący białko odpowiedzialne

za sekrecję

Sekrecja

tra

Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji

Wektor do klonowania DNA w bakteriach mlekowych

Dziękuje za uwagę