1 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

Izolacja kofeiny z różnych produktów spożywczych.

Cele ćwiczenia:

1. Nabycie umiejętności prowadzenia prostych analiz laboratoryjnych stosowanych w

biochemii, chemii organicznej, biotechnologii oraz procesach produkcyjnych.

2. Zapoznanie się z technikami szacowania wydajności oczyszczania wybranego składnika z

różnych surowców.

3. Nabycie umiejętności bieżącego przetwarzania danych płynących z eksperymentów oraz

pracy we wzajemnie komunikujących się, niewielkich zespołach.

4. Szacowanie wydajności procesów chemicznych zachodzących podczas oczyszczania

substancji.

Przebieg ćwiczenia:

Ćwiczenie wykonywane jest w trzech grupach. Przed każdą z grup stoją odmienne zadania. Właściwa
współpraca i organizacja pracy zarówno w grupach, jak i interakcje pomiędzy grupami są gwarancją
prawidłowo wykonanych założeń ćwiczenia.

Warunki wykonania ćwiczenia:

Każda osoba wykonująca ćwiczenie MUSI posiadać okulary ochronne, dwie pary rękawiczek
nitrylowych lub lateksowych oraz fartuch. Brak wymienionych skutkują brakiem możliwości
przystąpienia do ćwiczenia.

Zakres materiału do samodzielnego przygotowania:

1. Kofeina: własności alkaloidu, występowanie, działanie na organizm człowieka,

rozpuszczalność, metody ekstrakcji z surowców naturalnych

2. Zagadnienia związane z ekstrakcją typu ciecz-ciecz (warunki, współczynnik podziału, prawo

podziału Nernsta)

3. Spektrofotometria: wykonywanie krzywej wzorcowej, wybór analitycznej długości fali,

absorbancja kofeiny

4. Techniki zagęszczania próbki (szczególnie liofilizacja – co to za proces, do czego służy?)
5. Własności dichlorometanu.

2 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 1

Podstawowe zadania:

1. Wykonanie krzywej wzorcowej stężeń kofeiny w dichlorometanie.
2. Oszacowanie stężeń próbek dostarczonych na podstawie wykreślonej krzywej wzorcowej.

Przebieg ćwiczenia dla grupy 1

Przygotowanie krzywej wzorcowej:

1. Rozpuścić otrzymaną naważkę czystej chemicznie kofeiny w dichlorometanie w ten sposób,

by końcowe stężenie wzorca wynosiło 0,1 mg/ml (100 ug/ml)

2. Wykonać pięć rozcieńczeń otrzymanego roztworu w dichlorometanie w ten sposób, by

finalnie uzyskać stężenia z tabeli poniżej. Objętość każdego z roztworów wzorcowych
powinna wynosić 1 ml (rozcieńczanie prowadzić w probówkach typu eppendorf 1,5 lub 2,0 ml
pamiętając o wysokiej lotności dichlorometanu).

3. Zmierzyć absorbancję każdego z roztworów wzorcowych przy pomocy spektrofotometru i

kiuwety kwarcowej przy analitycznej długości fali 255 nm.

4. Wykreślić (w przybliżeniu) zależność stężenia kofeiny od absorbancji przy 255 nm.

Tabela 1 – dane niezbędne dla przygotowania krzywej wzorcowej stężenia kofeiny.

Stężenie

(ug/ml)

Objętość r-ru 0,1

mg/ml (100 ug/ml)

Objętość

rozpuszczalnika

Absorbancja dla 255 nm

10

25

50

75

100

Krzywa wzorcowa

λ

Wykres zależności stężenia kofeiny od absorbancji

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

ug/ml

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

3 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 2

Podstawowe zadania:

1. Ekstrakcja kofeiny z dostarczonej kawy
2. Określenie zawartości kofeiny w kawie na podstawie krzywej wzorcowej przygotowanej przez

grupę 1 z uwzględnieniem wydajności procesu ekstrakcji obliczonego przez grupę 3

Przebieg ćwiczenia dla grupy 2

1. Odważyć 5 gramów zmielonej kawy.
2. Naważkę zalać gorącą wodą w objętości około 50 ml.
3. Mieszaninę mieszać delikatnie przez około 5 minut.
4. Wychłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej.
5. Przesączyć przez lejek Büchnera z filtrem nitrocelulozowym posługując się pompką wodną.
6. Wykonać ekstrakcję do dichlorometanu (UWAGA – temperatura wrzenia dichlorometanu to

około 40°C, pamiętać o dokładnym wychłodzeniu roztworu wodnego!)

a. Roztwór wodny przelać do rozdzielacza
b. Dodać 2 ml dichlorometanu i delikatnie wytrząsać, okresowo odprowadzając gaz
c. Odstawić na statyw i odczekać do rozdzielenia faz
d. Fazę organiczną przelać do probówki polietylenowej 10 ml (biały korek), po czym

powtórzyć kroki 6a.-6c.

e. Jeśli do probówki dostała się pewna ilość fazy wodnej zwirować i zebrać pipetą
f. Faza organiczna prawdopodobnie będzie mętna. Przepipetować kilkukrotnie po czym

zwirować w ten sposób, by otrzymać klarowny roztwór dichlorometanu.

7. Pobrać niewielką objętość otrzymanego roztworu, rozcieńczyć 200x i oznaczyć absorbancję

roztworu (z pomocą grupy 1)

8. Odnieść otrzymaną absorbancję do krzywej wzorcowej wykreślonej przez grupę 1 i

oszacować finalne stężenie kofeiny w całej objętości dichlorometanu uwzględniając
rozcieńczenie.

9. Obliczyć stężenie kofeiny w otrzymanej próbce kawy uwzględniając wydajność ekstrakcji

oszacowaną przez grupę 3

4 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 3

Podstawowe zadania:

1. Ekstrakcja kofeiny z „napoju energetycznego” (N-Gine, Tiger, Red Bull, inny)
2. Określenie zawartości kofeiny w napoju i porównanie uzyskanej wartości z podaną na

etykiecie w celu oszacowania wydajności reakcji.

Przebieg ćwiczenia dla grupy 3

1. Odmierzyć około 40 ml napoju do probówki typu Falcon (V=50 ml) i odgazować (wytrząsanie

a potem zastosowanie homogenizatora ultradźwiękowego, parametry homogenizacji: moc
100%, przerwy około 20% czasu homogenizacji, czas 5 minut).

2. Wychłodzić roztwór do temperatury pokojowej (homogenizator ultradźwiękowy nagrzewa

roztwory homogenizowane).

3. Wykonać ekstrakcję do dichlorometanu (UWAGA – temperatura wrzenia dichlorometanu to

około 40°C, pamiętać o wychłodzeniu roztworu wodnego!)

a. Napój przelać do rozdzielacza
b. Dodać 2 ml dichlorometanu i delikatnie wytrząsać okresowo odprowadzając gaz
c. Odstawić na statyw i odczekać do rozdzielenia faz
d. Fazę organiczną przelać do probówki polietylenowej 5 ml (czerwony korek), po czym

powtórzyć kroki 3a.-3c.

e. Jeśli do probówki dostała się faza wodna – usunąć pipetą.

4. Pobrać niewielką objętość otrzymanego roztworu, rozcieńczyć 100x i oznaczyć absorbancję

roztworu z pomocą grupy 1

5. Odnieść otrzymaną absorbancję do krzywej wzorcowej wykreślonej przez grupę 1 i

oszacować finalne stężenie kofeiny w całej objętości dichlorometanu uwzględniając
rozcieńczenie.

6. Obliczyć stężenie kofeiny w 100 ml napoju i porównać otrzymaną wartość z danymi na

etykiecie.

7. Wykonać obliczenie wydajności reakcji. Wynik przekazać grupie 2.