Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 4
Data zajęć: 2008/03/06

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie E

Wpływ temperatury na aktywność inwertazy

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wstęp

Enzymy przyspieszają przebieg reakcji chemicznej przez obniżenie energii aktywacji.

Nie zużywają się w czasie reakcji, są po niej odtwarzane. Enzymy nie wpływają

na równowagę reakcji. Działają specyficznie względem substratów. Aktywność enzymów jest

ściśle związana z temperaturą.

Celem doświadczenia jest wyznaczenie optimum temperaturowego reakcji hydrolizy

sacharozy przez inwertazę w 1/15 M buforze fosforanowym o pH 5,6. Działanie inwertazy

(ß-fruktofuranozydaza, EC 3.2.1.26) polega na odszczepieniu wolnej fruktozy. Gdy hydrolizowana

jest sacharoza to powstaje D-fruktoza i D-glukoza.

Reakcję enzymatyczną należy przeprowadzić w różnych temperaturach. Do oznaczenia

stężenia glukozy w próbkach można wykorzystać metodę Nelsona. Aktywność enzymu jest

wyznaczana pośrednio przez pomiar absorbancji próbek przy długości fali 660 nm. Im większe

stężenie glukozy, produktu reakcji enzymatycznej, tym większa jest aktywność enzymu

w danych warunkach temperaturowych.

Materiały

a)

Odczynniki:

wyciąg drożdżowy, zawierający enzym – inwertazę

2% roztwór sacharozy – substrat

0,005% roztwór glukozy – standard glukozy

1/15 M bufor fosforanowy o pH 5,6

odczynnik miedziowy A (2,4% NaKC

4

H

4

O

6

, 5% NaHCO

3

, 4% Na

2

CO

3

, 3,6% K

2

C

2

O

4

)

odczynnik miedziowy B (1,3% CuSO

4

∙ 5H

2

O)

odczynnik arseno-molibdenowy

b)

Szkło laboratoryjne:

probówki chemiczne

probówki kalibrowane: 10 ml

pipety miarowe: 1 ml; 0,1 ml; 5 ml; 10 ml

c)

Aparatura:

fotokolorymetr „Specol”,kuwety szklane do „Specola”: 2 szt.,

statywy do probówek: 2 szt.

naczynie z lodem,

łaźnie wodne o temperaturach: 37°C, 55°C, 100°C,

tryskawka, bibuła, lignina.

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 4
Data zajęć: 2008/03/06

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie E

Wpływ temperatury na aktywność inwertazy

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wykonanie

Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „E”. Zastosowano jednak

łaźnię wodną 37°C zamiast 40°C oraz 55°C zamiast 60°C. Temperatura pokojowa wynosiła 23°C.

1.

Przygotowano odczynnik miedziowy przez zmieszanie 6 ml odczynnika A i B.

2.

Do przygotowanych, ponumerowanych zgodnie z tabelą 1., 16 kalibrowanych probówek

dodano po 0,5 ml odczynnika miedziowego.

3.

Do przygotowanych, ponumerowanych od 12 do 16 i od 12’ do 16’, 10 probówek chemicznych

dodano po 0,5 ml buforu o pH 5,6 oraz po 5 ml substratu.

4.

Probówki inkubowano wstępnie w odpowiednich łaźniach przez 5 minut w temperaturach:

12, 12’ – 0°C ; 13, 13’ – 23°C ; 14, 14’ – 37°C ; 15, 15’ – 55°C ; 16, 16’ – 100°C.

5.

Do probówek od 12 do 16 dodano po 0,5 ml enzymu oraz do probówek od 12’ do 16’ dodano

po 0,5 ml wody. Inkubowano probówki dokładnie przez 10 minut w odpowiednich łaźniach.

6.

Reakcję przerywano przez przeniesienie 0,1 ml roztworu z probówek chemicznych (od 12 do 12

oraz od 12’ do 16’) do odpowiednich probówek kalibrowanych (od 7 do 11 oraz od 7’ do 11’).

7.

Do probówek od 7 do 11 oraz od 7’ do 11’ dodano po 0,4 ml wody.

8.

Do probówek od 1 do 6 dodano standard glukozy i wodę zgodnie z tabelą 1.

9.

Wszystkie probówki kalibrowane inkubowano przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.

10.

Probówki kalibrowane oziębiono i dodano po 0,5 ml odczynnik arseno-molibdenowego.

11.

Probówki kalibrowane uzupełniono wodą destylowaną do 4 ml i wymieszano ich zawartość.

12.

Odczytano absorpcję probówek przy długości fali 660 nm względem probówki 1.

Wyniki (A

660

) umieszczono w tabeli 1.

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 4
Data zajęć: 2008/03/06

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie E

Wpływ temperatury na aktywność inwertazy

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wyniki

Tabela 1. – Zawartość próbek kalibrowanych

p

ro

b

ó

w

k

a

odczynnik

miedziowy

A+B

standard

glukozy

c=0,05
mg/ml

woda

próby E+S

inkubowane

w różnych

temp.

odczynnik

arseno-

molibdenowy

A

660

A

660

/kor/

/nr/

/ml/

/ml/

/ml/

/nr/

/ml/

/ml/

1

0,5

-

0,5

-

-

0,5

0,000

-

2

0,5

0,1

0,4

-

-

0,5

0,075

-

3

0,5

0,2

0,3

-

-

0,5

0,120

-

4

0,5

0,3

0,2

-

-

0,5

0,185

-

5

0,5

0,4

0,1

-

-

0,5

0,245

-

6

0,5

0,5

-

-

-

0,5

0,395

-

7

0,5

-

0,4

12

0,1

0,5

0,125

0,065

7’

0,5

-

0,4

12’

0,1

0,5

0,060

-

8

0,5

-

0,4

13

0,1

0,5

0,310

0,110

8’

0,5

-

0,4

13’

0,1

0,5

0,200

-

9

0,5

-

0,4

14

0,1

0,5

0,620

0,570

9’

0,5

-

0,4

14’

0,1

0,5

0,050

-

10

0,5

-

0,4

15

0,1

0,5

0,720

0,520

10’

0,5

-

0,4

15’

0,1

0,5

0,200

-

11

0,5

-

0,4

16

0,1

0,5

0,140

0,020

11’

0,5

-

0,4

16’

0,1

0,5

0,120

-

Wykres 1. – Krzywa standardowa glukozy

Przy wyznaczaniu regresji liniowej pominięto próbę nr 6, ze względu na znaczne odstępstwo

wartości absorbancji od pozostałych próbek.

A = 0,0123 ∙ m

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

A

660

m /μg/

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 4
Data zajęć: 2008/03/06

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie E

Wpływ temperatury na aktywność inwertazy

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Tabela 2. – Wpływ temperatury na aktywność inwertazy

temperatura

/°C/

A

660

/kor/

zawartość*

glukozy /μg/

aktywność**

/j.a./

0

0,065

5,285

0,352

23

0,110

8,943

0,596

37

0,570

46,341

3,089

55

0,520

42,276

2,818

100

0,020

1,626

0,108

* zawartość glukozy

 obliczono z krzywej standardowej [Wykres 1.]

  0,0123 ∙     81,3 ∙ 

** aktywność

obliczono ze wzoru [str. 22 w instrukcji „E”]



 ∙ 6

0,1 ∙ 0,5 ∙ 10 ∙ 180 



15 

µmol

ml ∙ min

Wykres 2. – Zależność aktywności inwertazy od temperatury

Wnioski

Stężenie glukozy, produktu reakcji, w próbce świadczy o aktywności enzymatycznej inwertazy.

Zgodnie z wykresem 2. widać, że temperatura znacznie wpływa na aktywność inwertazy.

Do 40°C szybkość katalizowanej reakcji zwiększa się ze wzrostem temperatury.

Maksymalna aktywność inwertazy przypada dla temperatury ok. 40°C. Znalezione optimum

temperaturowe zgadza się z wynikiem zawartym w instrukcji „E”.

Powyżej temperatury 40°C aktywność gwałtownie spada. Enzym ulega denaturacji cieplnej.

Inwertaza ulega procesowi nieodwracalnej zmiany swojej białkowej struktury przestrzennej,

co uniemożliwia jej dalej katalizowanie reakcji chemicznej.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0

20

40

60

80

100

a

T /°C/