Hydrolazy

Hydrolazy

-

-

peptydazy

peptydazy

(pepsyna, trypsyna)

(pepsyna, trypsyna)

Cel

Cel

ć

ć

wicze

wicze

ń

ń

:

:

Ocena wp

Ocena wp

ł

ł

ywu pH

ywu pH

ś

ś

rodowiska na aktywno

rodowiska na aktywno

ść

ść

pepsyny

pepsyny

Ocena aktywno

Ocena aktywno

ś

ś

ci trypsyny na podstawie

ci trypsyny na podstawie

ilo

ilo

ś

ś

ci strawionego bia

ci strawionego bia

ł

ł

ka mierzonego metod

ka mierzonego metod

ą

ą

biuretow

biuretow

ą

ą

E.C.3.3.4.4.1 Pepsyna

E.C.3.3.4.4.1 Pepsyna

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

•

•

Proteaza soku

Proteaza soku

ż

ż

o

o

łą

łą

dkowego

dkowego

•

•

Produkowana przez kom

Produkowana przez kom

ó

ó

rki g

rki g

ł

ł

ó

ó

wne b

wne b

ł

ł

ony

ony

ś

ś

luzowej

luzowej

ż

ż

o

o

łą

łą

dka

dka

•

•

Posta

Posta

ć

ć

nieaktywna (preenzym)

nieaktywna (preenzym)

-

-

Pepsynogen

Pepsynogen

Aktywacja:

Aktywacja:

•

•

Proces spontaniczny przy pH poni

Proces spontaniczny przy pH poni

ż

ż

ej 5 w trzech

ej 5 w trzech

etapach

etapach

•

•

Kwa

Kwa

ś

ś

ne

ne

ś

ś

rodowisko

rodowisko

ż

ż

o

o

łą

łą

dka zapewnia obecno

dka zapewnia obecno

ść

ść

HCl

HCl

•

•

Odci

Odci

ę

ę

cie

cie

ł

ł

a

a

ń

ń

cucha 44 aminokwas

cucha 44 aminokwas

ó

ó

w powoduje

w powoduje

ods

ods

ł

ł

oni

oni

ę

ę

cie kwasu glutaminowego znajduj

cie kwasu glutaminowego znajduj

ą

ą

cego

cego

si

si

ę

ę

w centrum aktywnym enzymu

w centrum aktywnym enzymu

•

•

Optimum pH 1

Optimum pH 1

-

-

2

2

PEPSYNA

PEPSYNA

PEPSYNOGEN

PEPSYNOGEN

Dzia

Dzia

ł

ł

anie:

anie:

•

•

Hydrolaza peptydylo

Hydrolaza peptydylo

-

-

peptyd

peptyd

ó

ó

w

w

rozk

rozk

ł

ł

adaj

adaj

ą

ą

ca wi

ca wi

ą

ą

zania peptydowe bia

zania peptydowe bia

ł

ł

ek

ek

za wyj

za wyj

ą

ą

tkiem keratyn i protamin

tkiem keratyn i protamin

•

•

Preferuje wi

Preferuje wi

ą

ą

zania utworzone pomi

zania utworzone pomi

ę

ę

dzy

dzy

fenyloalanin

fenyloalanin

ą

ą

i tyrozyn

i tyrozyn

ą

ą

z innymi

z innymi

aminokwasami oraz leucyn

aminokwasami oraz leucyn

ą

ą

i kwasem

i kwasem

glutaminowym

glutaminowym

E.C.3.4.4.4. Trypsyna

E.C.3.4.4.4. Trypsyna

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

•

•

Proteaza soku trzustkowego

Proteaza soku trzustkowego

•

•

Produkowana przez kom

Produkowana przez kom

ó

ó

rki trzustki w

rki trzustki w

formie nieaktywnej

formie nieaktywnej

-

-

trypsynogenu

trypsynogenu

Aktywacja:

Aktywacja:

•

•

Niezb

Niezb

ę

ę

dny jest udzia

dny jest udzia

ł

ł

enterokinazy

enterokinazy

-

-

enzym

enzym

produkowany przez b

produkowany przez b

ł

ł

on

on

ę

ę

ś

ś

luzow

luzow

ą

ą

dwunastnicy

dwunastnicy

•

•

Jest to proces autokatalityczny

Jest to proces autokatalityczny

•

•

Odcinany jest fragment 6

Odcinany jest fragment 6

-

-

ciu

ciu

aminokwas

aminokwas

ó

ó

w powoduj

w powoduj

ą

ą

c ods

c ods

ł

ł

oni

oni

ę

ę

cie

cie

w centrum aktywnym uk

w centrum aktywnym uk

ł

ł

adu Gli

adu Gli

-

-

Asp

Asp

-

-

Ser

Ser

-

-

Gli

Gli

•

•

Optimum pH 7

Optimum pH 7

-

-

9

9

TRYPSYNA

TRYPSYNA

TRYPSYNOGEN

TRYPSYNOGEN

Dzia

Dzia

ł

ł

anie:

anie:

•

•

Hydrolaza peptydylo

Hydrolaza peptydylo

-

-

peptyd

peptyd

ó

ó

w

w

katalizuj

katalizuj

ą

ą

ca rozpad wi

ca rozpad wi

ą

ą

zania peptydowego

zania peptydowego

utworzonego przez lizyn

utworzonego przez lizyn

ę

ę

i arginin

i arginin

ę

ę

z

z

innymi aminokwasami

innymi aminokwasami

E.C.3.4.4.4. Chymotrypsyna

E.C.3.4.4.4. Chymotrypsyna

•

•

Dzia

Dzia

ł

ł

anie nie jest do ko

anie nie jest do ko

ń

ń

ca poznane,

ca poznane,

prawdopodobnie rozk

prawdopodobnie rozk

ł

ł

ada wi

ada wi

ą

ą

zania

zania

utworzone przez aminokwasy aromatyczne

utworzone przez aminokwasy aromatyczne

Hormony:

Hormony:

•

•

W trawieniu bia

W trawieniu bia

ł

ł

ek niezb

ek niezb

ę

ę

dny jest udzia

dny jest udzia

ł

ł

:

:





Gastryny pobudzaj

Gastryny pobudzaj

ą

ą

cej sekrecj

cej sekrecj

ę

ę

HCl

HCl





Sekretyny pobudzaj

Sekretyny pobudzaj

ą

ą

cej wydzielanie soku

cej wydzielanie soku

trzustkowego, w kt

trzustkowego, w kt

ó

ó

rym zapewnia obecno

rym zapewnia obecno

ść

ść

odpowiedniej ilo

odpowiedniej ilo

ś

ś

ci wody i jon

ci wody i jon

ó

ó

w HCO

w HCO

3

3

-

-





Pankreozyminy wp

Pankreozyminy wp

ł

ł

ywaj

ywaj

ą

ą

cej na wydzielanie soku

cej na wydzielanie soku

trzustkowego oraz perystaltyk

trzustkowego oraz perystaltyk

ę

ę

przewodu

przewodu

pokarmowego

pokarmowego

Wch

Wch

ł

ł

anianie aminokwas

anianie aminokwas

ó

ó

w:

w:

•

•

Niezb

Niezb

ę

ę

dna jest obecno

dna jest obecno

ść

ść

PLP oraz jon

PLP oraz jon

ó

ó

w

w

Mn

Mn

•

•

Najszybciej wch

Najszybciej wch

ł

ł

aniana jest cysteina,

aniana jest cysteina,

natomiast najwolniej wch

natomiast najwolniej wch

ł

ł

aniany jest kwas

aniany jest kwas

glutaminowy i kwas asparaginowy

glutaminowy i kwas asparaginowy

Zadanie 1

Zadanie 1

Badanie aktywno

Badanie aktywno

ś

ś

ci pepsyny w r

ci pepsyny w r

ó

ó

ż

ż

nych warunkach pH

nych warunkach pH

Wykonanie.

Wykonanie.

Do prob

Do prob

ó

ó

wek oznaczonych 1, 2, 3, 4 odmierzy

wek oznaczonych 1, 2, 3, 4 odmierzy

ć

ć

po 2 cm3 pepsyny. Prob

po 2 cm3 pepsyny. Prob

ó

ó

wk

wk

ę

ę

nr 4 ogrza

nr 4 ogrza

ć

ć

nad palnikiem

nad palnikiem

(inaktywacja pepsyny). Do pozosta

(inaktywacja pepsyny). Do pozosta

ł

ł

ych prob

ych prob

ó

ó

wek doda

wek doda

ć

ć

:

:

1

1

-

-

2 cm

2 cm

3

3

0,2 mol/dm

0,2 mol/dm

3

3

HCl

HCl

2

2

-

-

2 cm

2 cm

3

3

1 mol/dm

1 mol/dm

3

3

CH

CH

3

3

COOH

COOH

3

3

-

-

2 cm

2 cm

3

3

buforu o pH 7,2

buforu o pH 7,2

Nast

Nast

ę

ę

pnie do wszystkich 4 prob

pnie do wszystkich 4 prob

ó

ó

wek doda

wek doda

ć

ć

niewielk

niewielk

ą

ą

porcj

porcj

ę

ę

bia

bia

ł

ł

ka. Pr

ka. Pr

ó

ó

by wstawi

by wstawi

ć

ć

do

do

ł

ł

a

a

ź

ź

ni wodnej o temp. 37

ni wodnej o temp. 37

°

°

C. Po

C. Po

godzinnej inkubacji obejrze

godzinnej inkubacji obejrze

ć

ć

pr

pr

ó

ó

by. Poda

by. Poda

ć

ć

nr prob

nr prob

ó

ó

wki, w

wki, w

kt

kt

ó

ó

rej bia

rej bia

ł

ł

ko uleg

ko uleg

ł

ł

o strawieniu?

o strawieniu?

Zadanie 2

Zadanie 2

Badanie aktywno

Badanie aktywno

ś

ś

ci trypsyny

ci trypsyny

Wykonanie.

Wykonanie.

Do 3 prob

Do 3 prob

ó

ó

wek wir

wek wir

ó

ó

wkowych oznaczonych 1, 2, 3 odmierzy

wkowych oznaczonych 1, 2, 3 odmierzy

ć

ć

po 1 cm

po 1 cm

3

3

30% TCA. W oddzielnej prob

30% TCA. W oddzielnej prob

ó

ó

wce

wce

„

„

A

A

”

”

przygotowa

przygotowa

ć

ć

uk

uk

ł

ł

ad inkubacyjny

ad inkubacyjny

sk

sk

ł

ł

adaj

adaj

ą

ą

cy si

cy si

ę

ę

z 4 cm

z 4 cm

3

3

1% kazeiny w 0,1 mol/dm3 NaHCO3 oraz 1 cm3 trypsyny.

1% kazeiny w 0,1 mol/dm3 NaHCO3 oraz 1 cm3 trypsyny.

Zawarto

Zawarto

ść

ść

zmiesza

zmiesza

ć

ć

. Po tej czynno

. Po tej czynno

ś

ś

ci natychmiast pobra

ci natychmiast pobra

ć

ć

1 cm3 tej mieszaniny do

1 cm3 tej mieszaniny do

prob

prob

ó

ó

wki wir

wki wir

ó

ó

wkowej oznaczonej nr 0.

wkowej oznaczonej nr 0.

Pozosta

Pozosta

ł

ł

o

o

ść

ść

mieszaniny w prob

mieszaniny w prob

ó

ó

wce

wce

„

„

A

A

”

”

inkubowa

inkubowa

ć

ć

przez 10 min. w temp. 37

przez 10 min. w temp. 37

°

°

C. Po

C. Po

10 min. pobra

10 min. pobra

ć

ć

po 1 cm

po 1 cm

3

3

tej mieszaniny do prob

tej mieszaniny do prob

ó

ó

wek wir

wek wir

ó

ó

wkowych nr 1 i 2.

wkowych nr 1 i 2.

Pr

Pr

ó

ó

by 0, 1, 2 odstawi

by 0, 1, 2 odstawi

ć

ć

na 10 min. a nast

na 10 min. a nast

ę

ę

pnie wirowa

pnie wirowa

ć

ć

15 min. z u

15 min. z u

ż

ż

yciem si

yciem si

ł

ł

y

y

2 000 x g. Po wirowaniu supernatant wyla

2 000 x g. Po wirowaniu supernatant wyla

ć

ć

.

.

Do osadu doda

Do osadu doda

ć

ć

1 cm

1 cm

3

3

1 mol/dm

1 mol/dm

3

3

NaOH, a po rozpuszczeniu si

NaOH, a po rozpuszczeniu si

ę

ę

osadu, doda

osadu, doda

ć

ć

4 cm

4 cm

3

3

odczynnika miedziowego. Zmiesza

odczynnika miedziowego. Zmiesza

ć

ć

zawarto

zawarto

ść

ść

i pozostawi

i pozostawi

ć

ć

w temp. pokojowej na

w temp. pokojowej na

oko

oko

ł

ł

o 20 min.

o 20 min.

W tym czasie przygotowa

W tym czasie przygotowa

ć

ć

pr

pr

ó

ó

b

b

ę

ę

„

„

ś

ś

lep

lep

ą

ą

”

”

(odczynnikow

(odczynnikow

ą

ą

)

)

–

–

4 cm

4 cm

3

3

odczynnika

odczynnika

miedziowego i 1 cm

miedziowego i 1 cm

3

3

wody dest. Odczyta

wody dest. Odczyta

ć

ć

absorbancj

absorbancj

ę

ę

pr

pr

ó

ó

b 0, 1, 2 przy d

b 0, 1, 2 przy d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci

ci

fali 540 nm wobec pr

fali 540 nm wobec pr

ó

ó

by

by

„

„

ś

ś

lepej

lepej

”

”

. Zawarto

. Zawarto

ść

ść

bia

bia

ł

ł

ka w badanym roztworze

ka w badanym roztworze

odczyta

odczyta

ć

ć

z krzywej wzorcowej.

z krzywej wzorcowej.