2011

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z enzymologii

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka przez reakcję z barwnikiem

Coomassie Brilliant Blue G-250

Michał Jakób

[e-mail]

p. C14, bud. F4

godz. konsultacji Pn. 17

00

– 19

00

Wt. 13

00

– 15

00

- 2 -

1. Wstęp.

Kolorymetryczna metoda oznaczania stężenia białka w roztworach przez reakcję

z barwnikiem Coomassie

1

Bright Blue G-250 (CBB G-250) została opracowana

i opublikowana przez Marion M. Bradford w 1976 roku, dlatego też potocznie nazywana
jest metodą Bradford.

Barwnik CBB G-250 w kwaśnych roztworach (pH < 0,5) posiada intensywnie

czerwoną barwę i maksimum absorbcji przy 465 nm (Rys. 1).

Rysunek 1. Trzy podstawowe formy CBB G-250 występujące w zależności od pH

roztworu. Forma I, czerwona, dominuje przy pH < 0,5 i posiada maksimum
absorbcji przy 465 nm. Forma II, zielona, dominuje pomiędzy 1 < pH < 2

i posiada maksimum absorbcji przy 650 nm. Forma III, niebieska, dominuje

w 3 < pH < 9 i posiada maksimum absorbcji przy 590 nm. Widmo absorbcji

kompleksu białka z barwnikiem posiada dwa maksima, mniejsze przy 465 nm

i większe przy 595 nm (drugie maksimum leży przy 595 nm, a nie 590 nm

z powodu obecności formy zielonej. Rysunek na podstawie [Chial i inni,

1993].

1

Nazwa Coomassie pochodzi od nazwy stolicy Ghany, Kumasi. Imperial Chemical Industries (ICI), które opatentowało barwnik,

nadało mu tę nazwę aby uczcić zwycięstwa armii brytyjskiej w Ghanie. Oznaczenie G-250 zawiera informację o intensywności
barwnika oraz uwagę, że ma on zielonkawy odcień (G od słowa "green" lub "greenish"). Współcześnie ICI nie posiada już
monopolu na produkcję CBB G-250, jednak z powodu praw patentowych większość pozostałych producentów używa innych
nazw handlowych, np. Serva Bright Blue G-250

.

C

N

H

N

CH

2

N

H

2

C

O

3

S

SO

3

OCH

2

CH

3

CH

3

H

3

C

H

CH

3

CH

2

H

CH

2

CH

3

+

+

+

-

-

C

N

H

N

CH

2

N

H

2

C

O

3

S

SO

3

OCH

2

CH

3

CH

3

H

3

C

H

CH

3

CH

2

CH

2

CH

3

I

II

- H

+

+ H

+

C

N

H

N

CH

2

N

H

2

C

O

3

S

SO

3

OCH

2

CH

3

CH

3

H

3

C

CH

3

CH

2

CH

2

CH

3

+

+

-

-

III

- H

+

+ H

+

+

-

-

Białko

Kompleks Białko:Coomassie Blue

pK

1

= 1.15

pK

2

= 1.82

- 3 -

Po związaniu z białkiem barwnik przechodzi w formę niebieską o maksimum

absorbcji przy ~590 nm (Rys. 2) [Chial i Splittberger, 1993; Chial i inni, 1993]. W
praktyce pomiar wygląda następująco: do próbki białka dodaje się roztworu barwnika w
kwasie fosforowym i etanolu, inkubuje się próby przez pięć minut w temperaturze
pokojowej, po czym należy zmierzyć ich ekstynkcję przy 595 nm [Bradford, 1976].
Metoda pozwala na ilościowe oznaczenie od 1 do 50 g białka.

Mechanizm oddziaływania barwnika CBB G-250 z białkiem nie jest dokładnie

poznany. Przypuszcza się, że cząsteczki barwnika oddziaływują z resztami arginylowymi,
aromatycznymi i być może lizylowymi [Bradford, 1976; Compton i Jones, 1985;
Splittberger i Sohl, 1989; Chial i Splittberger, 1993; Chial i inni, 1993]. Reakcja barwnika
z białkiem jest odwracalna. Stwierdzono również, że barwnik nie oddziaływuje
z polipeptydami o masie mniejszej niż około 3000 Da (27 aminokwasów), co znalazło
wykorzystanie w teście aktywności proteolitycznej opartym o metodę Bradford [Buroker-
Kilgore i Wang, 1993].

W porównaniu do innych metod, metoda Bradford jest najmniej wrażliwą na

obecność typowych związków chemicznych, najprostszą i najczulszą z metod
kolorymetrycznych [Stoscheck, 1990]. Jest również czulsza od dowolnej metody opartej
na absorbcji aminokwasów w ultrafiolecie i w odróżnieniu od tych ostatnich na pomiar
nie ma wpływu obecność kwasów nukleinowych lub innych silnie absorbujących
w ultrafiolecie zanieczyszczeń [Stoscheck, 1990]. Czulsze od metody Bradford są jedynie
metody wykorzystujące barwniki fluorescencyjne lub metoda koloidalnego złota,
jednakże są one skomplikowane i czasochłonne [Peterson, 1983; Stoscheck, 1990].
Metoda Bradford wrażliwa jest na obecność surfaktantów, dlatego też gdy mierzy się
stężenia białka w roztworze zawierającym detergenty lepiej jest użyć metody BCA [Smith
i inni, 1985, cytowane za Stoscheck 1990] lub metody Lowry'ego [Lowry i inni, 1947,
cytowane za Peterson, 1983].

Rysunek 2. Spektrum absorbcyjne CBB z lub bez białka.

a) CBB wolne od białka.

b) CBB z dodatkiem białka.

Absorbancja

Długość fali [nm]

350

750

595

a)

b)

465

- 4 -

UWAGI:

Najważniejszym krokiem w prawidłowo wykonanym pomiarze stężenia białka

metodą Bradford jest przygotowanie krzywej standardowej. Zawsze oznaczaj
spektrofotometrycznie stężenia standardu, dokładne naważenie nie wystarczy. Zawsze
przygotowuj standard w identycznym roztworze jak badane próby. Do każdej nowej serii
pomiarów należy ponownie przygotować i zmierzyć standard.

Metoda Bradford nie daje liniowych wyników. Są trzy sposoby na linearyzację

wyników:

1. Mierzyć ekstynkcję przy 465 nm (ubytek barwnika). Powoduje to obniżenie

czułości ale wyniki są prawie idealnie liniowe. Użyteczne, jeśli mierzy się duże
stężenia białka.

2. Mierzyć stężenie białka w funkcji różnicy A

595

– A

465

. Teoretycznie równoważy to

efekt ubytku barwnika, jest to jednak wyłącznie obserwacja empiryczna [Read
i Northcote, 1983].

3. Mierzyć stężenie białka w funkcji ilorazu A

595

/A

465

. To również ma odpowiadać

efektowi ubytku barwnika. Aczkolwiek istnieje teoretyczne uzasadnienie takiej
zależności, brak znajomości mechanizmu oddziaływania CBB G-250 z białkami
uniemożliwia ostateczne potwierdzenie lub obalenie podstaw teoretycznych
takiego pomysłu. Bez względu na niejasności, sposób ten daje najlepsze rezultaty
i wydaje się, że pozwala na podniesienie czułości metody [Zor i Selinger, 1996].

Metoda Bradford daje rozbieżne wyniki z metodą Lowry'ego lub BCA gdy mierzy

się stężenie białek we frakcjach błonowych. Dyskusję i rozwiązanie tego problemu można
znaleźć w materiałach opublikowanych przez Stoscheck’a [Stoscheck, 1990].

Po reakcji z CBB G-250 zabarwienie jest stabilne przez nie więcej niż 90 minut

[Bradford, 1976]!

Różne białka mogą dawać bardzo różne intensywności zabarwienia po reakcji

z CBB G-250. Ekstynkcja dwóch próbek o identycznych stężeniach, odpowiednio
albuminy wołowej i lizozymu może różnić się czterokrotnie!

2. Odczynniki.

Odczynnik Bradford:

rozpuścić 100 mg Serva Brilliant Blue G-250 w 50 ml 95% (v/v) etanolu.
Dodać 100 ml 85% (w/v) H

3

PO

4

, delikatnie ale dokładnie wymieszać,

poczym dopełnić do 1 litra wodą redestylowaną. Przefiltrować przez sączek
karbowany do ciemnej butelki. Przechowywać w temperaturze pokojowej
[Bradford, 1976].

Bufor standardowy:

10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.0.

- 5 -

Standard białkowy:

25 ml roztworu immunoglobuliny G (frakcja V) o stężeniu 1 mg/ml
w buforze standardowym.

Dodatkowo:

roztwór o nieznanym stężeniu immuglobuliny w buforze standardowym;
roztwór o nieznanym stężeniu albuminy wołowej;
roztwór o nieznanym stężeniu lizozymu;
10% (w/v) SDS;
3 M NaCl.

3. Doświadczenia.

UWAGA! Zanim zaczniesz wykonywać którekolwiek z doświadczeń, przeczytaj

cały podrozdział 3., wybierz, które z opcjonalnych doświadczeń chcesz wykonać,
przejrzyj podrozdział 4 i upewnij się, że będziesz mógł/mogła wykonać pomiary
spektrofotometryczne w 5 minut po przygotowaniu prób. Pamiętaj, aby mierzyć wszystkie
próby (w tym standard) w jednej serii (a więc do wszystkich 15 dodajesz odczynnik
Bradford jednocześnie).

Przygotowanie standardu: pobierz 0,5 ml standardu do osobnej probówki i dodaj

do niego 2 ml buforu standardowego. Zmierz ekstynkcję tak otrzymanego roztworu przy
280 nm. Na podstawie pomiaru ekstynkcji i odpowiedniego współczynnika ekstynkcji (dla
immuglobuliny A

280

0.1%

= 1,5) będziesz mógł/mogła wyliczyć rzeczywiste stężenie

standardu. Następnie przygotuj serię rozcieńczeń standardu (dopełniając buforem
standardowym), tak aby otrzymać kolejno ok. 0 g, 1 g, 2 g, 5 g, 10 g, 20 g, 40 g
białka w 100 l buforu standardowego. Dokładne masy można obliczyć później,
przygotuj rozcieńczenia tak aby wygodnie pipetować.

Przygotowanie pomiaru stężenia białka próbki o nieznanym stężeniu: rozpipetuj

do czterech probówek kolejno po 10 l, 20 l, 40 l i 60 l roztworu immuglobuliny G
o nieznanym stężeniu (nie standardu!). Dopełnij buforem do 100 l.

UWAGA! Wybierz dowolne jedno z poniższych 4 doświadczeń.

1. Przygotowanie pomiaru stężenia lizozymu: rozpipetuj do czterech probówek kolejno

po 10 l, 20 l, 40 l i 60 l roztworu lizozymu o nieznanym stężeniu. Dopełnij
buforem standardowym do 100 l.

2. Przygotowanie pomiaru stężenia albuminy wołowej: rozpipetuj do czterech

probówek kolejno po 10 l, 20 l, 40 l i 60 l roztworu albuminy wołowej
o nieznanym stężeniu. Dopełnij buforem standardowym do 100 l.

3. Przygotowanie pomiaru stężenia białka w obecności SDS: rozpipetuj do czterech

probówek taką ilość białka standardowego, aby w probówkach znalazło się po 10 g
białka. Dodaj kolejno po 0 l, 10 l, 20 l i 50 l 10% (w/v) SDS. Dopełnij buforem
standardowym do 100 l.

- 6 -

4. Przygotowanie pomiaru stężenia białka w obecności NaCl: rozpipetuj do czterech

probówek taką ilość białka standardowego, aby w probówkach znalazło się po 10 g
białka. Dodaj kolejno 0 l, 10 l, 20 l, 50 l 3 M NaCl. Dopełnij buforem
standardowym do 100 l.

Pomiar stężenia białka metodą Bradford: do każdej z probówek (7+4+4) dodaj

po 1 ml odczynnika Bradford. Bardzo dokładnie, ale delikatnie aby nie wytworzyć piany,
zamieszaj wszystkie próby. Odczekaj 5 minut. Do wszystkich pomiarów ekstynkcji używaj
plastykowych lub szklanych kuwet. W żadnym wypadku nie używaj kwarcowych kuwet!
Wyzeruj spektrofotometr przy 595 nm względem buforu standardowego. Zmierz
ekstynkcję przy 595 nm wszystkich prób względem buforu standardowego. Wyzeruj
spektrofotometr na 465 nm względem buforu standardowego. Wykonaj ponowenie
pomiar całej serii przy 465 nm. Po wykonanych pomiarach dokładnie umyj kuwety.

4. Opracowanie wyników.

Wyniki należy opracować w postaci sprawozdania, które powinno składać się z następujących

części: wstępu teoretycznego, protokołu, wyników z ich opracowaniem i wniosków.

W sprawozdaniu, proszę koniecznie wpisać imię i nazwisko, dzień tygodnia i godzinę zajęć oraz

nazwisko osoby do której są Państwo zapisani na zajęcia.

UWAGI OGÓLNE:

 Sprawozdanie nie jest instrukcją do ćwiczenia, dlatego należy napisać je używając czasu przeszłego

dokonanego, a nie trybu rozkazującego (np. zmierzono ekstynkcję, ew. zmierzyłem/am ekstynkcję,
a nie zmierz ekstynkcję);

 Przy wszystkich obliczeniach proszę podawać wzory, z których Państwo korzystają, razem

z wyjaśnieniem znaczenia poszczególnych symboli;

 Do wykonanego wykresu należy podać równanie funkcji;
 Przy wszystkich liczbach wymiarowych proszę podawać jednostki.

PLAN SPRAWOZDANIA:

I. WYKONANIE ĆWICZENIA:

W części pierwszej sprawozdania należy zwięźle opisać tok postępowania, oraz uzupełnić tabele,

których wzór przedstawiono poniżej. Ewentualne odstępstwa od protokołu doświadczenia oraz zauważone
błędy lub nieprawidłowości proszę wyraźnie zaznaczyć.

1. Opis przygotowania standardu. W tym punkcie należy od razu podać wynik pomiaru A

280

i obliczyć stężenie białka standardowego. W kolumnie m

standardu

[g], należy wyliczyć

rzeczywistą ilość standardu w poszczególnych próbkach.

2. Opis przygotowania Immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu.

3. Opis trzeciej części ćwiczenia. Tabelę należy wykonać w analogiczny sposób (nr próbek:

12...15). W przypadku gdy pomiary były wykonane w obecności SDS lub NaCl proszę podać
objętość dodanego odczynnika i jego stężenie w 100 l próbki.

- 7 -

II. WYNIKI I ANALIZA WYNIKÓW:

 W punkcie drugim należy wypisać wyniki odczytane ze spektrofotometru w formie czytelnych

tabel, podając także dodatkowe informacje, wg poniższych wzorów.

 Pierwsza tabela dotyczy tylko standardu:

 W opracowaniu wyników, proszę sporządzić wykres zależności A

595

/A

465

od masy standardu

[A

595

/A

465

= f(m[g)]. Koniecznie proszę podać równanie funkcji.

UWAGA! Po naniesieniu punktów pomiarowych na wykres należy wykonać regresję liniową. W tym celu
wykres trzeba wykonać na komputerze w odpowiednim programie, lub na papierze milimetrowym
z wykorzystaniem linearyzacji wyników metodą najmniejszych kwadratów. Wyrzucane punkty powinny być
zaznaczone na wykresie (np. w drugiej serii) a wyrzucenie uzasadnione odp. wartościami statystycznymi.

Należy zwrócić uwagę na wykonanie wykresu (wykres powinien mieć tytuł, zaznaczone jednostki na
opisanych osiach, widoczne punkty pomiarowe; wykres powinien być duży i czytelny).

Z krzywej standardowej należy obliczyć (z równania funkcji) ilość mikrogramów dla wszystkich
oznaczanych białek o nieznanym stężeniu (lub dla białek o znanym stężeniu, ale mierzonych w obecności
SDS, czy NaCl), a następnie ich stężenie ze wzoru:

Odpowiednie dane i obliczenia proszę umieścić w tabeli:

nr próbki

[A

595

/A

465

= f(m[g)]

A

595

A

465

A

595

/A

465

m

X

[

g]

V

X

[

l]

C

X

[

g/l]

8

…

11

12

…

15

Jeśli jakiekolwiek wyniki zostały odrzucone należy to dobrze uzasadnić i zaznaczyć.

III. WNIOSKI:

 Proszę wyliczyć średnie stężenie białka otrzymane z wykresu.

Białko

Stężenie białka

[g/l]

IgG

Lizozym/albumina

wolowa

 Proszę napisać i UZASADNIĆ powołując się na teorię dla których z wykonywanych

eksperymentów wyznaczone stężenia są właściwie określone.

nr próbki

m

standardu

[g]

V

standardu

[l] V

buforu

[l]

A

595

A

465

A

595

/A

465

1

…

7

X

X

X

V

m

C



- 8 -

 Jeśli wykonywane były wybieralne doświadczenia 3 lub 4 należy postawić do nich wnioski

i uzasadnić je. Proszę wykonać tabelę oznaczonej ilości białka dla różnych stężeń SDS lub NaCl.

Nr próbki

Stężenie SDS/NaCl

Oznaczone stężenie

białka w [

g/l]

12
…
15

Proszę napisać jaki obserwują Państwo wpływ SDS lub NaCl na dokładność oznaczenia stężenia białka.
Proszę napisać czy jest to zgodne z tym, czego Państwo się spodziewali i dlaczego.

Do sprawozdania należy koniecznie dołączyć wyniki spisywane lub wydrukowane bezpośrednio na
ćwiczeniach, podpisane przez prowadzącego zajęcia.

Sprawozdanie w formacie Worda o nazwie

nazwisko_indeks.doc(x) należy podpiąć pod e-portal w ciągu

tygodnia od zajęć.

5. Literatura.

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantition of microgram quantities of protein

utilizing the principle of protein-dye binding.

Anal. Biochem. 72, 248-251.

Buroker-Kilgore, M. i Wang, K.K.W (1993) A Coomassie Brilliant Blue G-250 based colorimetric assay

for measuring activity of calpain and other proteases.

Anal. Biochem. 208, 387-392.

Chial, H.J. i Splittgerber, A.G. (1993) A comparison of the binding of Coomassie Brilliant Blue to proteins at

Iow and neutral pH.

Anal. Biochem. 213, 362-369.

Compton, S.J. i Jones C.G. (1985) Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein

assay.

Anal. Biochem. 151, 369-374.

Congdon, R.W., Muth, G.W. i Splittberger, A.G. (1993) The binding interaction of Coomassie Blue with

proteins.

Anal. Biochem. 213, 407-413.

Peterson, G.L. (1983) Determination of total protein. Zamieszczone w "Methods in Enzymology"

(Hirs,C.H.W. i Timascheff, S.N. Eds.) vol. 91, 95-119, Academic Press, San Diego.

Read, S.M. i Northcote D.H. (1981) Minimization of variation in the response to different proteins

of the Coomassie Blue G dye-binding assay for protein.

Anal. Biochem. 116, 53-64.

Splittberger, A.G. I Sohl, J. (1989) Nonlinearity in protein assays by the Coomassie Blue dye-binding

method.

Anal. Biochem. 179, 198-201.

Stoscheck, CM. (1990) Quantitation of protein. Zamieszczone w "Methods in Enzymology" (Deutscher,

M.P., Ed.) vol. 182, 50-68, Academic Press, San Diego.

Zor, T. i Selinger, Z. (1996) Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical

and experimental studies.

Anal. Biochem. 236, 302-308.

- 9 -

Arkusz wyników

P

RZYGOTOWANIE STANDARDU IMUNOGLOBULINY

G

nr próbki

m

standardu

[g]

teoretyczna

m

standardu

[g]

rzeczywista

V

standardu

[l]

V

buforu

[l]

A

595

A

465

1

ok 0 g

2

ok 1 g

3

ok 2 g

4

ok 5 g

5

ok 10 g

6

ok 20 g

7

ok 40g

I

MMUNOGLOBULINA

G

O

NIEZNANYM

STĘŻENIU

 

Nr 

próbki 

V próbki 

A

595 

A

465 

1 

10 l 

 

 

2 

l 

 

 

3 

40l 

 

 

4 

60l 

 

 

L

IZOZYM O

NIEZNANYM

STĘŻENIU

Nr 

próbki 

V próbki 

A

595 

A

465 

1 

10 l 

 

 

2 

20l 

 

 

3 

40l 

 

 

4 

60l 

 

 

A

LBUMINA WOŁOWA O

NIEZNANYM

STĘŻENIU

 

Nr 

próbki 

V próbki 

A

595 

A

465 

1 

10 l 

 

 

2 

20l 

 

 

3 

40l 

 

 

4 

60l 

 

 

S

TĘŻENIE BIAŁKA W OBECNOŚCI

SDS

 

Nr 

próbki 

V 

SDS

 

A

595 

A

465 

1 

0 l 

 

 

2 

10l 

 

 

3 

20l 

 

 

4 

50l 

 

 

S

TĘŻENIE BIAŁKA W OBECNOŚCI

N

A

C

L

 

Nr 

próbki 

V 

NaCl

 

A

595 

A

465 

1 

0 l 

 

 

2 

10l 

 

 

3 

20l 

 

 

4 

50l 

 

 

Podpis asystenta