1

WŁASNOŚCI SPEKTRALNE NUKLEOTYDÓW PIRYDYNOWYCH

(NAD

+

, NADP

+

)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ

WSTĘP

Nukleotydy pirydynowe (NAD

+

, NADP

+

) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz przeno-

sząc jony wodorkowe (2e

-

i 1H

+

) (równoważniki redukcyjne) między utlenianym substratem, a

redukowanym akceptorem. Częścią aktywną koenzymów jest pierścień nikotynoamidowy (Ryc. 1)

Ryc. 1. Amid kwasu nikotynowego i dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, forma zredukowana

Przedstawiona na ryc. 2 forma przechodzących w siebie utlenionych struktur koenzymu NAD

+

(NADP

+

) ma w położeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom

węgla. W to miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy NADH

(NADPH). Ponieważ jednocześnie uwalniany jest proton, zredukowane koenzymy nukleotydu

pirydynowego poprawnie powinny być zapisywane jako NADH + H

+

(NADPH+ H

+

).

Ryc. 2. Formy utlenione amidu kwasu nikotynowego i przyłączenie jonu wodorkowego

2

Własności spektralne utlenionych i zredukowanych form nukleotydów pirydynowych (różnice w

widmie absorpcyjnym) są często wykorzystywane w analityce biochemicznej, np.:

1, stosując odpowiedni substrat można oznaczyć aktywność specyficznej względem niego dehy-

drogenazy na podstawie ilości zredukowanego koenzymu powstałego zgodnie z reakcją:

AH

2

+ NAD

+

⇔

A + NADH +H

+

(NADP

+

) (NADPH + H

+

)

2, stosując określoną oczyszczoną dehydrogenazę lub odpowiedni układ enzymatyczny można

oznaczać małe ilości metabolitów selektywnie utlenianych lub redukowanych przez te enzymy z

równoczesnym wytworzeniem stechiometrycznych ilości zredukowanego (utlenionego) koenzy-

mu. Przykładem takich sprzężonych reakcji jest układ używany do oznaczania ATP lub glukozy:

ATP + glukoza ⇒ ADP + glukozo-6-fosforan

glukozo-6-fosforan + NADP

+

⇒ 6-fosfoglukonolakton + NADPH +H

+

Możliwości szerokiego wykorzystania nukleotydów pirydynowych w analityce wynikają z ich

specyficznych właściwości:

-

zredukowane formy koenzymów wykazują absorbancję w 340 nm; nie wykazują jej formy

utlenione koenzymów

-

zredukowane formy są trwałe w środowisku alkalicznym i wykazują wówczas intensywną

fluorescencję „własną”. Formy utlenione ulegają w takich warunkach natychmiastowej destrukcji.

Zredukowane koenzymy są nietrwałe w środowisku kwaśnym, natomiast utlenione wykazują trwa-

łość w niskim pH. Właściwości te dają możliwość „zniszczenia”, po zakończeniu reakcji, nadmia-

ru koenzymu pozostawiając do pomiaru niezmienioną ilość trwałej w danych warunkach formy

nukleotydu – zredukowanej w środowisku alkalicznym bądź utlenionej w środowisku kwaśnym

-

zarówno zredukowana jak i utleniona postać koezymu powstałego w reakcji może być

przekształcona w silnie fluoryzującą pochodną dzięki czemu można go oznaczać w stężeniach

rzędu 10

-10

– 10

-9

M, co jest szczególnie użyteczne przy oznaczeniu stężeń metabolitów w małych

próbkach tkanek lub w pojedynczych komórkach.

3

A, WYZNACZENIE WIDMA ABSORPCYJNEGO DLA NAD

+

I NADH+H

+

Odczynniki:

•

0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0 i pH 6,5

•

roztwór podstawowy (0,2 mM) NAD

+

w buforze fosforanowym o pH 6,5

•

roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH + H

+

w buforze fosforanowym o pH 9,0

Wykonanie:

Dokonać pomiarów absorbancji 0,1 mM roztworu NAD

+

w zakresie widma 220-440 nm. Pomiary

wykonać w kuwetach kwarcowych względem buforu fosforanowego o pH 6,5.

Podobnych pomiarów dokonać dla 0,1 mM roztworu NADH + H

+

względem buforu o pH 9,0.

Na podstawie wykreślonego widma:

•

obliczyć teoretyczną wartość absorbancji 0,1 mM roztworu NADH + H

+

przy 340 nm wie-

dząc, że molowy współczynnik absorpcji wynosi 6220

•

określić na tej podstawie stopień czystości (%) preparatu NADH + H

+

użytego w doświad-

czeniu

B, WYKONANIE KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ DLA NADH +H

+

METODĄ

SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ

Odczynniki:

•

0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0

•

roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH + H

+

Wykonanie:

Z roztworu podstawowego (0,2 mM) NADH + H

+

, zawierającego 200 nmoli zredukowanego ko-

enzymu w 1 ml, przygotować 6 rozcieńczeń do końcowej objętości 2 ml. Rozcieńczone roztwory

powinny zawierać 20, 40, 60, 80, 100 i 150 nmoli NADH + H

+

w 1 ml roztworu. Do rozcieńczania

używać buforu fosforanowego o pH 9,0. Dokonać pomiarów absorbancji roztworów o rosnącym

stężeniu NADH + H

+

w 340 nm względem buforu używanego do rozcieńczeń.

•

Wykreślić krzywą wzorcową oraz obliczyć współczynnik kierunkowy.

4

C, OZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMINOTRANSFERAZY ALANINOWEJ

Grupa α-aminowa wielu aminokwasów jest przenoszona na α-ketoglutaran w reakcji, której me-

chanizm określany jest jako mechanizm podwójnego przeniesienia (reakcje ping-pong). Cechą

wyróżniającą ten mechanizm katalizy jest istnienie enzymu z podstawioną grupą, a więc pośred-

niej formy enzymu, który uległ czasowej modyfikacji. Tak więc, aminotransferaza alaninowa

katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na α-ketoglutaran, a produktami reakcji są

pirogronian i glutaminian. Po związaniu alaniny do enzymu zostaje z niej usunięta grupa ami-

nową, która jest przeniesiona na fosforan pirydoksalu (PLP)(koenzym aminotransferaz i liaz), a

z aminotransferazy uwalnia się pirogronian. Drugi substrat, α-ketoglutaran, wiąże się do zmody-

fikowanego enzymu i przyjmuje od niego grupę aminową, a następnie zostaje uwolniony jako

produkt reakcji - glutaminian. Na ryc. 3 pokazany jest schemat reakcji podwójnego przeniesie-

nia, a na ryc. 4 mechanizm transaminacji.

Ryc. 3. Schemat reakcji podwójnego przeniesienia katalizowanej przez aminotransferazy

5

Ryc. 4. Mechanizm transaminacji

Powstający w reakcji pirogronian można oznaczać ilościowo zgodnie z poniższą reakcją, używając

oczyszczonej dehydrogenazy mleczanowej

6

Odczynniki:

•

100 mM roztwór buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierający 20 mM α-ketoglutaran

•

350 mM roztwór alaniny w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

•

2,5 mM roztwór NADH + H

+

w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

•

roztwór dehydrogenazy mleczanowej o aktywności około 1,2 jednostki w 100 µl (roztwór

przygotowany w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

Materiał:

Odważyć 1 g niedojrzałych nasion grochu (zielony groszek), przenieść do małego moździerza i

rozetrzeć, najpierw „na sucho”, a potem dodając 1 ml 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0. Dobrze

roztarty materiał przenieś do probówek Eppendorfa i odwirować 5 min przy 15 000 obr./min. Do

oznaczeń używać klarownego nadsączu (supernatantu) rozcieńczonego 5x buforem używanym do

homogenizacji.

Wykonanie:

Do kuwety kwarcowej napipetować 500 µl 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierającego 20

mM α-ketoglutaran, następnie dodać 100 µl roztworu NADH + H

+

, 100 µl dehydrogenazy mle-

czanowej i 100 µl ekstraktu tkankowego (rozcieńczonego nadsączu). Kuwetę umieścić w spektro-

fotometrze i sprawdzić stabilność układu, a następnie reakcję transaminacji zapoczątkować doda-

jąc 200 µl 350 mM roztworu alaniny. Mierzyć spadki absorbancji przy 340 nm przez około 10

min, a następnie policzyć średnią wartość ∆A/min.

•

Obliczyć aktywność aminotransferazy alaninowej wyrażoną jako ilość nmoli pirogronianu

powstałego w reakcji enzymatycznej w ciągu 1 min.