Enzymologia, instrukcja do zajęć laboratoryjnych, ćwiczenie 3

1

Ćwiczenie 3. Preparacja aldolazy z mięśni królika według metody

Taylora

i wsp.

Literatura:
J. E. Taylor, A. A. Green, G.T. Cori (1948)

J.Biol.Chem.

173, 591-604

E. E. Penhoet, M. Kochman, W. J. Rutter (1969)

Biochemistry

8, 4391-4395

oraz literatura podana do ćwiczenia 1.

Odczynniki, szkło i aparatura wykorzystywane przy wykonywaniu ćwiczenia:

•

zamrożone mięśnie królika

•

woda destylowana

•

lód

•

5 % roztwór amoniaku

•

nasycony roztwór siarczanu amonu (sporządzony na poprzednich zajęciach)

•

papierek wskaźnikowy

•

roztwory do oznaczania aktywności aldolazowej:

o

10 mM bufor Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.2

o

100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 2.6 mM siarczan hydrazyny, pH 7.5

o

30 mM FDP

•

wirówka preparatywna Beckman J-21 B, rotor JA-14

•

duże probówki wirówkowe

•

spektrofotometr

•

kuwety pomiarowe

•

zlewki, cylindry, pipety, bagietki

Zadanie 3. Jaką objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu należy dodać do
100 ml 50 % roztworu siarczanu amonu, aby otrzymać 52 % roztwór?


W celu wykonania ćwiczenia 3 niezbędna będzie również instrukcja do ćwiczenia 1.

1.

Zamrożone mięśnie królika (50 g) rozmrozić, pokroić na mniejsze kawałki i

zmielić w maszynce do mięsa.

2.

Następnie do zmielonych mięśni dodać 100 ml wody i mięśnie

zhomogenizować.

3.

Homogenat przenieść do zlewki umieszczonej w łaźni lodowej i mieszając

bagietką, ekstrahować białka przez około 20 min.

4.

Przelać mieszaninę do probówki wirówkowej i zrównoważyć na wadze

względem mieszaniny przygotowanej przez inną grupę ćwiczeniową.
UWAGA! Próbówki wirówkowe należy wytrzeć do sucha przed położeniem na
wadze oraz przed umieszczeniem w rotorze wirówki!

5.

Tkankę oddzielić od roztworu białek (tj. frakcji białek rozpuszczalnych)

poprzez wirowanie mieszaniny w wirówce J-21 B przez 20 min,
13000 obr/min, tj. ok. 17000 x g w temperaturze 2-4

o

C.

Enzymologia, instrukcja do zajęć laboratoryjnych, ćwiczenie 3

2

6.

W tym czasie umyć zlewkę i schłodzić ją wraz z cylindrem miarowym (

ad.

100

ml) w łaźni lodowej.

7.

Uzyskany

po

wirowaniu

mieszaniny

supernatant

przesączyć

do

przygotowanego cylindra miarowego przez lejek zawierający watę szklaną.

8.

Pobrać 0.5 ml przesączu do probówki chemicznej opisanej jako „przesącz 1”,

mieszaninę utrzymywać w obniżonej temperaturze, tj. w łaźni lodowej.

9.

Dwie osoby z grupy przystępują do pomiaru aktywności aldolazy zawartej w

pobranej próbce przesączu (instrukcja do ćwiczenia 1, ale do pomiaru A

280

wziąć 100

µ

l przesączu 1, a do pomiaru A

240

– 50

µ

l rozcieńczonego przesączu

1), natomiast trzecia osoba kontynuuje preparację.

10.

Uzupełnić Tabele 2 i 3.

11.

Odczytać objętość pozostałego w cylindrze przesączu, zanotować wartość w

Tabeli 1.

12.

Przelać przesącz do schłodzonej zlewki i przenieść pod włączony wyciąg, pod

którym powinny znajdować się: 5% roztwór amoniaku, pipeta Pasteura,
papierki uniwersalne.

13.

Zmiareczkować przesącz za pomocą amoniaku do pH 7-7.5, kontrolując ilość

dodanego amoniaku, a jego objętość zapisać w protokole jako V

NH

3

—H

2

O

.

(1 kropla to 50 – 100

µ

l, pojemność pipety Pasteura – 1 ml).

14.

Obliczyć objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu

1

)

(

4

2

4

SO

NH

V

, jaką należy

dodać do zmiareczkowanego przesączu (V

przesączu_1

+ V

NH

3

—H

2

O

), aby uzyskać

50 % jego wysycenia. Wartość wpisać do Tabeli 1.

15.

Do zmiareczkowanego przesączu dodawać małymi porcjami (przez ok. 10 min)

nasycony roztwór siarczanu amonu w objętości

1

)

(

4

2

4

SO

NH

V

. Przesącz powinien

być cały czas trzymany w łaźni lodowej i mieszany bagietką. Co pewien czas
sprawdzać pH mieszaniny i wyrównywać je do poziomu 7-7.5. Korygować w
protokole wartość V

(NH

4

)

2

SO

4

uwzględniając objętość dodawanego amoniaku.

16.

Otrzymaną wysoloną zawiesinę białek mieszać w łaźni lodowej przez 15 min.

17.

Przelać zawiesinę do probówki wirówkowej i zrównoważyć na wadze

względem mieszaniny przygotowanej przez inną grupę ćwiczeniową.
UWAGA! Próbówki wirówkowe należy wytrzeć do sucha przed położeniem na
wadze oraz przed umieszczeniem w rotorze wirówki!

18.

Mieszaniny wirować w wirówce J-21 B przez 25 min, 13000 obr/min, tj. ok.

17000 x g w temperaturze 2-4

o

C.

19.

Uzyskany podczas wirowania supernatant przelać do schłodzonego cylindra

miarowego.

20.

Pobrać 0.5 ml przesączu do probówki chemicznej opisanej jako „przesącz 2”,

mieszaninę utrzymywać w obniżonej temperaturze, tj. w łaźni lodowej.

21.

Dwie osoby z grupy przystępują do pomiaru aktywności aldolazy zawartej w

pobranej próbce przesączu (jak w punkcie 9), a trzecia osoba kontynuuje
preparację.

Enzymologia, instrukcja do zajęć laboratoryjnych, ćwiczenie 3

3

22.

Uzupełnić Tabele 2 i 3.

23.

Odczytać objętość pozostałego w cylindrze przesączu i zanotować wartość w

Tabeli 1.

24.

Przelać przesącz do zlewki schłodzonej w łaźni lodowej.

25.

Policzyć objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu

2

)

(

4

2

4

SO

NH

V

, jaką należy

dodać do otrzymanego przesączu (V

przesączu_2

), aby uzyskać 52 % jego

wysycenia. Wartość wpisać do Tabeli 1.

26.

Do zmiareczkowanego przesączu dodawać małymi porcjami (przez ok. 10 min)

nasycony roztwór siarczanu amonu w objętości

2

)

(

4

2

4

SO

NH

V

. Przesącz powinien

być cały czas trzymany w łaźni lodowej i mieszany bagietką. Co pewien czas
sprawdzać pH mieszaniny i wyrównywać je do poziomu 7-7.5. Korygować w
protokole wartość V

(NH

4

)

2

SO

4

uwzględniając objętość dodawanego amoniaku.

27.

Otrzymaną mieszaninę pozostawić do krystalizacji, która będzie przebiegać w

temperaturze ~5

o

C przez tydzień.

Tabela 1.

V

przesączu_1

1

)

(

4

2

4

SO

NH

V

V

przesączu_2

2

)

(

4

2

4

SO

NH

V

Tabela 2. Obliczenia

dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych.

2

1

→

V

[

µ

l]

A

280

2

bialek

C

[mg/ml]

3

2

→

V

[

µ

l]

p

A

240

k

A

240

∆

A

240

∆

t

[min.]

3

ald

Akt

[U/ml]

3

tot

Akt

[U]

przesącz 1

przesącz 2

Tabela 3.

Obliczenia dla pobranych próbek przesączu.

1

bialek

C

[mg/ml]

1
ald

Akt

[U/ml]

1
tot

Akt

[U]

Całkowita masa białek

1
bialek

m

[g]

Wydajność preparacji

[%]

przesącz 1

przesącz 2