WICZENIE

5

K

INETYKA

E

NZYMÓW

Wyci g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych

Kwas octowy – C

Triton X-100 – Xn, Rakotw. kat.3

Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten dla N-acetylo-ββββ-D-glukozaminidazy

ze linianek szczura

N-acetylo-

β-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wi zanie β-N-acetyloglukoz-

aminylowe (na nieredukuj cym ko cu ła cucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak

kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywno ci acetylo-

glukozaminidazy stosuje si substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-

we.

O

NO

2

O

CH

2

OH

O

OH

NHAc

O

CH

2

OH

OH

HO

NHAc

OH

NO

2

HO

H

2

O

+

p-nitrofenylo-N-acetylo-

β

-D-glukozamina

p-nitrofenol

N-acetylo-

β

-D-glukozamina

Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci
fali

λ = 405 nm.

Bufor do reakcji enzymatycznej:

st enie ko cowe ilo

58 mM kwas cytrynowy

1,520 g

41 mM NaH

2

PO

4

0,707 g

100 ml, doprowadzi przy u yciu

0,1% Triton X-100

0,1 ml

NaOH do pH 4.2

Substrat:
p-nitrofenylo-N-acetylo-

β-D-glukozamina

2 mg/ml buforu

Stoper:

0,4 M glicyna – NaOH pH 10.7

Wykonanie:

Przygotowa kolejne rozcie czenia wyj ciowego roztworu substratu o st eniu 2mg/ml – w
tym celu pobra do oddzielnej probówki 200

µl wyj ciowego roztworu substratu i uzupełni

buforem do obj to ci 400

µl. Cało wymiesza . Z tak przygotowanego rozcie czenia pobra

obj to 200

µl i uzupełni buforem do obj to ci 400 µl. Otrzymany roztwór wymiesza .

Post powa analogicznie, a do otrzymania 5 kolejnych rozcie cze .
Do pi ciu oddzielnych probówek odpipetowa po: 600

µl buforu i 180 µl homogenatu.

Nast pnie do ka dej mieszaniny doda substratu o innym st eniu w ilo ci 180

µl.

Wymiesza . Mieszaniny inkubowa w temp. 37

°C i po czasie 1, 2, 4, 6 i 8 min pobiera po

160

µl mieszaniny i przenosi do uprzednio przygotowanych probówek zawieraj cych 0.5 ml

stopera. Absorbancj powstałego produktu zmierzy wobec lepych odczynnikowych
(przygotowanych dla ka dego st enia substratu) przy długo ci fali

λ = 405 nm w

spektrofotometrze Bio-Rad. lepe odczynnikowe przygotowa nast puj co: do pi ciu
kolejnych probówek odpipetowa po 130

µl buforu i 30 µl odpowiedniego st enia substratu,

inkubowa w temp. 37

°C przez 5 min, a nast pnie zatrzyma reakcje dodaj c po 0,5 ml

stopera. Mno c warto absorbancji przez stał k = 1007 otrzymujemy st enie rozło onego

substratu/powstałego produktu w nmol/ml. Masa 1 mola substratu = 342.3 g.

Opracowanie wyników:

Dla ka dego z u ytych st e substratu

s wykre li krzywe kinetyczne wyra aj ce zale no

przyrostu produktu

c od czasu inkubacji t. Znale graficzne szybko ci pocz tkowe V

0

i po

sporz dzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczy graficznie warto ci

K

m

i

V

max

.

s = 0,125 (mg/ml) =

(mmol/l)

nr

próbki

A

405

c

(

µM)

t

(min)

v

0

(

µM/min)

1/v

0

(min/

µM)

1/s

(1/mM)

K

m

(mM)

V

max

(

µM/min)

1

1

2

2

3

4

4

6

5

8

s = 0,250 (mg/ml) =

(mmol/l)

6

1

7

2

8

4

9

6

10

8

s = 0,500 (mg/ml) =

(mmol/l)

11

1

12

2

13

4

14

6

15

8

s = 1,000 (mg/ml) =

(mmol/l)

16

1

17

2

18

4

19

6

20

8

s = 2,000 (mg/ml) =

(mmol/l)

21

1

22

2

23

4

24

6

25

8

Oznaczanie aktywno ci trypsyny na substracie syntetycznym – wpływ pH i

temperatury na aktywno enzymatyczn .

Trypsyna (EC 3.4.21.4; enzym proteolityczny soku trzustkowego, endopeptydaza z klasy

hydrolaz) katalizuje m.in. reakcj hydrolizy wi za peptydowych, utworzonych przez grupy

karboksylowe argininy (Arg) lub lizyny (Lys), w ła cuchu polipeptydów i białek.

Trypsyna katalizuje równie hydroliz wi zania estrowego czy amidowego w substratach

syntetycznych b d cych pochodnymi Arg lub Lys. Je li substratem jest benzoilo-L-argininy

p-nitroanilid (BAPNA) to po reakcji hydrolizy uwalnia si wolna p-nitroanilina, która
wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci fali

λ = 405 nm.

trypsin

H

2

O

H

2

N

NO

2

C

NH

2

+

Cl

-

COOH

C

NH

CH

(CH

2

)

3

NH

2

C

NH

2

+

Cl

-

NO

2

C

NH

C

NH

CH

(CH

2

)

3

NH

2

+

BAPNA (bezbarwny)

p-nitroanilina (zólty)

Wykonanie:

1. Do jednej probówki odpipetowa 100

µl roztworu trypsyny roboczej a do drugiej

100

µl 1 mM HCl. Do obu probówek doda po 1 ml 0,2 M buforu Tris-HCl o pH 8,0 i

po 20

µl roztworu substratu BAPNA. Wymiesza i inkubowa 15 min w temp. 37°C.

Reakcj zatrzyma dodaj c 100

µl st onego kwasu octowego i zmierzy , wzgl dem

wody destylowanej, absorbancj powstałej p-nitroaniliny przy długo ci fali

λ = 405

nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Oceni przydatno metody.

2. Do siedmiu probówek odpipetowa po 100

µl roboczego roztworu trypsyny, a do

ósmej 100

µl 1 mM HCl. Do siedmiu pierwszych probówek doda po 1 ml buforów o

pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, a do ostatniej probówki doda 1 ml buforu o pH 7. Nast pnie do
ka dej probówki doda po 20

µl substratu BAPNA i inkubow w temp. 37°C przez 15

min. Reakcje zatrzyma dodaj c po 100

µl st onego kwasu octowego i dokona

pomiaru absorbancji wzgl dem próby lepej (ósma probówka) przy długo ci fali

λ =

405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad.

Opracowanie wyników:

Wykre li wykres zale no ci aktywno ci wła ciwej od pH roztworu i wyznaczy

optimum działania trypsyny dla BAPNA jako substratu, przyjmuj c jako jednostk

aktywno ci przyrost absorbancji o 0,1 w warunkach do wiadczenia. Aktywno wła ciwa

to ilo jednostek aktywno ci przypadaj ca na 1 mg enzymu.

pH A (405 nm) Aktywo enzymatyczna

U (

µmol/min)

Aktywno wła ciwa

U/mg

4

5

6

7

8

9

10

3. Do pi ciu probówek odpipetowa po 50

µl roboczego roztworu trypsyny a do szóstej

probówki 50

µl 1 mM HCl. Nast pnie do wszystkich probówek doda po 1 ml 0,2 M

buforu Tris-HCl o pH 8,0 i po 20

µl roztworu substratu BAPNA. Wymiesza i

inkubowa 30 min w temp. 0, 25, 37, 48 i 60

°C. Reakcj zatrzyma dodaj c po 100 µl

st onego kwasu octowego i zmierzy absorbancj wzgl dem próby lepej (szósta
probówka) przy długo ci fali

λ = 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad.

Opracowanie wyników:

Wykre li wykres zale no ci aktywno ci wła ciwej trypsyny od temperatury inkubacji.

Przedyskutowa wyniki.

Temp.

(

°C)

A (405 nm) Aktywo enzymatyczna

U (

µmol/min)

Aktywno wła ciwa

U/mg

0

25

37

48

60

Odczynniki:

0,01 mM trypsyna (2,4 mg trypsyny w 10 ml 1 mM HCl) – przechowywana w lodzie.

Roztwór trypsyny roboczej – rozcie czy trypsyn 10 razy przy pomocy 1 mM HCl tzn.
odpipetowa 100

µl wyj ciowego roztworu trypsyny i doda 900 µl 1 mM HCl. Roztwór

roboczy enzymu przechowywa w lodzie. Substrat – 25 mM benzoilo-L-argininy p-

nitroanilid (BAPNA) w dimetylosulfotlenku (DMSO) (11 mg/ml). St ony kwas octowy

do przerywania reakcji enzymatycznej. Bufory: 0,2 M Tris-HCl o pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10.

Materiały i sprz t laboratoryjny:

pipety automatyczne, termostatowana ła nia wodna, spekrofotometr, probówki, lód

Literatura:

1) B.D. Hames, N.M.Hooper: „Krótkie wykłady. Biochemia” (red. J. Michajda, A.

Augustyniak, K. Ziemnicki), Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2004, str. 95-

104.

2) „Techniki bada fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 78-79.