Oczyszczanie enzymów

CHROMATOGRAFIA

Michaił Siemionowicz Cwiet / na rysunku obok/

rosyjski botanik i chemik pracował na początku

XX wieku na Uniwersytecie Warszawskim, a

później na Politechnice Warszawskiej, i właśnie tu

w 1905 roku opracował metodę rozdziału

substancji chemicznych, którą nazwał

CHROMATOGRAFIĄ. Cwiet uzyskał rozdzielenie

pigmentów roślinnych, w tym chlorofilu,

wyodrębniając je na podstawie ich różnych barw

(z greckiego chromatos = kolor). Dzisiaj termin

chromatografia używany jest do opisania

wszystkich procesów, w których rozdzielenie

mieszaniny substancji na poszczególne składniki

następuje w wyniku różnej prędkości ich migracji.

Typy chromatografii stosowane w

biotechnologii enzymatycznej:



Chromatografia żelowa /zwana również filtracją żelową,

chromatografią rozmiarów wykluczających, czy sączeniem

molekularnym/ – rozdział następuje w wyniku różnicy w rozmiarach

cząsteczek enzymu



Chromatografia jonowymienna – rozdział następuje w wyniku

różnicy w ładunku wypadkowym odmiennych cząsteczek enzymu



Chromatografia powinowactwa – rozdział następuje w wyniku różnic

powinowactwa enzymów do specyficznych grup chemicznych

Chromatografia na drodze filtracji żelowej.

W filtracji żelowej:



Kryterium rozdziału

makrocząsteczek jest

ich wielkość;



Większe cząsteczki

wymywane są z

kolumny jako pierwsze;



Mniejsze cząsteczki

wymywane są z

kolumny jako ostatnie.

Ważne pojęcia:



Eluent – rozpuszczalnik stosowany do wymywania (elucji)
składników mieszaniny z kolumny chromatograficznej;



Eluat – roztwór wypływający z kolumny chromatograficznej,
czyli eluent wraz z rozpuszczonymi w nim składnikami
rozdzielanej chromatograficznie mieszaniny.

Wypełnienia do filtracji żelowej różnią stopniem usieciowania,
co prowadzi do odmiennej porowatości, a co za tym idzie, innego
zakresu działania dla różnych objętościowo enzymów.
Do najbardziej popularnych i odpowiadających szerokiemu

zakresowi

działania należą wypełnienia o nazwach handlowych:

Sephadex – dekstran poprzecznie sieciowany z epichlorohydryną
w warunkach alkalicznych;
Sephacryl – allilodekstran sieciowany N,N’ -

metylenobisakrylamidem

Przykłady wypełnień do filtracji żelowej

:

Nazwa handlowa

(producent)

Rodzaj wypełnienia

Zakres M

cz

(Da)

Biogel (Bio-Rad)

Ultrogele (LKB)

Fractogel (Merck)

Sephadex

(Pharmacia)

Sepharose

(Pharmacia)

Sephacryl

(Pharmacia)

Glycophase (Pierce)

poliakrylamid (typ P)

agaroza (typ A)

agaroza/poliakrylamid

agaroza

polimery winylowe

(różne rodzaje)

dekstran (różne

rodzaje)

agaroza

sieciowana agaroza

sefakryl/ bisakrylamid

powierzchnia

z modyfikowanego szkła

100 – 400 000

1 000 – 150 x 10

6

60 000 – 1,3 x

10

6

25 000 – 20 x 10

6

100 – 50 x 10

6

50 – 600 000

10 000 – 40 x 10

6

10 000 – 40 x 10

6

5 000 – 1 x 10

6

1 000 – 350 000

Chromatografia jonowymienna.

W chromatografii

jonowymiennej:



Kryterium rozdziału jest
ładunek wypadkowy
odmiennych cząstek
enzymów



Wyróżniamy kolumny
anionitowe (wymieniacze
anionów) i kationitowe
(wymieniacze kationów)



Kationity najczęściej
zawierają grupy – SO

3

H, –

COOH, – OH, – PO

3

H

2



Anionity zawierają grupy
NH

3+

Cl

-

oraz (-CH

2

-N

+

(CH

3

)

3

-

☺Białka naładowane ujemnie (białka anionowe) można rozdzielać

chromatograficznie na kolumnach wypełnionych dodatnio
naładowaną dietyloamnioetylocelulozą (DEAE-celulozą).

☺Białka naładowane dodatnio można rozdzielać na kolumnie z

ujemnie naładowaną karboksymetylocelulozą (CM-celulozą).

Chromatografia powinowactwa

.

W chromatografii powinowactwa:



Oczyszczany enzym jest specyficznie i
odwracalnie adsorbowany na efektorze
połączonym z nierozpuszczalną matrycą



Efektorami mogą być:



Analogi substratów



Inhibitory enzymów



Barwniki



Chelaty metali



Przeciwciała

K R Y S T A L I Z A C J A

K R Y S T A L I Z A C J A

Nagroda Nobla w dziedzinie chemii

James Summer (USA)

Hohn Northrop (USA)

Wendell Stanley (USA)

Otrzymywanie czystych enzymów i krystalizacja enzymów

Otrzymywanie czystych enzymów i krystalizacja enzymów



jedna z najdawniej stosowanych technologii oczyszczania

produktu, była kiedyś w stanie całkowicie zaspokoić

zapotrzebowania producentów i odbiorców



teoria i historia krystalizacji białek jest dobrze

udokumentowana już od ponad 100 lat



do substancji o małej masie, czyli do małych, globularnych

białek

Cele procesu krystalizacji



tworzy warunki do określenia struktury krystalograficznej

(morfologicznej) enzymu



służy uzyskiwaniu gotowego enzymu jako produktu

handlowego na rynku



umożliwia również świadome, planowe projektowanie

nowych leków

Metody krystalizacji enzymów

masowa (wielkoskalowa) fermentacja

agregacja pod wpływem soli

masowa (wielkoskalowa) fermentacja



izomeraza glukozy



subtylizyna



oksydaza alkoholowa



celulaza

Przykłady enzymów poddawanych

procesowi krystalizacji właśnie tą metodą

fermentac
ja

separacja

komórek

ultrafiltra
cja

zatężanie

krystalizacj
a

kryształ
zaszczepiając
y

sól

prasa
filtracyjna

produkt
końcowy

woda do
przemywania rozpuszczalnik

ług odpadkowy

Etapy procesu krystalizacji jednego z
enzymów używanych w przemyśle

Warunki podczas krystalizacji

enzymu na przemysłową

skalę



czystość produktu



korzystna wydajność procesu



łatwość uzyskiwania kryształów enzymów



możliwie najkrótszy czas trwania procesu

W rezultacie otrzymujemy kryształ enzymu o

regularnych kształtach, rozmiarze i żądanej

morfologii. 

Czynniki mające wpływ na

proces krystalizacji enzymów



stopień zasolenia



stężenie



wartość pH



temperatura



ciągle zmieniająca się obecność domieszek
i zanieczyszczeń różnego typu



mieszanie



obecność zarodków krystalizacji

Kontrola podczas całości

trwania procesu poprzez



środek strącający taki jak np. sól



temperatura



wartość pH



Enzymy tj. m.in. celulaza

oraz subtylizyna były już

sprawdzane w krystalizacji

w warunkach wyższego

tempa wzrostu

temperatury

.



Zarysowywuje się tutaj

znaczny wpływ

temperatury prowadzenia

procesu na otrzymywanie

konkretnej morfologii

danego kryształu.

Zmiana warunków krystalizacji podczas

trwania tegoż procesu, prowadzi do wzrostu

kryształu, osiągając jego przeróżne formy

morfologiczne

S u b t y l i z y n a



bioaktywny enzym typu proteaz
(enzymy z grupy hydrolaz, które
dokonują hydrolizy wiązań
peptydowych) o skutecznym działaniu
keratolitycznym



stabilizowana z wykorzystaniem
nowoczesnych technik krystalizacji jest
odporna na rozkład hydrolityczny



dzięki specjalnemu, skomplikowanemu
procesowi (krystalizacji i pokrywania),
enzym ulega stabilizacji, umieszczony
w zapewniającym wilgoć środowisku
żelowym, pozostaje nieaktywny. Z
chwilą nałożenia żelu na skórę,
odzyskuje aktywność i rozpuszcza
materiał organiczny zalegający między
martwymi komórkami skórnymi

.

agregacja pod wpływem soli

(*)

(*)

Badania naukowe dla Ministerstwa Nauki i Informatyzacji (W-wa), prowadzone przez

Instytut Chemii Fizycznej PAN (W-wa), „Kalorymetryczne badania odddzływań białek z

elektrolitami” r.2004.



podanie termodynamicznej charakterystyki procesu wsalania

(salting-in) i wysalania (salting-out), dla białek (lizozym,

albumina) przy użyciu jedno- i dwuwartościowych soli.



wyznaczenie entalpii wsalania tych białek przy różnych
stężeniach stosowanych soli



wyznaczenie stałe równowagi



określenie zależności liczby miejsc wiążących jony na
powierzchni badanego białka, od stężenia soli



określenie stężenie białek i różnych jonów (Na

+

, K

+

, Li

+

, NH

4+

,

Mg

2+

, Cl

-

, SO

42-

), charakterystyczne dla rozpoczęcia procesu

agregacji



podanie korelację tych danych z szeregiem Hofmeistera



określenie entalpowych współczynników oddziaływań
McMillana-Mayera charakterystyczne dla procesu wsalania
jak i wysalania (lizozym-sól, lizozym-lizozym)



wskazanie zgodnie przebieg zmian entalpii wysalania i
pozornych molowych objętości wraz ze zmianą stężenia
stosowanych soli



w kinetycznych badaniach przy użyciu metody rozpraszania
światła (Dynamic Light Scattering) NMR, wskazano istnienie
zależności procesu aglomeracji białek od czasu

Są to pierwsze przeprowadzone w tak szerokim

zakresie badania termodynamiczne procesów

wsalania i wysalania małych, globularnych białek.

Bazy danych zawierające informacje dotyczące

warunków krystalizacji białek

Crystal TB (Online Bio Database)

http://www.fqs.pl/?a=product_view&id=41

Chemiczna analiza procesu oczyszczania

enzymu,

KONTROLA PROCESU OCZYSZCZANIA



Masa cząsteczkowa –

Elektroforeza na żelu,

pozwala na ocenę

mobilności mieszaniny w

zależności od ciężaru

cząsteczkowego (pH>7)



Western Blotting –

Prowadzona również

elektroforeza, ale do

wizualizacji są

wykorzystywane

przeciwciała (udział

kofaktorów)

E L E K T R O F O R E Z A

E L E K T R O F O R E Z A

Cele procesu elektroforezy



służy do izolacji oczyszczonych enzymów w skali
laboratoryjnej

Wykorzystywane procedury

elektroforeza strefowa

izotachoforeza

porowatość gradientowa

Proces elektroforezy

elektroforeza strefowa

Strefowa elektroforeza kapilarna (ang. CZE) to najprostsza i

najczęściej stosowana technika w której mechanizm

separacji opiera się na różnicy w stosunku ładunku do

masy cząsteczek. Stosowania najczęściej do protein,

peptydów i leków.

izotachoforeza

Podstatawowa różnica pomiędzy elektroforeza kapilarną a

izotachoforezą, tkwi w sposobie realizacji rozdzielania
substancji w polu elektrycznym.
W elektroforezie strefowej stosowany
jest jeden elektrolit wypełniający cały układ analityczny, zaś
w izotachoforezie wykorzystuje się różne układy buforowe.

M E T O D Y

M E T O D Y

M E M B R A N O W E

M E M B R A N O W E

Selektywne membrany



zagęszczanie mleka,
serwatki, soków owocowych
i warzywnych



oczyszczanie i zagęszczanie
koncentratów białek, np. jaj



oczyszczanie i zagęszczanie
preparatów po ultrafiltracji
(produkcja enzymów,
antybiotyków, koncentratów
białek)



koncentracja i oczyszczanie
enzymów, antybiotyków

Zastosowania metod

membranowych



do odsalania roztworu

Wykorzystywane techniki

Diafiltracja

–

– stężenie zanieczyszczeń spada dzięki filtracji

wody

Dializa

–

– zanieczyszczenia na zasadzie dyfuzji przenikają do

czystego rozpuszczalnika jakim jest woda

Elektroliza

–

– wykorzystuje ruchy jonów w polu elektrycznym

F O R M U Ł O W A N I E

F O R M U Ł O W A N I E

P R O D U K T U

P R O D U K T U

Unikanie i zminimalizowanie

strat aktywności enzymu,

podczas



transportu



przechowywania



użytkowania danego preparatu enzymatycznego

Polepszanie stabilności poprzez

przeciwdziałanie głównym

przyczynom dezaktywacji

enzymów



denaturacja



proteoliza

Unikanie dezaktywacji poprzez



dodanie odwracalnego inhibitora



unikanie warunków utleniających



unikanie obecności aktywnych gatunków

( org. mikrobiologicznych) z gotowego preparatu

enzymatycznego

Produkt powinien być

zabezpieczony przed

kontaminacją, poprzez



unikanie powstawania osadów lub formowaniu się mgiełek

(zamgleń)



minimalizacja powstawania drobinek pyłu lub aerozoli



optymalizacja kryteriów estetycznych, takich jak kolor i

zapach

Procesy używane do usunięcia

domieszek i nieczystości

odpowiedzialnych za m.in.

wytrącanie osadów



diafiltracja



adsorpcja



chromatografia



krystalizacja



ekstrakcja

Procesy produkcji najbardziej

odpornych na ścieranie granulek



zaawansowane ścinanie powierzchni granulek do bardziej

gładkiej



pokrywanie sprayem złoża zawiesinowego

Unieszkodliwianie odpadów

Pozostałości po procesach oczyszczania muszą być wcześniej

unieszkodliwiane, chemicznie lub termicznie dezaktywowane, aby

zapewnić pewną sytuację iż żywe mikroorganizmy nie dostaną się

do środowiska, co może spowodować ich niebezpieczne

gromadzenie się.

B i b l i o g r a f i a

B i b l i o g r a f i a

1.

Enzymes in industry. Production and
Applications; Wolfgang Aehle; WILEY-VCH 2004

2.

Enzyme Biotechnology ; Alan Wiseman ; ELIS
HORWOOD LTD. 1975

3.

Biochemia ; Lubert Stryer ; PWN 1999 r.