Badanie obecności

endotoksyn

bakteryjnych

Test LAL

Test LAL

Test LAL jest polecany przez FP (FPVII
t.I; 2.6.14)
Przeznaczony jest do

wykrywania in

vitro obecności lub określania
zawartości

endotoksyn

w

preparatach leczniczych do
stosowania pozajelitowego oraz
niektórych materiałach medycznych

Zasada testu LAL

Test opiera się na zastosowaniu
lizatu amebocytów skrzypłocza

Limulus polyphemus

lub

Tachypleus tridentatus

do

wykrywania lub oznaczania
zawartości endotoksyn bakterii
Gram-ujemnych

Historia powstania

testu



W 1956 roku Bang opublikował

informację, że infekcja Limulus

polyphemus bakteriami Gram-

ujemnymi prowadzi do zakrzepu

wewnątrznaczyniowego



Wykazano, że zakrzep jest

wynikiem reakcji pomiędzy

endotoksyną i białkiem

skrzepującym w krążących

amebocytach kraba



Dokładniej:

endotoksyna

aktywuje proenzym do

koagulazy, która

przeprowadza koagulogen

w koagulinę

Skrzypłocze

(mieczogony)



Stawonogi z rzędu ostrogonów



Żywe skamieliny – żyją od ok.

350 mln lat



Występują w Oceanie

Atlantyckim u wybrzeży Ameryki

Północnej i Środkowej oraz przy

azjatyckich brzegach Pacyfiku



Długość 60 - 90 cm, kształt

podkowiastej tarczy



W wodzie poruszają się

zwrócone częścią grzbietową w

dół



Samice składają do piasku na

brzegu oceanu jaja, które

natychmiast są zapładniane

przez samce.



Osiągają dojrzałość płciową w

wieku ok. 10 lat

Występowanie różnych

gatunków skrzypłoczy

Obszar

serca

Osierdzie

Oczy

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

„Arystokratyczną” krew skrzypłocze zawdzięczają

hemocyjaninie

Błękitna
krew

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Każdego kraba

Każdego kraba

nakłuwa się

nakłuwa się

nową igłą i

nową igłą i

krew zbiera do

krew zbiera do

pojemnika

pojemnika

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Amebocyt

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Kraby po skrwawianiu

Kraby po skrwawianiu

Przygotowywanie lizatu

amebocytów skrzypłocza

Powrót do domu

Powrót do domu

Metody badania

endotoksyn bakteryjnych



Metoda żelowa



Badanie graniczne



Badanie półilościowe



Metoda zmętnieniowa
(turbidymetryczna)



Metoda chromogenna

W razie wątpliwości wynik badania
granicznego metodą żelową ma znaczenie
rozstrzygające

Metody badania

endotoksyn bakteryjnych



Metoda zmętnieniowa (turbidymetryczna

)

Polega na fotometrycznym pomiarze wzrostu
zmętnienia w wyniku rozszczepienia
endogennego substratu (wynik reakcji
endotoksyn z lizatem)



Metoda chromogenna

Polega na fotometrycznym pomiarze ilości
chromoforu uwolnionego z odpowiedniego
chromogennego peptydu w wyniku reakcji
endotoksyn z lizatem

Metody badania

endotoksyn bakteryjnych

Metoda zmętnieniowa i chromogenna
mogą być wykonywane w 2 wariantach:



pomiar punktu końcowego

-

największego rozcieńczenia preparatu
dającego wynik dodatni



pomiar kinetyczny

– pomiar czasu

potrzebnego do uzyskania określonego
zmętnienia lub zabarwienia

Odczynniki



Aparatura i szkło- nowe końcówki do pipet

lub szkło autoklawowane co najmniej 30 min

w temp. 250

ºC



Lizat amebocytów o określonej czułości λ

Najczęściej dostępne są lizaty o następującej czułości:
0,250 EU/ml; 0,125 EU/ml; 0,06 EU/ml i 0,03 EU/ml

Czułość lizatu określa granicę detekcji testu.

Jest to najmniejsze stężenie endotoksyn, jakie
można wykryć za pomocą użytego lizatu

Odczynniki



Standardowa Endotoksyna Kontrolna
(CSE), której moc określono na podstawie
Referencyjnej Endotoksyny Standardowej (RSE)
FDA oraz partii lizatu stanowiącego element
zestawu

Endotoksynę oczyszcza się zazwyczaj z
E.coli



Woda LRW (LAL Reagent Water)

Nie wywołuje żelowania rozpuszczonego lizatu po 24 h
inkubacji w 37°C

Test żelowy - zasada

Technika żelowa umożliwia wykrycie lub
oznaczenie zawartości endotoksyn i
polega

na krzepnięciu lizatu w obecności endotoksyn

Wykonanie oznaczenia zawartości
endotoksyn polega na

:



sporządzeniu serii 2-krotnych rozcieńczeń
badanego preparatu,



określeniu punktu końcowego – największego
rozcieńczenia preparatu dającego wynik
dodatni

.

Test żelowy – etapy

badania

1.

Przygotowanie roztworu podstawowego
oraz odpowiednich rozcieńczeń
endotoksyny wzorcowej

2.

Przygotowanie roztworów badanych –
rozpuszczenie i/lub rozcieńczenie wodą LAL

pH badanej próby powinno zawierać się w

zakresie od 6,0 – 8,0

Test żelowy – etapy badania

- cd.

3.

Określanie granicznej zawartości endotoksyn



Określona w monografii FP



Obliczona na podstawie największej dawki
leczniczej, zgodnie ze wzorem K/M

K = progowa dawka endotoksyny/kg masy ciała/1 h
K = 5,0 EU/kg m.c./1 h przy podaniu pozajelitowym oraz

0,2 EU/kg m.c./1 h przy podaniu dooponowym

M = najwyższa zalecana dawka leku/kg masy ciała/1 h

Test żelowy – etapy

badania- cd.

4.

Określanie Największego Dopuszczalnego
Rozcieńczenia (NDR) - maksymalne rozcieńczenie
próbki, w którym możliwe jest oznaczenie
granicznej zawartości endotoksyn

graniczna zawartość endotoksyn

x C

NDR = ————————————————

λ

gdzie:

C – stężenie badanego roztworu

graniczna zawartość endotoksyn w substancji czynnej stosowanej

pozajelitowo zależy od jej dawkowania i jest wyrażona wzorem K / M;

K- progowa dawka gorączkotwórcza endotoksyny w przeliczeniu na kg masy

ciała zastosowana do 1 godz

M- najwyższa zalecana dawka lecznicza produktu w przeliczeniu na kg masy

ciała zastosowana w czasie do 1 godz

Test żelowy – etapy

badania-cd

5.

Badania walidacyjne



Potwierdzenie deklarowanej czułości lizatu

Wymagane gdy:

1.

zastosowano nową serię lizatu

2.

wprowadzono zmianę w warunkach oznaczeń

Bada się 4 stężenia endotoksyny
odpowiadające 2λ, λ, 0,5 λ i 0,25 λ. Czułość
lizatu powinna się mieścić w zakresie 0,5 – 2
λ

Test żelowy – etapy

badania-cd

5.

Badania walidacyjne – cd.



Badanie obecności czynników
interferujących w próbce:

1.

Do badania używa się roztwory badane
niezawierające wykrywalnych endotoksyn
w rozcieńczeniach niższych niż NDR,

2.

Dodaje się do nich endotoksynę w stężeniu
odpowiadającym 2λ, λ, 0,5 λ i 0,25 λ.
Oznaczenie musi potwierdzać deklarowaną
czułość lizatu

Test żelowy – etapy

badania-cd

5.

Badania walidacyjne – cd.



Postępowanie w razie stwierdzenia
czynników interferujących



zastosować większe rozcieńczenie, ale mniejsze
niż NDR



zastosować bardziej czuły lizat – zapewni to
możliwość większego rozcieńczania



ultrafiltracja, neutralizacja, dializa, inaktywacja
termiczna – metody te muszą być zwalidowane
m.in. należy sprawdzić czy postępowanie nie
usuwa endotoksyn

Test żelowy - wykonanie

Każde oznaczenie powinno zawierać w
dwóch powtórzeniach:

1.

Próbę badaną – preparat + lizat

2.

Kontrolę ujemną – woda LAL + lizat

3.

Kontrolę dodatnia – endotosyna 2λ +
lizat

4.

Kontrolę dodatnią produktu – preparat
+ endotosyna 2λ + lizat

Test żelowy – wykonanie –

cd.



100 μl badanego roztworu zmieszać ze

100 μl lizatu i inkubować 60min ± 2 min
w 37 ± 1°C



Po inkubacji wyjąć probówki z
inkubatora i obrócić ostrożnie o 180°



Powstanie spoistego żelu
przylegającego do dna probówki po jej
odwróceniu oznacza wynik dodatni

Test żelowy – wykonanie –

cd.



Obliczanie zawartości endotoksyn

Należy pomnożyć deklarowaną czułość

lizatu przez wartość największego
rozcieńczenia dającego wynik dodatni

Dziękuję z uwagę