Wykład 9

Markery genetyczne – grupy krwi,
cd.
Polimorfizm DNA

Grupy krwi

• Białko może mieć więcej niż jedną determinantę

antygenową

• Allel może być odpowiedzialny za powstanie białka

o kilku determinantach antygenowych

• W teście serologicznym wykrywana jest

determinanta antygenowa, przy pomocy

monoklonalnej surowicy testowej (przeciwciała

skierowane przeciw jednej determinancie

antygenowej)

• Fenogrupa

to zespół antygenów dziedziczących

się łącznie, czyli determinowanych przez jeden allel

Fenogrupa

• Zespół antygenów dziedziczących się łącznie,

czyli determinowanych genetycznie przez

jeden

allel

Formy polimorficzne białka A, które posiadają różne
determinanty antygenowe (A

a

, A

b

, A

c

, A

-

)

A

a

A

b

A

a

A

b

A

c

A

-

Fenogrupy: A

ab

A

abc

A

-

(allele)

Anty-A

a

Anty-
A

b

Anty-
A

a

Anty-A

b

Anty-A

c

Brak surowicy

Fenogrupy (allele), fenotypy i genotypy

Badania serologiczne układu grupowego H świń
wykazały obecność determinant antygenowych:
Ha oraz Hb.

Jaki genotyp ma badany osobnik w locus H?

Fenotyp: Ha, Hb

Możliwe fenogrupy: H

a

, H

b

, H

ab.

, H

-

Możliwe genotypy: H

a

H

b

, H

ab

H

a

, H

ab

H

b

, H

ab

H

-

, H

ab

H

ab

Allozymy i izoenzymy

• Allozymy

– warianty polimorficzne tego samego białka

(warunkowane przez serię alleli wielokrotnych)

• Izoenzymy

– enzymy katalizujące tę samą reakcję

biochemiczną, ale różniące się strukturą
pierwszorzędową, właściwościami fizycznymi,
parametrami kinetycznymi, kofaktorami,
ruchliwością elektroforetyczną - są kodowane
przez geny różnych organizmów

Polimorfizm białek

(krwi, jaja, mleka

itp.)

• Polimorfizm białek wykrywa się przy

pomocy elektroforezy - rozdział białek w
stałym polu elektrycznym

• Białka migrują do bieguna dodatniego ze

zróżnicowaną szybkością zależną od:

– wielkości cząsteczki
– ładunku cząsteczki
– konformacji przestrzennej

Identyfikacja polimorfizmu (białka lub

DNA) przy pomocy elektroforezy

• Rozdział w stałym polu elektrycznym
• Szybkość przemieszczania zależy od masy,

konformacji przestrzennej i ładunku

AA

AB

BB

-

+

Polimorfizm DNA

i markery genetyczne

SNP

(

s

ingle

n

ucleotide

p

olymorphism) –

polimorfizm

podstawień

jednonukleotydo

wych

InDel

(

in

sertion-

del

etion

polymorphism)

– polimorfizm

insercyjno-

delecyjny

VNTR

(

v

ariable

n

umber of

t

andem

r

epeats) –

polimorfizm

minisatelitów

STR

(

s

hort

t

andem

r

epeats) –

polimorfizm
mikrosatelit

ów

CNV

(

c

opy

n

umber

v

ariation) –

zmienna liczba kopii długich

fragmentów

Polimorfizm sekwencji DNA

Polimorfizm podstawień jednonukleotydowych (ang.

S

ingle

N

ucleotide

P

olymorphism –

SNP

), np.:

AA

A

CT> AA

C

CT (substytucja

A

>

C

)

Polimorfizm insercyjno-delecyjny (ang.

In

sertion-

Del

etion polymorphism –

InDel

)

AAA

__

CT

> AAA

GG

CT (delecja/insercja

GG

)

Polimorfizm sekwencji powtarzających się
tandemowo:

- mikrosatelity (

STR

–

S

hort

T

andem

R

epeats)

- minisatelity

Markery genetyczne typu SNP i

InDel

•SNP

(single nucleotide

polymorphism)

•

allel 1: AGG

T

CT

• allel 2: AGG

C

CT

•InDel

(insertion/deletion

polymorphism)

• allel 1: AG

CTC

GTCT

• allel 2: AGGTCT

Podstawienie:

T>C

Insercja/delecja:

CTC

> -

Sekwencje mikrosatelitarne

(STR)

• Tandemowe powtórzenia

kilkunukleotydowego motywu

5’ CACACACACACACACA 3’

3’ GTGTGTGTGTGTGTGT 5’

Allel (CA)

8

5’ CACACACACACACACACACA 3’

3’ GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT 5’

Allel (CA)

10

(CA)

3

(CA)

5

Sekwencje mikrosatelitarne

• Występują w wielu miejscach genomu (w

tym w intronach i promotorach) –
równomiernie w genomie

• polimorfizm polega na tym, że dla

danego locus występuje w populacji wiele
alleli różniących się liczbą powtórzeń

Sekwencje mikrosatelitarne

• Typy sekwencji

– Proste (doskonałe) powtórzenia (ang. perfect

repeat):

• (CAA)

n

– Powtórzenia niedoskonałe (ang. imperfect

repeat):

• (CAA)

n

GTC(CAA)

m

– Powtórzenia złożone (ang. compound repeat):

• (CA)

n

TT(GCCC)

m

• Powszechnie wykorzystywane markery

genetyczne

Analiza sekwencji mikrosatelitarnej
2319 w rodzinie lisa pospolitego

P.z.

339

220

235/235 243/263 235/243 235/243 235/263

M

235/235

243/263

235/243

235/243

235/263

Analiza sekwencji mikrosatelitarnej
2319 w rodzinie lisa pospolitego

Dziedziczenie alleli mikrosatelitarnych

ojciec: 6/4

matka:
5/3

Allel 4: 4
powtórzenia
Allel 6: 6
powtórzeń

Allel 5: 5
powtórzeń

Allel 3: 3
powtórzenia

GENOTYP
Y

Wykorzystanie polimorfizmu

genetycznego i markerowych map

genomowych

• Kontrola pochodzenia, np.

– wykorzystanie ok. 8-12 polimorficznych markerów

mikrosatelitarnych pozwala na wysoce

wiarygodną weryfikację zapisów rodowodowych

(współczynnik wykluczenia PE jest rzędu 99,99%)

• Identyfikacja osobnicza (np. kryminalistyka)
• Poszukiwanie genów, których mutacje wywołują

efekt fenotypowy (choroba dziedziczna, zmienność

cechy ilościowej lub jakościowej)

• Filogenetyka molekularna (badanie dystansu

genetycznego pomiędzy rasami, gatunkami itd)

• itp

Recommended ISAG panels of markers for parentage verification:
 
Horse: (Co-Chair: Gus Cothran - email: [e-mail]; Melba
Ketchum – email: [e-mail])
 
Nine microsatellites in two multiplexes:
(1): AHT4 – AHT5 – HMS6 – HMS7- HTG4 – VHL20;
(2): ASB2 – HMS3 - HTG10;

Cattle: (Chair: Cecilia Penedo – e-mail:
[e-mail])
 
There are nine microsatellites recognized as “international marker set”
which need to be included in cattle parentage panels for purposes of
record exchange between laboratories. It is recommended that 12-14
markers be used routinely. The additional 3-5 markers may vary among
laboratories. The “international marker set” can be amplified in a single
PCR or in two multiplexes, depending upon which other markers are
included in the test.
 
International Marker Set: BM1824, BM2113, INRA023, SPS115, TGLA122,
TGLA126, TGLA227, ETH10, ETH225.

Przykład:

Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki Zwierząt

(International Society for Animal Genetics – ISAG)
rekomenduje określone markery mikrosatelitarne do badań
w kontroli pochodzenia

Kontrola pochodzenia psów

Marker 1

Marker 2

ojciec

matka

ojciec

matka

Sekwencje minisatelitarne

• Składają się z powtórzeń

tandemowych zestawu kilkunastu
(kilkudziesięciu) nukleotydów

• występują w wielu miejscach genomu
• w danym locus mogą występować

różne liczby powtórzeń

• polimorfizm wykrywany przy pomocy

hybrydyzacji in situ z wyznakowaną
sondą, zawierającą motyw
powtarzający się

Identyfikacja osobnicza na podstawie

polimorficznych sekwencji DNA

Markery minisatelitarne

Wykorzystanie markerów

genetycznych

• Kontrola pochodzenia – identyfikacja

osobnicza

• Identyfikacja markerów sprzężonych

z genami kontrolującymi istotne

cechy (choroby genetyczne, cechy

produkcyjne itp) – markerowa mapa

genomu

• Ocena dystansu genetycznego

• Ocena poziomu hetero- i homozygotyczności

populacji

• Ocena zmian zachodzących w strukturze

genetycznej populacji

Badania organizacji
genomu

Markerowa mapa
genomu

Sekwencja
genomu

Mapowanie i sekwencjonowanie

genomu

• Mapowanie

– gromadzenie wiedzy o

lokalizacji markerów genetycznych w
genomie (chromosomach)

• Sekwencjonowanie

– poznanie sekwencji

nukleotydów DNA badanego genomu
(chromosomów)

Markerowa mapa genomu

• Mapa fizyczna (cytogenetyczna)

– ustalenie, w którym chromosomie

(konkretniej, w którym miejscu chromosomu)
występuje locus markera genetycznego

• Mapa genetyczna (sprzężeniowa)

– ujawnienie markerów sprzężonych ze sobą
– ustalenie odległości między markerami

sprzężonymi

– ustalenie kolejności loci markerów w

chromosomie

Markerowa mapa

genomu

(jądrowego)

Identyfikacja markerów
genetycznych

Analiza sprzężeń między loci
markerowymi

mapa genetyczna
(sprzężeniowa):

* analiza segregacji alleli
markerowych w

rodzinach

Lokalizacja chromosomowa
loci markerowych

mapa fizyczna
(cytogenetyczna):

* hybrydyzacja in situ (FISH)

* analiza hybrydowych
komórek
somatycznych, a w tym -

mapowanie radiacyjne

Sprzężeniowa mapa
genomu

Analiza segregacji alleli z loci sprzężonych

w rodzinach:

-

poznanie genotypu rodziców i potomstwa

- ustalenie czy analizowane loci są sprzężone
- identyfikacja potomków o zrekombinowanym genotypie

(crossing over)

- ustalenie częstości rekombinantów (częstość crossing

over)

- oszacowanie odległości genetycznej między sprzężonymi

loci (cM)

- ustalenie kolejności loci sprzężonych

Sprzężeniowa mapa

genomu

• 1 cM (centymorgan)

- odległość

pomiędzy dwoma loci, która oznacza, że

crossing over w tym obszarze zachodzi

z częstością jeden raz na 100 mejoz.

• Długość genomu ssaków zawiera się w

przedziale od ok. 2000cM (mysz, świnia)

do 3000cM (człowiek, bydło)

• Długość genomu mierzona na

podstawie mejozy żeńskiej jest większa

niż mierzona w oparciu o mejozę

męską.

12c
M

10c
M

4cM

11c
M

5cM

7cM

8cM

16c
M

Długość genetyczna (sprzężeniowa)
chromosomu = 73cM

Długość genomu = suma długości chromosomów
haploidalnego zestawu

Cytogenetyczna mapa

genomu

• Mapowanie cytogenetyczne

genomu

– hybrydyzacja in situ
– hybrydyzacja komórek somatycznych

* mapowanie radiacyjne

* denaturacja sondy i
chromosomów

* hybrydyzacja sondy z
chromosomami

* obserwacja miejsca
hybrydyzacji

* identyfikacja chromosomu

FISH –

podstawowa
technika
mapowania
cytogenetycznego

Lokalizacja sondy zawierającej
marker mikrosatelitarny
(ZuBeCa8) w chromosomie 9
jenota chińskiego

QFQ

FISH

(chromosomy wybarwione jodkiem
propidionu)

Sekwencja genomu:

- Sekwencja nukleotydów w cząsteczkach DNA
tworzących haploidalny zestaw chromosomów

- Na przykład sekwencja genomu człowieka to 22
cząsteczki DNA autosomów + cząsteczka DNA
chromosomu X

1995

1996

Pierwszy genom bakteryjny zsekwencjonowano

w 1995r., a pierwszy genom eukariotyczny w

1996r.

2001

Z historii badań sekwencji genomu
człowieka

1989 – powołanie organizacji

HUGO

(

HU

man

G

enome

O

rganisation)

1990 – uruchomienie

HGP

(

H

uman

G

enome

P

roject) - dyrektor J.Watson, 1990-1992)

1998 – powstanie prywatnej firmy

Celera

Genomics –

projekt Celera

(dyrektor Craig

Venter, 1998-2002)
2001 – wstępna sekwencja genomu człowieka (ok.
90% genomu) ogłoszona 16. lutego 2001 w
NATURE

oraz SCIENCE

2003 – 14. kwietnia 2003 ogłoszono zakończenie

sekwencjonowania 99% genomu z

trafnością 99,99%.

Sekwencja genomu

opracowana w ramach

program HGP (HUGO)

200
1

Procedura
sekwencjonowania
zastosowana w HGP
(HUGO)

Wielkość genomu człowieka

(dane z 2004r.)

-

genom całkowity = 3,08Gpz

* genom euchromatynowy =
2,85 Gpz

- liczba genów kodujących białka = ok.
22 tys.

GENOM

GENOMIK
A

Genomika (ang. genomics)

to interdyscyplinarny obszar

nauki, w którym wykorzystuje się

techniki badawcze genetyki, biologii

molekularnej, biochemii, fizjologii i

informatyki, w celu poznania budowy,

organizacji i funkcjonowania genomu

26 lat temu rozpoczęła się era
genomiki

Genomika

STRUKTURALN
A

FUNKCJONALN
A

Wzorzec kariotypu

Markerowa mapa i
organizacja
genomu

Sekwencja i
polimorfizm
genomu

Transkryptom
ika
Proteomika

Metabolomika

Nutrigenomik
a

Farmakogeno
mika

Genomika
porównawcza

Epigenomi
ka

Genom ssaków,
100%

Geny i sekwencje
„okołogenowe” , ok.
30%

Sekwencje
pozagenowe, ok. 70%

Eksony, ok. 2%

Introny, sekwencje
5’- i 3’-flankujące,
ok. 28%

Telomer
y

Centromer
y

Sekwencje
powtarzające
się tandemowo,
ok. 25%

Powtórzenia
rozproszone
(ruchome elementy
genomu), ok. 45%

Inne

LINE

SINE

Inne