Reaktywne formy tlenu

(RFT)

Reactive oxygen species

(ROS)

Stres oksydacyjny w komórkach

roślinnych, H

2

O

2

jako cząsteczka sygnalna

Cząsteczki sygnałowe

– reaktywne formy tlenu (ROS):

H

2

O

2

(nadtlenek wodoru)

O

2-.

(rodnik ponadtlenkowy)

OH

-

(rodnik hydroksylowy)

– reaktywne formy azotu (RNS):

NO (tlenek azotu)

ONOO

-

(rodnik peroksynitrylowy)

GSNO (nitrozoglutation)

Co to są reaktywne formy

tlenu ?

• Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem: reagując ze

związkami organicznymi, utlenia je, pobierając od nich
elektrony, a sam ulega redukcji.

• Całkowita redukcja O

2

oznacza przyłączenie 4 protonów

i 4 elektronów, powstają wówczas 2 cząsteczki
H

2

O.

• Cząsteczka tlenu, nie zawsze ulega pełnej, 4-

elektronowej redukcji.

Rodnik

– atom lub cząsteczka zdolna do

samodzielnego istnienia, mająca 1 lub więcej
niesparowanych elektronów.

Wolne rodniki

są reaktywne, ponieważ dążą

do sparowania elektronów (pozbycia się
nadmiaru, lub przyłączenia dodatkowego
elektronu).

Reaktywne formy tlenu

są produktami

kolejnych stopni redukcji cząsteczki tlenu.

Reaktywne formy tlenu (ROS)

• wolne rodniki

• nie rodnikowe

pochodne tlenu

O

2

.-

ponadtlenkowy

.

OH

hydroksylowy

H

2

O

2

nadtlenek

wodoru

O

3

ozon

1

O

2

tlen singletowy

II. Usuwanie („zmiatanie”) wolnych
rodników

Anionorodnik ponadtlenkowy

O

2

-

–Stosunkowo

szybko reaguje ze związkami zawierającymi grupy tiolowe,
i białkami zawierającymi centra żelazowo-siarkowe

Szybko reaguje ze związkami redukującymi:
askorbinianem, NADH, jonami metali Fe i Cu, a więc też z
metaloproteinami.

Jest dość trwały w fizjologicznym pH, może dyfundować na
znaczne odległości, jak też przenikać przez błony komórkowe
(niezbyt łatwo).

Rodnik hydroksylowy •HO

-

jeden z

najbardziej reaktywnych utleniaczy.

Ma bardzo wysoki potencjał redoks, a więc silne właściwości
utleniające.
Reaguje praktycznie ze wszystkimi substancjami
występującymi w organizmie i to bardzo szybko.

Nadtlenek wodoru H

2

O

2

– Cząsteczka

sygnalna

Nie jest zbyt reaktywną formą tlenu

. Przy pH

zbliżonym do obojętnego może utleniać grupy tiolowe,
indolowe, imidazolowe, fenolowe i tioestrowe.

Biologicznie istotne znaczenie ma utlenianie grup
tiolowych oraz utlenianie jonów metali przejściowych
(Fe

2+

do Fe

3+

i Cu

+

do Cu

2+

), co prowadzi do

powstawania rodnika hydroksylowego.

Fe

2+

+ H

2

O

2



•

OH + OH

-

+ Fe

3+

Cu

+

+ H

2

O

2



•

OH + OH

-

+ Cu

2+

H

2

O

2

–

jest stosunkowo mało reaktywny, łatwo

przenikający przez błony biologiczne, może się
pojawiać w dużych odległościach od miejsca
powstania.

Ozon

Ozon w stratosferze (15-50 km od powierzchni
Ziemi) pochłania promieniowanie nadfioletowe C
(200-280 nm) i nadfioletowe B (280-320)

Ozon w atmosferze zadymionych miast – jako
składnik smogu - ma działanie niszczące jak
inne reaktywne formy tlenu

Niektóre efekty działania ROS na komórki i ich
składniki:

• Utlenianie związków niskocząsteczkowych: glutation,
askorbinian, NADH

• Inaktywacja enzymów
• Inaktywacja białek transportowych
• Uszkodzenia kwasów nukleinowych
• Peroksydacja lipidów błonowych
• Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej
• Zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca

2+

• Zaburzenia struktury cytoszkieletu (polimeryzacja
aktyny, rozerwanie mikrofilamentów)

• Powstawanie mutacji

Miejsca produkcji ROS w komórce

roślinnej

Peroksyzomy

,

Chloroplasty

Mitochondria

Glioksyzomy

Błona komórkowa (oksydazy NADPH)

Apoplast (peroksydaza)

Endoplazmatyczne Reticulum

Stężenie ROS w komórce

roślinnej

• Produkcja ROS w

nie pobudzanych
komórkach

240 µM s

-1

O

2-

• W czasie stresu
produkcja ROS
240-720 µM s

-1

O

2-

• stężenie H

2

O

2

0,5 µM

• stężenie H

2

O

2

5 -15 µM

W czasie jakich reakcji

powstają ROS w odpowiedzi na

stres ?

• Fotooddychanie
• Oddychanie mitochondrialne
• Oksydaza NADPH
• Peroksydazy w apoplaście
• Peroksydacja lipidów

Stresy

stymulują produkcję ROS w komórce

roślinnej wywołując

wtórny stres oksydacyjny

.

Poziom stresu zależy od funkcjonowania
systemu antyoksydacyjnego.

ROS odgrywają rolę
cząstek

toksycznych i

sygnalnych.

Muszą w komórce funkcjonować

mechanizmy

detoksykacji ROS

Stężenie H

2

O

2

w

komórce jest
kontrolowane przez
system
antyoksydacyjny,
który składa się z:
■

szeregu

enzymów

i ■

antyoksydantów

.

Transport H

2

O

2

przez:

• peroksypory

• akwaporyny

Enzymy komórkowego systemu

antyoksydacyjnego

Dysmutaza ponadtlenkowa

(SOD),

Katalaza

(CAT)

Peroksydaza glutationowa

(GPOX)

Peroksydaza askorbinianowa

(APOX)

Reduktaza glutationowa (RG)

Antyoksydanty cząsteczkowe

(nieenzymatyczne)

ASKORBINIAN (5-20 mM)

GLUTATION (1-5 mM)

TOKOFEROL

FLAWONOIDY

KAROTENOIDY

Stosunek zawartości zredukowanej formy

antyoksydanta do utlenionej formy

antyoksydanta jest sygnałem modulującym

mechanizmy zmiatania ROS.

Peroksydaza

askorbinianowa

Reduktaza

dezoksy-

askorbinianowa

Reduktaza

glutationowa

System antyoksydacyjny

Skutki stresu oksydacyjnego w chloroplastach

Niekorzystne

czynniki środowiska

Stres oksydacyjny

Odporność = mechanizmy naprawcze

a/ system antyoksydacyjny:

• Glutation

• Askorbinian

• Karotenoidy antoksydanty

• Tokoferol

b/ Enzymy antyoksydacyjne:
SOD, GR, APOX, GPOX

Uszkodzenia (destrukcja chloroplastów)

1. Pęcznienie chloroplastów

2. Akumulacja skrobi

3. Destrukcja błon otaczających
chloroplasty

4. Destrukcja barwników asymilacyjnych

naturaln
e

antropogeniczn
e

Zapobieganie

hamowania

fotosyntezy

Hamowania

fotosyntezy

Sygnał ROS jest kontrolowany

przez procesy syntezy i zmiatania

ROS

Istnieje równowaga pomiędzy syntezą ROS i
aktywnością komórkowego systemu
antyoksydacyjnego

(oba procesy zachodzą

zawsze).

Zakłócenie tej równowagi prowadzi do powstania
stresu oksydacyjnego, t.z.n. zmiatanie ROS nie
nadąża za produkcją ROS.

Procesy biologiczne regulowane

przez H

2

O

2

-Stres abiotyczny
-Zamykanie aparatów szparkowych w
odpowiedzi na ABA

-Stres biotyczny -infekcja patogenu –
indukcja PCD

-Allelopatia

Neill et al. 2002, Laloi et al. 2004

Udział stresu oksydacyjnego w

biotycznych i abiotycznych stresach

• Stres abiotyczny – wzrost produkcji ROS,

natychmiastowa

aktywacja systemu

antyoksydacyjnego

, zmiatanie ROS

• Stres biotyczny – nadprodukcja ROS (oksydaza

NADPH),

wygaszenie systemu antyoksydacyjnego

,

miejscowa realizacja PDC (programowanej śmierci

komórki), POWSTANIE NEKROZ, oraz

uruchomienie mechanizmów obronnych

Różnica: strategia modulowania

aktywnością systemu antyoksydacyjnego

Johansson, 2004

Sygnałowe funkcje

ROS

związane są nie

tylko z odpowiedzią na

stres

Przejściowy wzrost produkcji
ROS (sygnał ?) i białek
utlenionych przed
zakwitnięciem rośliny

Zawartości białek utlenionych

w trakcie rozwoju

rośliny

(Arabidopsis) jest

zmienna.

Produkcja RFT we wczesnych

fazach kiełkowania nasion

Ogawa, Iwabuchi 2001, Plant Cell Physiol. 42: 286-291

Produkcja ROS w kiełkujących nasionach cynii (Zinnia elegans

)

RFT pełnią wiele sygnałowych

(nie tylko toksycznych)
funkcji w roślinie:

• wtórne przekaźniki podczas stresu
• powodują powstawanie białek

utlenionych SYGNAŁOWYCH podczas
kiełkowania, kwitnienia…i innych
procesów życiowych.

Cząsteczki sygnałowe

– reaktywne formy tlenu (ROS):

H

2

O

2

(nadtlenek wodoru)

O

2-.

(rodnik ponadtlenkowy)

OH

-

(rodnik hydroksylowy)

– reaktywne formy azotu (RNS):

NO (tlenek azotu)

ONOO

-

(rodnik peroksynitrylowy)

GSNO (nitrozoglutation)

ROS (H

2

O

2

)

i

RNS (NO)

biorą udział w

regulacji tych samych procesów:

- indukują reakcje obronne przeciwko patogenom,

- indukują programowaną śmierć komórki (PCD),

- kontrolują procesy wzrostu i rozwoju
(kiełkowanie).

ROS i

NO

są produkowane podczas

wczesnych faz kiełkowania

ROS

production in

germination seeds of zynia

(

Ogawa, Iwabuchi 2001. Plant

Cell Physiol. 42: 286-
291).

NO

production in germinationg switchgrass

seeds (

Sarath et al. 2006. Planta

223:1154-1164).

CONTROL

+ DAF-FM

DAF-FM - 4-Amino-5-methylamino-2’,7’-
difluorofluoresceina

Prokukcja

NO

w komórce

roślinnej

NO jest produkowany

:

- na drodze enzymatycznej
(syntaza NO (NOS),
reduktaza azotanowa (NR),
reduktaza nitrozowa (Ni-
NOR)

- na drodze nie
enzymatycznej (uwalnianie
z azotynów)

Neill et al. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.

Nitrate
reductase
(NR)

Arginin
e

mitochondr

ia
peroxisome

s
cytoplasm
chloroplast

s

NO

NO synthase
(AtNOS1/AtNOA1
)

cytoplasm

NO

2

-

NO

2

-

NO

2

-

NO

2

-

chloroplas
t

mitochondr
ia

Plasma
membran
e (root)

Nitrite:NO
reductase
(Ni-NOR)

Usuwanie

NO

z

komórki

NO

reaguje z rodnikiem

ponadtlenkowym i
powstaje

rodnik

peroksynitrylowy

NO

reaguje z glutationem –

powstaje

S-

nitrozoglutation

(GSNO).

NO

może być

metabolizowany przy
udziale hemoglobin.

Neill et al.. 2008. J. Exp. Bot. 59:25-35.

haemoglobin
s

NO

NO

2

-

, NO

3

-

O

2

GSNO

GSSG +
NH

2

GSNO
reductase

glutathione

ONOO

-

(peroxynitrite)

O

2

-

(superoxide)

aminokwa
sy

nitrozylacja

nitracja

utleniani

e

cysteiny do:
SS-, SOH-,
SO

2

-, SO

3

-

tyrozyny
histydyny
tryptofanu

R-NO

2

S-nitrozylacja
cysteiny: R-S-NO

przyłączenie

NO

2

lub ONOO-

do pierścienia

aromatycznego

przyłączenie NO

do grupy tiolowej

cysteiny

H

2

O

2

O

2

.-

Modyfikacje białek wywołane przez

RNS

(NO,NO

2

i ONOO-)

i

ROS

przyłączenie O

2

do grupy

tiolowej lub

pobranie ē

ROS

argininy
lizyny
proliny
treoniny

utworzenie

grupy

karbonylowe

j

karbonylacj

a

RNS

NO

bierze udział w reakcji roślin na

stres solny (

modyfikuje białka poprzez nitrację i

nitrozylację

)

Valderrama et al.. 2007. FEBS Letters 581:453-461

Stres solny powoduje zwiększoną
produkcję RNS (NO, nitrozo-
tyrozyna, nitrozoglutation) głównie
w komórkach położonych blisko
tkanek przewodzących

NO

powoduje nitrację białek u ludzi i

zwierząt

Nitracja białek
cytoszkieletu (aktyny)
powoduje polimeryzację
ścian komórek
porażonych chorobą
Aldscheimera

Confocal microscopy visualisation of nitrotyrosine-
containing actin in human and mouse filaments.

Aslan et al.. 2003. J. Biol. Chem. 278:41-94-4204.

Sickle cells

control

cells

NO

modyfikacja

posttranslacyjna

białek

wpływa na aktywność enzymów:

• katalazy
• peroksydazy ksantynowej
• peroksydazy askorbinianowej
• kinazy
• oksydazy alternatywnej
• akonitazy

aktywuje

cGMP

cyklazę
guanylową

aktywacja drogi
sygnalnej

uwalnia
Ca

2+

kinazy
kanały
jonowej
fosfodiestera
zy

RNS

w transdukcji sygnału

Podobny mechanizm działania

RNS

i

ROS

w regulacji ekspresji genów

NO

motyw palców
cynkowych

inaktywacj
a
represoró
w
transkrypc
ji

modyfikuje aktywność
czynników
transkrypcyjnych

NO

wnika do jądra

komórkowego

aktywuje drogi sygnalne
przez:

produkcje

SA, cGMP

uwalniani

e Ca

2+

MAPK

kinaza

transdukcja
sygnału

ekspresja genów

H

2

O

2

utlenienie i

karbonylacj

abiałek

H

2

O

2

wnika do jądra

komórkowego

utlenienie,

nitracja i

nitrozylacja

białek

ROS

i

RNS (NO)

współdziałają z

hormonami roślinnymi

ROS

RNS

etylen

GA

ABA

JA

BR

Wzrost i
rozwój

-

?

?

Współdziałanie („cross-talk”)

ROS

i

RNS

w regulacji wzrostu i

rozwoju

miejsce
syntezy

czas
syntez
y

szlak transdukcji

sygnału

funkcje

ROS

(H

2

O

2

)

RNS

(NO)

Askorbinia
n

Glutation

p o d o b i e ń s t w a

Podsumowanie

Podsumowanie

Regulacyjna rola

ROS

i

RNS

w kontroli procesów wzrostu

i rozwoju

Sygnał egzo-

lub endogenny

stres

oksydacyjny

stres nitrozacyjny

Wzrost

i

rozwój

ROS

RNS

utlenienie,

karbonylacja

białek

peroksydacja

lipidów

S-nitrozylacja

białek

nitracja białek i lipidów

glutatio
n

askorbinia
nn