Sekwencje DNA i RNA

PCR i sekwencjonowanie

Reakcja PCR

(Polymerase Chain Reaction)

•Najczulsza

metoda

służąca

do

wykrywania
i powielania fragmentów DNA o
określonej sekwencji.
•Pozwala na wykrycie i amplifikację
pojedynczej

kopii

interesującej

sekwencji
z preparatu DNA całkowitego.

Składniki mieszaniny

reakcyjnej

• Termostabilna polimeraza DNA
• Para syntetycznych

oligonukleotydów jako startery
syntezy DNA

• Trójfosforany deoksynukleotydów
• Kationy dwuwartościowe (Mg

2+

)

• Bufor o pH 8.3-8.8
• Kationy jednowartościowe (K

+

)

• Matryca DNA

Polimeraza DNA

przyłącza

nukleotydy

do końca 3’ – tzn.

katalizuje

reakcję

wydłużania

w kierunku 5’→3’

Etapy PCR:

• denaturacja 92-96 C
• hybrydyzacja – przyłączenie

primerów do matrycy 54 – 56 C

• elongacja – 72 C

Denaturacja

Denaturacja – rozdzielenie nici DNA pod wpływem

temperatury

Temperatura denaturacji zależy od składu zasad
fragmentu który chcemy powielić i odporności
polimerazy na wysoką temperaturę.
Najpopularniejsza polimeraza używana standartowo w
PCR – Taq wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni C.
Przy fragmentach bogatych w GC używa się polimeraz
bardziej opornych na wysoką temperaturę (np. Pwo,
Pfu).

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

94

0

C

Pierwszy cykl

Annealing

(przyłączanie starterów)

Przyłączanie starterów (

Annealing)

Temperatura:

za wysoka – słaba wydajność

za niska - niespecyficzne powielanie

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej
oszacowanej temperatury topnienia.
Praktyczny wzór na temperaturę topnienia dla starterów
o długości około 20 nukleotydów:
T=2x(A+T) + 4(G+C)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

Extension (wydłużanie łańcucha)

Wydłużanie łańcucha (Extension)

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości polimerazy.
Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78 stopni.
Szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla polimerazy Taq
wynosi około 2000 nukleotydów/min.
Do pełnej syntezy badanego fragmentu czas trwania tego etapu
wyznaczamy zakładając połowę optymalnej prędkości.

5’

3’

3’

5’

Sekwencja startera

5’

3’

5’

3’

Sekwencja startera

Drugi cykl - denaturacja

5’

3’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

94

0

C

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

Przyłączanie starterów

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

Wydłużanie nici (elongacja)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

W trzecim cyklu produkowany jest

już właściwy produkt

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

PCR

Temperatura jest najważniejszym

fizycznym czynnikiem wpływającym

na wynik w reakcji PCR

Wynik klasycznego PCR – obraz elektroforetyczny

zamplifikowanego produktu

Reverse Transcription PCR

Q-PCR – PCR w czasie rzeczywistym

• Q-PCR

jest

metodą

do

ilościowego

oznaczania kwasów nukleinowych w badanej

próbie.

W przeciwieństwie do konwencjonalnego PCR

, gdzie można oznaczać jedynie obecność lub

brak produktu metoda ilościowego PCR-u

pozwala na określenie jego ilości (względnej

lub bezwzględnej)

• Za pomocą pomiaru fluorescencji w każdym

cyklu reakcji jest możliwe śledzenie jej

przebiegu.

Pierwszy

znaczący

wzrost

fluorescencji jest skorelowany z początkowa

ilością matrycy.

Monitorowanie reakcji real- time

PCR

• Do monitorowania reakcji opracowano

różne interkalujące barwniki: bromek
etydyny, SYBR Green I

• sondy hybrydyzacyjne (TaqMan,

Fluorescence Resonance Energy Transfer,
Molecular Beacons)

SYBR Green I

1. Wady:
Brak specificzności (przyłaczanie do

dimerów primerów lub
niespecyficznych produktów reakcji
PCR)

2. Zalety:
Metoda stosunkowo tania i uniwersalna

Metody real – time PCR oparte

o sondy specyficzne względem

sekwencji

• S

• s

TaqMan

•Koniec 5’- barwnik reporterowy (TET, VIC)

•Koniec 3’-wygaszacz (TAMRA)

•Koniec 3’ zablokowany (fosforylowany)

•Na końcu 5’ nie może być zasady G - znosi

fluorescencję

Real Time PCR
(Q-PCR)

Pozwala na śledzenie
akumulacji produktów w
trakcie przebiegu
reakcji PCR

Molecular Beacons

• Mają strukturę szpilki do włosów
• Sekwencja pętli jest komplementarna do

specyficznej matrycy

• Sekwencje pnia są komplementarne względem

siebie

• Końce 5’ i 3’ są kowalencyjnie związane z

fluorochromem i wygaszaczem

• Gdy sonda rozwija się to zaczyna fluoryzować

Molecular Beacons

Graficzna analiza wyników reakcji PCR

Po zakończeniu reakcji otrzymujemy tzw. krzywą amplifikacji-obrazująca
przebieg reakcji QRT-PCR, czyli przyrost produktu w czasie kolejnych cykli.
W każdym cyklu dokonywany jest automatyczny pomiar fluorescencji.

Parametry krzywej amplifikacji:

• Linia bazowa (baseline) – w początkowych cyklach reakcji

ilość produktu jest zbyt mała, by obserwować jego
przyrost

• Linia odcięcia (threshold line)

• Ct (Treshold Cycle) – odzwierciedla numer cyklu reakcji

PCR w którym intensywność fluorescencji przekracza
wyznaczoną linię odcięcia.

Sekwencjonowanie DNA

(metoda dideoxy-)

•Metoda oparta jest na użyciu
czterech stopujących reakcję
wydłużania łańcucha nukleotydów,
które w pozycji 3’ mają H zamiast OH
(di-deoxy: ddATP, ddGTP, ddCTP,
ddTTP).

•W klasycznej metodzie każdy
nukleotyd dodawany jest oddzielnie
do czterech prowadzonych równolegle
reakcji replikacji DNA.

•Produkty tych czterech reakcji są
rozdzielane metodą elektroforezy w
żelu akrylamidowym

Nukleotydy
prawidłowe w
nadmiarze

Znakowany
radioaktywnie
starter

Dideoxy nukleotydy
Polimeraza DNA

Sekwencjonowanie DNA
(metoda dideoxy-)

Znakowanie startera

Nukleotydy prawidłowe

Polimeraza DNA

Nukleotydy stopujące reakcję

Sekwencjonowanie automatyczne

W systemie tym stosuje się dideoxy nukleotydy znakowane
czterema różnymi znacznikami fluorescencyjnymi. W systemie
stosuje się reakcję PCR startującą od jednego primera i
zatrzymującą się na nukleotydach dideoxy. Wszystkie cztery
znakowane nukleotydy dideoxy są w jednej mieszaninie. Po
reakcji PCR mieszanina nanoszona jest na żel
poliakrylamidowy a reakcja elektroforezy prowadzona jest w
aparacie wyposażonym w detektor.

System ABI (Applied Biosystems Incorporated) używa
czterech znakowanych fluorescencyjnymi
barwnikami

ddNTPs

i polimerazy Taq (AmpliTaq).

Wzbudzanie fluorochromów i detekcja emisji mają
miejsce w określonej pozycji w pobliżu dolnej części
żelu. Dane są odczytywane na podstawie spektrum
emisyjnego kolejnych pasm mijających detektor w
czasie elektroforezy. Dane podawane są do komputera
podłączonego on-line do urządzenia.

Analiza polimorfizmu powtarzalnych sekwencji DNA

RFLP PCR – polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych

POLIMORFIZM W KODONIE 145 GENU APE1,

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TT(Asp/Asp)

TG(Asp/Glu)

GG(Glu/Glu)

GENOTYPY

%

B

A

D

A

N

E

J

P

O

P

U

L

A

C

JI

CHORZY Z
NOWOTWORAMI
REGIONU GŁOWY I SZYI

CHORZY Z RAKIEM PŁUC

CHORZY Z RAKIEM
SZYJ KI MACICY

CHORZY Z RAKIEM
J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CHORZY NA

NOWOTWORY

REGIONU GŁOWY I

SZYI

CHORZY NA RAKA

PŁUC

CHORZY NA RAKA

SZYJ KI MACICY

CHORZY NA

NOWOTWORY

J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI ALLELI GENU 145 APE 1

Asp

Glu

Porównanie

częstości

genotypów w

stanach

patologicznych

wskazuje na

istnienie korelacji

pomiędzy pewnymi

wariantami

genetycznymi

a chorobami

Pewne allele tego samego

genu mogą być

odpowiedzialne

za wystąpienie stanów

patologicznych lub

skłonności do określonych

patologii

A. Gdowicz 2005

• FRET opiera się na transferze energii od

fluorochromu będącego donorem do

fluorochromu bedącego akceptorem (dwie

sondy)

• Cząsteczki donora i akceptora muszą być w

bliskiej odległości (10-100A)

• Donor wzbudzany jest niebieskim światłem
• Donor znajduje się na końcu 3’-Fluorescyna
• Akceptor na końcu 5’-Red
• Sygnał mierzony jest za pomocą fluorymetru

FRET