Biotechniki rozrodu

Hodowla zarodków in vitro, ocena

morfologiczna zarodków

Oznaczanie płci zarodków metodą PCR

Zaliczenie przedmiotu

Hodowla zarodków in vitro,

ocena morfologiczna zarodków

Hodowla zarodków in vitro

Podłoża do hodowli:
SOF,
Komercyjne: G1, G2 (Medicult), Cook

Warunki hodowli:
wilgotność powietrza: 62-70%
Temperatura -38,5 C
1 zarodek /1 ul pożywki

www.gibco.co

www.gibco.co

m

m

Czynniki determinujące

Czynniki determinujące

efektywność IVM/IVF/IVC

efektywność IVM/IVF/IVC

www.sigmaaldrich.c

om

pożywki:

pożywki:

-

skład

skład

(aminokwasy)

(aminokwasy)

-

ekwilibracja,

ekwilibracja,

stałe pH i

stałe pH i

temperatura

temperatura

w kropli

w kropli

mieszanina gazów do

mieszanina gazów do

IVM/IVF/IVC – stały

IVM/IVF/IVC – stały

skład

skład

w inkubatorze

w inkubatorze

płytki

płytki

hodowlane,

hodowlane,

filtry, igły,

filtry, igły,

falkony, tipsy

falkony, tipsy

Fot. P. Pawlak

Fot. P. Pawlak

www.cryobioststem-
imv.com

olej mineralny

olej mineralny

objętości kropli

objętości kropli

hodowlanych,

hodowlanych,

sposób ich

sposób ich

wykonania

wykonania

jakość plemników - efektywność

jakość plemników - efektywność

zapłodnienia, koncentracja,

zapłodnienia, koncentracja,

przygotowanie

przygotowanie

czystość

czystość

powietrza

powietrza

w

w

laboratorium

laboratorium

jakość oocytów

jakość oocytów

częstotliwość wymiany

częstotliwość wymiany

½ kropli hodowlanej

½ kropli hodowlanej

Jakość zarodków - definicja

• Zdolność (potencjał) zarodka do rozwoju

w prawidłowy, żywy organizm – znaczenie
absolutne

• Potencjał zarodka do rozwoju do bardziej

zaawansowanych stadiów rozwoju
(blastocysta – in vitro) oraz zdolność do
implantacji w macicy i dalszego rozwoju
(samodzielny organizm - in vivo)

Podstawowe parametry oceny

zarodków



Stadium rozwoju odpowiadające wiekowi zarodka
(liczba dni od inseminacji)



Liczba przedjądrzy w zygocie (człowiek)



Liczba blastomerów, kolor i proporcje ich wielkości



Stopień degeneracji blastomerów



Stopień kompakcji w stadium moruli



Liczba blastomerów w blastocyscie, prawidłowość
procesu kawitacji

zygota

3PN

morula

(luźne

blastomer

y)

niedojrzały dojrzały

2-bl

3-4-bl

8-16-bl

morula blastocysta

oocyt (-24h) oocyt (0h) 32-36hpi 40-48hpi

56-110hpi

116-

128hpi 140-168hpi

Chronologia rozwoju

przedimplantacyjnego zarodków

bydła (0-7 dzień pi) pi= po

inseminacji

System oceny wczesnych zarodków

człowieka

A - C liczba i wzajemne proporcje wielkości blastomerów

1- 4 stopień fragmentacji blastomerów Bączkowski i wsp. 2004 Reprod
Biol

równe
blastomery

nierówne
blastomery

degeneracja
cytoplazmy

brak
fragmentacji

fragmentacja
<30%

fragmentacja 30-
50%

fragmentacja
>30%

Klasa A1

Klasa C3

Ocena morfologiczna -

przykłady

Zarodki wczesne do stadium 8bl

C

50m

E

50m

Stadium 2 kom.

Stadium 4 kom.

Stadium 8 kom.

Zarodki hybrydowe bydło domowe x żubr, 3 dzień po inseminacji

(pi)

A) stadium 3-4-blastomerowe

B) stadium 5-6-blastomerowe (

widoczna wakuolizacja

cytoplazmy

)

100µm

A

B

Zarodki hybrydowe bydło x żubr, 5 dzień pi

ok. 15-20 blastomerów, komórki luźno ułożone, brak kompakcji,

blastomer wcześniej zahamowany w rozwoju

100µm

Stadium moruli (5 dzień

pi)

przed kompakcją

w czasie kompakcji

Stadium moruli – zarodki o

obniżonej jakości

niewiele blastomerów

(<16) brak kompakcji

Prawidłowa kompakcja,

luźne blastomery w

przestrzeni okołożółtkowej

Stadium późnej moruli / wczesnej

blastocysty (

początek formowania jamy –

blastocel)

System oceny

morfologii

blastocyst

człowieka

1 wczesna

blastocysta

(jama mniejsza
niż ½ zarodka

2

blastocysta

(jama
większa niż
½ zarodka

3
blastocysta

(jama
wypełnia
zarodek)

4

ekspandujaca
blastocysta

(duży zarodek,
cienka zona)

ICM (węzeł
zarodkowy)

TE
(trofoblast)

A

liczne i

ściśle
upakowane
komórki

B

mniej

komórek luźno
upakowanych

C

niewiele

komórek

A

liczne

komórki w
formie
nabłonka

B

mniej

komórek w
formie luźnego
nabłonka

C

nieliczne luźne
komórki

Stadium wczesnej blastocysty

Stadium ekspandującej

blastocysty (dzień 8 pi)

Stadium wylęgającej się

blastocysty

Stadium wylęgłej blastocysty

Ocena morfologiczna –

przykłady

Zarodki nieprawidłowe

obkurczona blastocysta

wewnątrz zp - zaburzenie

wylęgania się

morula – pełna

degeneracja luźnych

blastomerów

Zdegenerowane oocyty

Jakość zarodków – liczba

blastomerów w

ICM

i

TE

(barwienie

różnicujące – DS)

Komórki
węzła
zarodkoweg
o – ang. ICM

Komórki
trofoblastu
– ang. TE

Jakość zarodków – występowanie

apoptotycznych blastomerów

(technika Tunel)

Sygnał
apoptotyczn
y –śmierć
komórki

Wybarwione
jądro
komórkowe
blastomeru

Oznaczanie płci zarodków

metodą PCR

PCR – jedna z technik

molekularnego oznaczania płci

zarodków

Do przeprowadzenia

PCR wymagane

są:



DNA badanego

zarodka



Wolne nukleotydy



Enzym polimeraza

termostabilna Taq



Odpowiedni bufor z

jonami magnezu



Startery dla

badanego

fragmentu DNA

Izolacja DNA z zarodków

Inkubacja komórek zarodka z proteinazą

K

w 37C przez 30 min



zarodek (1 komórka)



Bufor do PCR



Proteinaza K



dNTP



H

2

O

Inaktywacja proteinazy K – 5 min w 95C

Mieszanina reakcyjna PCR

Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej

do PCR

Lizat – 5ul
dNTP – 0,5 ul (2mM/ul)
Primer F – 1,5 ul (5uM/ul)
Primer R – 1,5 ul (5uM/ul)
Bufor dla polimerazy – 2,5 ul (10x/ul)
Polimeraza – 0,4ul (5U/ul)
H2O – do 25 ul

Polimorfizm genu

amelogeniny



U człowieka i bydła wykryto gen amelogeniny (AMGL),
który ma swoje locus na obu chromosomach płci X i Y



Na chromosomie Y stwierdzono delecję w sekwencji
tego genu – efektem tego jest polimorfizm



U samca gen AMGL występuje na chromosomach X i Y
w dwóch różnych formach, u samicy obecna jest tylko
sekwencja charakterystyczna dla chromosomu X

Warunki amplifikacji DNA dla

starterów AMGL – temperatura

przyłączenia

Sekwencja AMGL:

5’ CAG CCA AAC CTC CCT CTG C
3’ CCC GCT TGG TCT TGT CTG TTG C

Wzór na ustalenie teoretycznej temperatury

przyłączania starterów

:

Tp = 4(G + C) + 2(A + T)

Polimorfizm genu

amelogeniny

Osobniki referencyjne

Osobniki referencyjne

samica

samica

samiec

samiec

Produkt PCR z ½ blastocysty

Produkt PCR z ½ blastocysty

Program reakcji PCR dla

AMGL



Denaturacja wstępna DNA – 97ºC 1 min



Denaturacja DNA – 97ºC 3 min



Przyłączanie starterów – 1 min



Elongacja nici DNA - 72 ºC 1 min



Elongacja końcowa - 72 ºC 10 min

Liczba

cykli 40

PCR multipleks

PCR z wykorzystaniem dwóch par starterów:



dla sekwencji na chromosomie Y

 dla dowolnej sekwencji autosomalnej

(marker obecności DNA w probówce)

Dziękuję za uwagę…