Konstrukcja

rekombinantowych szczepów

mikroorganizmów

o znaczeniu

biotechnologicznym

Cel – produkcja białek, których

wytwarzanie na innej drodze jest

trudne
niebezpieczne
ekonomicznie nieopłacalne

Konstrukcja rekombinantowych szczepów

mikroorganizmów o znaczeniu

biotechnologicznym

Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych

 Bakterie

• dobrze scharakteryzowane
• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
• wydajne systemy ekspresyjne
• brak modyfikacji posttranslacyjnych
• możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych

ciał inkluzyjnych

• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny

ułatwiające oczyszczanie i detekcję białek, zwiększające
rozpuszczalność, zwiększające immunogenność

Bakteryjny system ekspresyjny

Gospodarz ekspresyjny

Escherichia coli

Wektor ekspresyjny

Konstrukcja rekombinantowych szczepów

mikroorganizmów o znaczeniu

biotechnologicznym

Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych

 Drożdże

• dobrze scharakteryzowane
• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
• wydajne systemy ekspresyjne
• trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z

genomem gospodarza

• modyfikacje

posttranslacyjne

–

tworzenie

mostków

disiarczkowych,

glikozylacja,

przyłączanie

kwasów

tłuszczowych

• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny

ułatwiające oczyszczanie i detekcję białek, zwiększające
immunogenność

Konstrukcja rekombinantowych szczepów

mikroorganizmów o znaczeniu

biotechnologicznym

Gatunki drożdży stosowane do produkcji

heterologicznych białek

 Saccharomyces cerevisiae
 Pichia pastoris
 Pichia methanolica
 Hansenula polymorpha
 Kluyveromyces lactis
 Yarrowia lipolytica
 Schizosaccharomyces pombe

Konstrukcja rekombinantowych szczepów

drożdży Pichia pastoris

Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych

 drożdże metylotroficzne – zdolne do wzrostu w

pożywce zawierającej metanol jako jedyne
źródło węgla

 możliwość konstytutywnej i indukowanej ekspresji obcych

genów

 możliwość wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej produkcji obcych

białek

 markery selekcyjne auksotroficzne i antybiotykowe
 trwałe rekombinanty – integracja wektorów ekspresyjnych z

genomem drożdży

 glikozylacja białek

 łatwość zwiększenia skali procesu biotechnologicznego

Szczepy Pichia pastoris wykorzystywane do

ekspresji obcych genów

Szczep

Genotyp

Uwagi

X-33, Y-11430

szczep dziki

Selekcja antybiotykowa

GS115

his4

Selekcja rekombinantów na

podłożu bez histydyny

GS190

arg4

Selekcja rekombinantówna

podłożu bez argininy

JC254

ura3

Selekcja rekombinantówna

podłożu bez uracylu

KM71

his4,

aox1::ARG4,

arg4

Selekcja rekombinantów na

podłożu bez histydyny;

fenotyp Mut

S

SMD1168

his4, pep4

Selekcja rekombinantów na

podłożu bez histydyny;

brak aktywności proteazy A

Konstrukcja rekombinantowych szczepów drożdży

Pichia pastoris

Metabolizm metanolu

1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – dehydrogenaza
formaldehydowa, 4 - dehydrogenaza kwasu mrówkowego, 5 - syntaza
dihydroksyacetonu, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, aldolaza 1,6-
fruktozobisfosforanu, 8 – fruktozo 1,6-bisfosforan

Wektory stosowane do indukowanej

ekspresji obcych genów

Geny klonowane pod kontrolę promotora oksydazy

alkoholowej, indukcja ekspresji genów metanolem

Selekcja rekombinantów na podłożu z Zeocyną

Wektory stosowane do indukowanej

ekspresji obcych genów

Geny klonowane pod kontrolę promotora oksydazy alkoholowej

Selekcja rekombinantów na podłożu nie zawierającym histydyny

Wektory stosowane do konstytutywnej

ekspresji obcych genów

Geny klonowane pod kontrolę promotora dehydrogenazy aldehydu

3-fosfoglicerynowego

Sekwencje sygnalne stosowane w celu

zewnątrzkomórkowej produkcji obcych

białek

 Sekwencja sygnalna α-

faktora

Saccharomyces

cerevisiae

 Sekwencja sygnalna kwaśnej

fosfatazy Pichia pastoris

 Własne sekwencje sygnalne

białek kodowanych przez
klonowane geny

Produkcja termostabilnej

β-D-galaktozydazy Pyrococcus woesei

w systemie ekspresji Pichia pastoris

β-D-galaktozydaza

(EC 3.2.1.23)



Katalizuje reakcję hydrolizy wiązań β-1,4-O-
glikozydowych w β-D-galaktozydach



Katalizuje reakcję transglikozylacji

β-D-
galaktozydaza

β-D-
galaktozydaza

Przemysłowe zastosowanie β-D-

galaktozydazy



Produkcja mleka o obniżonej zawartości laktozy



Produkcja dietetycznych przetworów mlecznych



Produkcja syropu glukozowo-galaktozowego



Produkcja bezlaktozowej serwatki



Synteza galaktooligosacharydów

Pyrococcus woesei

izolowany z morskiej solfatary (Porto di Levante, wyspa

Volcano, Włochy)

Domena: Archaea
Grupa: Euryarchaeota
Klasa: Thermococci
Rząd: Thermococcales
Rodzina:
Thermococcaceae
Rodzaj: Pyrococcus
Gatunek: Pyrococcus
woesei



Beztlenowiec



Optimum temperatury - 97 - 100°C



Optimum pH - 6,0



Optimum NaCl - 30%



Produkty metabolizmu - H

2

, H

2

S (w obecności S

0

)



Ziarniak



0,8 - 2,0 μm



Urzęsienie

lofotrichalne

Konstrukcja systemu ekspresyjnego

Pichia pastoris

pPICZαβ-gal

Produkcja β-D-galaktozydazy P. woesei

w systemie ekspresji P. pastoris (AOX1)

Indukcja ekspresji

genu

Krzywa wzrostu P. pastoris GS115 + pPICZαβ-

gal

24 – 47 h – 25% (m/v)
glicerol + 5*10

-4

% biotyna

+ 0,05% histydyna (0,24
ml/min)

48 – 72 h – 25% (v/v) MeOH
+ 5*10

-4

% biotyna +

0,05%

histydyna

(0,24

ml/min)

72 – 144 h – 30% (v/v)
MeOH + 5*10

-4

% biotyna +

0,05%

histydyna

(0,24

ml/min)

Pożywka BMGY (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 0,1 M K

2

HPO

4

/KH

2

PO

4

pH 6,0,

1,34% YNB, 4*10

-5

% biotyna, 2% glicerol), 30 °C, napowietrzanie 3,0 vvm,

mieszanie 1200 obr./min, Biostat R, 5l (B. Braun Biotech International, Niemcy), 2,5 l

objętości roboczej

Produkcja β-D-galaktozydazy P. woesei

w systemie ekspresji P. pastoris (AOX1)

M – LMW SDS Marker: 97, 66, 45, 30,
20,1 i 14,4 kDa

1 – pożywka hodowlana po 48 h hodowli

2 – pożywka hodowlana po 72 h hodowli

3 – pożywka hodowlana po 96 h hodowli

4 – pożywka hodowlana po 120 h
hodowli

5 – pożywka hodowlana po 144 h
hodowli

P. pastoris GS115 + pPICZαβ-

gal

Izolacja β-D-galaktozydazy P. woesei

z pożywki pohodowlanej

Etap oczyszczania

Ilość białka [mg]

Pożywka pohodowlana

520

Wysalanie białek siarczanem

amonu

338

Strącanie termiczne białek

302

Szczepionki zawierające

rekombinantowe antygeny

białkowe

Cechy idealnej szczepionki

 skuteczność

 bezpieczeństwo

 trwałość

 łatwość podawania

 niska cena

 łatwość i bezpieczeństwo produkcji

Szczepionka

– produkt pochodzenia biologicznego

zawierający

substancje

zdolne

do

wywołania

określonych

procesów

immunologicznych

warunkujących powstanie trwałej odporności bez
wywoływania działań toksycznych

Inne

składniki

Inne

składniki

Substancja

stabilizująca

Substancja

stabilizująca

Substancja

konserwująca

Substancja

konserwująca

Adiuwant

Adiuwant

Antygen

Antygen

Elementy

składowe

szczepionki

Elementy

składowe

szczepionki

Szczepionki zawierające

rekombinantowe antygeny białkowe

Charakterystyka szczepionek

 Ściśle zdefiniowany skład
 Bezpieczeństwo produkcji

• wyeliminowanie

konieczności

hodowli

mikroorganizmów

chorobotwórczych w celu izolacji antygenów szczepionkowych

• mikroorganizmy

stosowane

do

produkcji

antygenów

rekombinantowych o statusie GRAS (Generally Recognized as Safe)

 Bezpieczeństwo stosowania

• brak możliwości wywołania choroby
• niska odczynowość

 Wymagają stosowania adiuwantów
 Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu

produkcji

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Czynnik etiologiczny – wirus

HBV

 Rodzina: Hepadnaviridae

 Rodzaj: Orthohepadnavirus
 Struktura:

ikosaedralny

nukleokapsyd otoczony podwójną
osłonką; kulisty; śr. 42 nm

 Kwas nukleinowy: DNA
 Replikacja: hepatocyty
 Rezerwuar: człowiek

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

 Droga przenoszenia: krew i płyny

ustrojowe, w tym wydzielina
szyjki macicy, nasienie



Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μl
krwi może spowodować zakażenie

 Hodowla

w

warunkach

laboratoryjnych – nie zakaża
zarodków kurzych i powszechnie
stosowanych linii komórkowych

We krwi do 10

10

wirusów/ml

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B

 Okres wylęgania 2 – 3 miesiące
 Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka
 Żółtaczka

Wyzdrowienie

(90%)

Nadostre

zapalenie

wątroby

(0,1%)

Zgon

Przewlekłe zakażenie

(10%)

Antygenemi

a

brak

uszkodzenia

wątroby

Przetrwałe

zapalenie

wątroby

niewielkie

uszkodzenie wątroby

Aktywne

zapalenie

wątroby

Marskość
wątroby

Pierwotny rak
wątroby

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Wirusowe zapalenie wątroby typu B

zakażenie okołoporodowe

 Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B

 zakażenie z ostrymi objawami choroby

 Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B

 zakażenie bez ostrych objawów choroby
 nosicielstwo HBV
 śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców,

15% dziewczynek)

Na świecie 200 mln nosicieli HBV

z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Antygeny wirusa HBV

 HBcAg – białko rdzenia
 HBeAg – białko rdzenia
 HBsAg – białko powierzchniowe

• tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa
• nadmiar białka obecny we krwi w

postaci kulistych lub pałeczkowatych
agregatów

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy
 preS1
 preS2
 S

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki I generacji

(plazmatyczne)

 Substancja czynna – białkowy

antygen powierzchniowy HBsAg

• białko S
• śladowe ilości białka preS1
• śladowe ilości białka preS2

 Sposób otrzymywania – izolacja

ciał kulistych i pałeczkowatych z

krwi bezobjawowych nosicieli

HBV,

inaktywacja

formaldehydem

 Bezpieczeństwo

–

ryzyko

transmisji

patogenów

przenoszonych przez krew

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

Pierwsza szczepionka

zarejestrowana w 1986 r.

 Substancja czynna – białkowy antygen

powierzchniowy HBsAg

• białko S

 Sposób otrzymywania – produkcja

białka S w komórkach drożdży S.
cerevisiae

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II

generacji

(rekombinowane)

Pierwszy układ ekspresyjny

opublikowany w 1982 r.

(P. Valenzuela, A. Medina, W.J.
Rutter, Nature, 289, 347 – 350)

 wektor ekspresyjny – pHBS-16

• autonomiczna replikacja

• ori replikacji pBR322
• gen oporności na ampicylinę
• ori replikacji plamidu 2μ
• gen trp1
• sekwencja kodująca białko S pod

kontrolą

promotora

ADH

I

dehydrogenazy alkoholowej I

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

 gospodarz – S. cerevisiae XV610-

8C

• szczep

auksotroficzny

–

brak

zdolności do wzrostu na podłożu nie
zawierającym tryptofanu

 białko S produkowane w postaci

kulistych agregatów

(agregaty 1000x bardziej

immunogenne

niż

pojedyncze

cząsteczki białka S)

 2 – 5 μg białka z 200 ml hodowli

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Schemat szczepienia

Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał

w cyklu szczepień przeciwko WZW typu B

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II generacji (rekombinowane)

 Skuteczność szczepionki

• u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem
• 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed

zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia

 Bezpieczeństwo szczepionki – wysokie

• może być stosowana u kobiet ciężarnych

• matek karmiących piersią

• osób z niedoborami odporności

 Niepożądane odczyny poszczepienne

• łagodne miejscowe odczyny poszczepienne
• rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych,

wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony

układu nerwowego

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II generacji (rekombinowane)

 Dostępne w postaci szczepionek monowalentnych

• Engerix B, GlaxoSmithKline
• H-B-VAX, Merck Sharp Dohme

 Dostępne w postaci szczepionek skojarzonych

• Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib,

WZW B)

• Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)
• Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II generacji (rekombinowane)

 Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych

Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine,
Korea)

 Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych

Pichia pastoris

 wektory ekspresyjne zintegrowane z chromosomem gospodarza

(stabilne konstrukty)

 indukowana metanolem ekspresja genów [geny klonowane pod

kontrolę promotorów AOX lub MOX – oksydazy alkoholowej u P.
pastoris (metanolowej u H. polymorpha)]

Szczepionki przeciwko wirusowi HPV

(wirusowi ludzkiego brodawczaka)

 Silgard (MSD)

Substancja czynna – białko L1

czterech typów HPV (16, 18, 6 i

11)

 Cervarix

(GlaxoSmithCline)

Substancja czynna – białko L1

dwóch typów HPV (16 i 18)

Białko L1 produkowane w drożdżach S.
cerevisiae