Igła w stogu siana

W 1961 r chmary ptaków – głównie

burzyków

szarych

zaatakowały

nadmorskie miasto Capitola w Kalifornii.

Zimą 1987 r ponad setka ludzi

rozchorowała się po zjedzeniu małży -

omułków

jadalnych

w restauracjach na wyspie Prince Edward

w Kanadzie.

Przypuszcza się, że oba te wydarzenia były

wywołane taką samą - wspólną przyczyną.

Igła w stogu siana

Bardzo szybko okazało się, że nie jest to zwykłe

zatrucie pokarmowe.

Wymioty, skurcze, biegunka, obezwładniający ból

głowy i następujące po nim zmieszanie połączone
z utratą pamięci, dezorientacja połączona z
napadami śpiączki były objawami poważnego
zatrucia. Niektórzy z zatrutych wykazywali
zmienność emocji przez niekontrolowany płacz
lub nadmierną agresywność. Troje starszych ludzi
zmarło.

Igła w stogu siana

Tragicznym objawem była utrata tzw.

pamięci krótkotrwałej u jednej czwartej

ofiar zatrucia (np. nie mogli zapamiętać

nic co się zdarzyło po zatruciu). Niektórzy

nie rozpoznawali otoczenia lub swoich

bliskich. Nie byli w stanie nauczyć się

czegokolwiek

nowego.

Najpoważniej

poszkodowani utracili pamięć do kilku lat

wstecz. Dla dwunastu ofiar utrata pamięci

krótkotrwałej była nieodwracalna.

Tajemnicze zdarzenie nazwano:

amnezyjnym zatruciem małżami.

Analiza toksykologiczna

Faza I

Faza II

utlenianie
redukcja
hydroliza sprzęganie

Trucizna ---------> Metabolit ------->

Metabolit

enzymy enzymy

Przemiany trucizn (toksyn) w
organizmie żywym

Analiza toksykologiczna

C OH

C N

O H

Kwas

benzoesowy

Kwas

hipurowy

Kwas benzoilo

glukuronowy

C OH

O SO

Kwas

Koniugaty kwasu

hydroksybenzoesowy

hydroksybenzoesowego

Technika

Rodzaj analizowanej

próbki

Zakres

czułości

Chromatografia

gazowa: bardzo

wszechstronna i

szeroko stosowana

Ciało stałe, ciecz lub gaz

Lotne związki organiczne

lub nieorganiczne, gazy

trwałe

ppb lub ng/l

do g/l

Chromatografia

cieczowa: technika

analityczna do

rozdzielania

składników

nielotnych.

Lotne i nielotne ciecze

organiczne i nieorganiczne,

związki biologiczne,

polimery, związki chiralne,

termicznie nietrwałe

związki, małe jony

i makrocząsteczki.

ppb lub µg/l

do g/l

Elektroforeza

kapilarna: analiza

dużych

biocząsteczek

wymagających

próbki tylko w

nanolitrach.

Ciekłe związki polarne

i niepolarne, niektóre

pierwiastki, związki

organiczne jonowe

i niejonowe, nieorganiczne

kationy i aniony,

makrocząsteczki i związki

chiralne.

ppb lub µg/l

do g/l

Chromatografia gazowa

Oznaczanie poziomu temazepamu w krwi

przy pomocy chromatografii gazowej

Chromatografia gazowa

W celu oznaczenia metodą chromatografii gazowej

związków trudno lotnych najczęściej polarnych
należy je przeprowadzić w pochodne np. sililowe
przy pomocy różnych odczynników takich jak np.

TBDMSCl

tert-butylodimetylo-

chlorosilan

N-metylo-N-(tert-butylodimetylosililo)

-trifluoro acetamid

Metody

detekcji

Zasada
testu
radioimmu
no-
logicznego

Test
przesiewowy

Igła w stogu siana

Wstępne badania przesiewowe na znane

patogeny bakteryjne i wirusowe nie wykazały

zagrożenia.
Równie negatywny wynik dało badanie na

obecność

metali

ciężkich,

pestycydów

polichlorowanych bifenyli.

Próbki małży stanowiły niesłychanie złożony

materiał badawczy zawierały tysiące różnych

związków chemicznych. Powstało pytanie jak

można wyizolować jeden składnik z tak złożonej

mieszaniny nic nie wiedząc na temat jego

fizycznych

czy

chemicznych

właściwości.

Przypomina to poszukiwanie „igły w stogu

siana”.

Igła w stogu siana

Jak wykonać takie poszukiwanie?
Czy istnieje szansa na znalezienie odpowiedzi?

Do rozwiązania problemu powołano zespół

w skład którego wchodzili wszyscy chemicy

i biolodzy morza zatrudnieni w Atlantic

Research Laboratory (ARL) of National

Research Council in Halifax Nova Scotia oraz

kilku

naukowców

z Department of Fisheries and Oceans (DFO),

jak również personel obeznany z techniką

testów biologicznych na myszach.

Problem rozwiązano po 102 godzinach od

rozpoczęcia wspólnej pracy stosując taktykę
przedstawioną na następnym przeźroczu.

Igła w stogu siana

By uniknąć dużych statystycznych fluktuacji

związanych z niehomogennością, wszystkie

eksperymenty prowadzono na dużych porcjach

homogenizatów zarówno toksycznych jak

i kontrolnych małży. Kontrola dawki w teście

biologicznym ma ogromne znaczenie w

efektywnym śledzeniu i ustaleniu toksyczności.

Doświadczalną krzywą przedstawia następne

przeźrocze, z którego wynika, że dla

efektywnego śledzenia toksyczności wystarcza

około 0,6 g tkanek małży.

Igła w stogu siana

Krzywa zależności czasu śmierci myszy od
wielkości dawki wagowej tkanek małży.

Igła w stogu siana

Dla potrzeb analizy
wykorzystano
wprawdzie brutalny
ale bardzo pewny
test

biologiczny.

Próbki

izolowanej

substancji
wstrzykiwano
myszom.

Igła w stogu siana

Wstrzyknięcie (iniekcja) myszy małej

ilości próbki, w przypadku obecności

toksyny wywoływało bardzo wyraźną

neurologiczną

odpowiedź:

mysz

mimowolnie drapała swoje barki

tylnymi

nogami,

drżała

a w końcu padała wskutek uduszenia.

Igła w stogu siana

Zastosowano standardowe metody fizyczne

rozdziału

złożonej

mieszaniny

stanowiącej próbkę toksycznych małży.

Jednocześnie

same

procedury

zastosowano do nietoksycznej próbki

małży, pozwoliło to porównywać identyczne

frakcje obu analizowanych ciągów próbek.

Jakakolwiek różnica w widmach lub

chromatogramach między toksyczną a

kontrolną próbką mogła stanowić klucz do

znalezienia toksycznego czynnika.

Igła w stogu siana

Większość narkotyków i trucizn jest rozpuszczalnych

w tłuszczach lub w wodzie stąd logicznym było by

pierwszym

krokiem

izolacji

była

ekstrakcja

rozpuszczalnikiem. By uniknąć możliwego rozkładu

przez temperaturę bądź agresywny rozpuszczalnik,

rozdrobnione małże ekstrahowano w temperaturze

pokojowej

wodnym

roztworem

metanolu.

Wprawdzie ekstrakcja była niepełna ale zakończyła

się sukcesem, test biologiczny na myszach dawał dla

ekstraktu metanolowego identyczny rezultat jak dla

wyjściowej próbki małży. Ekstrakt zatężono przez

odparowanie. Pary okazały się nietoksyczne,

pozostałość ekstrahowano mieszaniną woda -

chlorek metylenu

Igła w stogu

siana

Procedury ekstrakcji
i frakcjonowania użyte
w badaniach toksycznych
małży.

HPLC – wysokosprawna
chromatografia cieczowa

HVPE – wysokonapięciowa
elektroforeza bibułowa

Igła w stogu siana

Kolumna XAD-2 - kolumna z syntetyczną żywicą

polistyrenową typu „Amberlit” lecz bez grup
jonowych, działa wyłącznie na zasadzie adsorpcji.

Zmieniając równowagę hydrofobowo/hydrofilową

zaadsorbowanych cząsteczek dokonujemy ich
rozdziału. Np. wolne kwasy tłuszczowe silniej się
adsorbują niż ich sole sodowe zatem będą
eluowane z kolumny przez roztwór wodorotlenku
sodowego.

Igła w stogu

siana

Ogólna zasada strategii
opartej na próbach
biologicznych.

Pełne kółka oznaczają
dodatni wynik testu
biologicznego.

Igła w stogu siana

Ekstrakt w chlorku metylenu z toksycznych małży

zawierał szereg barwnych substancji nieobecnych
w próbce kontrolnej. Widmo absorpcyjne światła
widzialnego wykazywało kształt charakterystyczny
dla

widma

absorpcyjnego

pigmentów

fitoplanktonu. Dodatkowe badanie toksycznych
małży ujawniło, że ich układy trawienne są
wypełnione zielonym planktonem, podczas gdy w
próbce kontrolnej nie. Jednakże same pigmenty
okazały się nie toksyczne. Frakcja chlorku
metylenu dawała negatywny wynik w teście
biologicznym. Warstwa wodna zawierała toksynę
wskazując, że jest to polarna jonizująca się
substancja.

Igła w stogu siana

Otrzymany wynik pozwolił na odrzucenie bardzo

złożonej

mieszaniny

zawartej

chlorku

metylenu pozostawiając do badań znacznie

prostszy roztwór wodny.

Do rozdzielenia próbki na prostsze frakcje użyto

chromatografii kolumnowej. Rozdział wykonano

na kolumnie wypełnionej żywicą XAD-2, która

wychwytuje niepolarne związki pozwalając

przepływać jonom. Z wielu otrzymanych frakcji

tylko jedna była toksyczna. Dla dodatkowego

oczyszczenia toksyczną frakcję rozdzielono na

HPLC z odwróconą fazą. Otrzymano pojedynczą

dobrze oczyszczoną frakcję, która wykazywała

toksyczność identyczną z oryginalną próbka

małży.

Igła w stogu siana

By upewnić się, że wyizolowana przez HPLC frakcja

jest rzeczywiście wyizolowaną toksyną Ponownie
rozdzielono wodną frakcję z kolumny XAD-2 stosując
zupełnie inną technikę rozdziału. Tym razem użyto
wysoko napięciowej elektroforezy bibułowej (HVPE).
W toksycznej frakcji zaobserwowano pasmo bardzo
blisko pasma kwasu glutaminowego, jednocześnie
w próbce kontrolnej brak było tego pasma.
Substancja wydzielona z pasma podana na HPLC
miała identyczny czas retencji jak substancja
toksyczna

wyizolowana

pierwotnie.

Jak

też

wykazywała taką samą toksyczność.