Wykład 1

Zalecana literatura:

PODSTAWY BIOLOGII KOMÓRKI cz. I i II
Alberts Bruce i wsp.
BIOLOGIA MOLEKULARNA – krótkie wykłady
P.C.Turner i wsp.
BIOLOGIA MOLEKULARNA W MEDYCYNIE. ELEMENTY GENETYKI KLINICZNEJ
Jerzy Bal
BIOCHEMIA– krótkie wykłady
David Hames, Nigel Hooper
STRUKTURALNE PODSTAWY BIOLOGII KOMÓRKI
Wincenty Kilarski
CYTOBIOCHEMIA
Leokadia Kłyszejko – Stefanowicz
PODSTAWY MOLEKULARNE
BIOLOGII KOMÓRKI.
ASPEKTY MEDYCZNE.
Gerald M.Fuller, Dennis Shields
FIZJOLOGIA CZŁOWIEKA Z ELEMENTAMI FIZJOLOGII STOSOWANEJ I KLINICZNEJ
Traczyk Władysław Z
GENETYKA CZŁOWIEKA. ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW MEDYCZNYCH
Bruce R. Korf
HISTOLOGIA
Wojciech Sawicki
FIZJOLOGIA CZŁOWIEKA W ZARYSIE
Traczyk Władysław Z.

IMMUNOLOGIA
Jakub Gołąb i wsp.
BIOLOGIA ZWIERZĄT
KRÓTKIE WYKŁADY
Richard Jurd
HISTOLOGIA CZŁOWIEKA
Zabel (red.)

MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL
4th ed.
Alberts et al.
HUMAN ANATOMY AND PHYSIOLOGY
Marieb E.N.

Organella

Struktury o specyficznej budowie i funkcji tworzące

część komórki.
Organelle
•Obłonione

•Pojedyńczą błoną – lizosomy, siateczka

śródplazmatyczna, aparat Golgiego,

peroksysomy, wodniczki
•Dwiema błonami – jądro komórkowe,

mitochondria,

chloroplasty

•Nieobłonione – rybosomy, mikrotubule, jąderko,

centriole
•Błona komórkowa

Komórka

Najmniejszy

samoodtwarzający się

układ biologiczny.

Cechy
•Zdolność do pobierania

z otoczenia i

przyswajania

niezbędnych do życia

sybstancji
•Wydalanie

niepotrzebnych i

szkodliwych produktów

przemiany materii
•Reagowanie na zmiany

w otaczającym

środowisku
•Zdolność do wzrostu
•Zdolność do mnożenia

się i przekazywania

swoich cech komórkom

potomnym

Tkanka

•Zespół złożony z

powiązanych ze sobą

przestrzennie komórek
•o wspólnym

pochodzeniu i
• podobnej budowie,
•pełniących takie same

funkcje
•oraz z wytworzonej

przez te komórki

substancji

międzykomórkowej

Narząd

•Morfologicznie

wyodrębniona część

strukturalna organizmu

wielokomórkowego
•Zbudowana według

określonego planu
•Jeden (mózg) lub wiele

rodzajów tkanek
•Przystosowanie do

pełnienia określonej

funkcji

Techniki mikroskopowe

Historia mikroskopii i badań

Historia mikroskopii i badań

komórek

komórek

1590 - Zachariasz Jansen i

syn Hans
pierwsza konstrukcja

mikroskopu o pow. 10x i

30x. Obserwacje całych

organizmów (pchła).

1611 - Kepler projekt
mikroskopu świetlnego

1609 – Galileusz opracował zasady
działania soczewek i stworzył
bardzej skomplikowane urzędzenie
mikroskopowe

Antonie van Leeuwenhoeck –
ojciec mikroskopii

Powiększenie do 300x.
Obserwacje pierwotniaków i
bakterii oraz różnic pomiędzy
budową krwinek czerwonych u
różnych grup kręgowców

Ponad 100 !!! doniesień w Towarzystwie
Królewskim Anglii i Akademii Francuskiej

1655 - Robert Hook,
powiększenie mikroskopu 100x
-150x.

Obserwacje korka - termin
komórka

Historia mikroskopii i badań

Historia mikroskopii i badań

komórek

komórek

 

                                     

Historia mikroskopii i badań

Historia mikroskopii i badań

komórek

komórek

1911 - mikroskop fluorescencyjny

1930 Lebedeff - mikroskop
interferencyjny

1931 pierwszy
mikroskop
elektronowy, Nobel
1996

1932 Zernike
mikroskop z
kontrastem
fazowym

1938 - mikroskop
skanningowy, pierwszy
komercyjny mikroskop
elektronowy, Zeiss

1953 Kontrast
Nomarskiego

1988 - mikroskop
konfokalny

Budowa mikroskopu świetlnego

Budowa mikroskopu świetlnego

Okulary:
- przekazują w powiększeniu do oka
obserwatora obraz pośredni preparatu
- koryguje szczątkowe abberacje
- umożliwia prowadzenie pomiarów
mikroskopowych.
Składają się z przynajmniej dwóch
soczewek płaskowypukłych, które są
zwrócone powierzchnią płaską ku
górze. Obie soczewki są umieszczone w
odległości równej połowie sumy ich
długości ogniskowych. Okular

- powiększa
- daje obraz urojony.

Soczewka oczna (górna) powiększa
obraz, zbierająca (dolna) zmniejsza
obraz rzeczywisty wprowadzony i czyni
go bardziej wyraźnym.

Obiektywy:
Decyduje w głównej mierze o
jakości odwzorowania
mikroskopowego. Składają się
z kilku ściśle ze sobą
złączonych soczewek.
Obiektywy
- suche
- imersyjne

Kondensor
Jest to ruchomy, specjalny układ
soczewek oprawiony w metalowy
pierścień i umocowany pod stolikiem.
Daje on bardzo zbieżną wiązkę światła
i eliminującą prawie całkowicie
promienie rozbieżne.
W celu ograniczenia dopływu światła
stosuje się specjalne przesłony
(blendy), umieszczone nad źródłem
światła

Urządzenie oświetlające:
oświetlacz halogenowy o mocy 20W z
regulacją natężenia światła

typy oświetlenia:

•oświetlenie jasnego pola

•oświetlenie ciemnego pola

•oświetlenie przechodzące

•oświetlenie padające

Zdolność rozdzielcza

określa się w jednostkach długości jako najmniejszą odległość dwóch
struktur, dających się rozróżnić w obrazie mikroskopu jako dwie
oddzielne struktury (dwa oddzielne punkty). Zależy od: długości fali;
wielkości kąta aperturowago i współczynnika załamania światła.

Zdolność rozdzielczą obiektywu ogranicza
dyfrakcja światła przechodzącego przez obiekt.

Wiązki światła ugięte na poszczególnych punktach
preparatu tworzą obraz w postaci koncentrycznych
pierścieni Airy’ego.

rozdzielczość (r) =  /(2NA)
rozdzielczość (r) = 0.61 /NA
rozdzielczość n (r) = 1.22 /

(NA(obj) + NA(cond))

Zdolność rozdzielcza (D) jest zależna od

apertury

numerycznej

(NA)

obiektywu; im jest wyższa tym

większa jest zdolność rozdzielcza i siła światła

Graniczna wartość zdolności rozdzielczej zależna jest
od długości używanej do badania fali świetlnej i wynosi
ok. 0,2 m.
Dla światła niebieskiego (dł.fali 0.5m) granica

zdolności rozdzielczej wynosi 0.17m, a dla ultrafioletu

(dł.fali 0.275m) około 0.08m.

NA

obj.

= n(sin )

n - wartość współczynnika
załamania światła (medium:
woda/olejek imersyjny)
 – kąt aperturowy pomiędzy
wiązką przechodzącą przez oś
optyczną soczewki a graniczną
wiązką wpadającą do obiektu

• Wiązka światła
biegnąca od źródła
światła zostaje odbita
przez zwierciadło
mikroskopu do
kondensora,
przechodzi przez
preparat, obiektyw i
okulary do oka.

Powiększenie: do ok.
3500x

Rozdzielczość: ok.
200nm

Materiał: żywy lub
utrwalony.

Utrwalanie materiału:
utrwalaczami
aldehydowymi lub
alkoholowymi.

Zazwyczaj konieczne
wybarwienie.

Mikroskop świetlny

Jasne pole przy świetle

Jasne pole przy świetle

przechodzącym

przechodzącym

• Najczęściej stosowany w
badaniach.

• Obraz powstaje dzięki
przezroczystości preparatu, który
absorbuje część światła.

• utrwalenie preparatu

• barwienia cytologiczne i
histochemiczne

Ciemne pole

•Różnica w kondensorze, który w
szczególny sposób oświetla
badany obiekt.

•Do obiektywu mikroskopu
wpadają wyłącznie promienie
ugięte na strukturach obiektu.
Promienie nie ugięte są
eliminowane.

•Struktury rozpraszające światło
są widoczne jako jasno świecące
struktury na ciemnym tle.

Kontrast fazowy

Obiekty amplitudowe i fazowe

(np. komórki z naturalnymi
barwnikami lub o
zróżnicowanej gęstości
struktur)
Fala świetlna jest w różnym
stopniu pochłaniana przez
obiekt,
amplituda fali wychodzącej z
obiektu jest mniejsza
Obraz rejestrowany jest jako
barwny lub kontrastowy

(np. bezbarwne i o niskiej gęstości) fala
świetlna
nie jest pochłaniana przez obiekt lub
pochłaniana jest
w niewielkim stopniu (nierozróżniającym się
od ośrodka)
Fala świetlna przechodząc przez obiekt ulega
przesunięciu w fazie (opóżnieniu bądź
przyspieszeniu o 1/4)

Pozytywny kontrast powoduje przyspieszenie
fazy S relatywnie do opóźnienia fazy D,
negatywny kontrast powoduje opóźnienie
fazy S z zachowaniem fali rozszczepienia
światła na badanej próbie.

Technika kontrastu fazowego

stosuje mechanizm optyczny do

wychwycenia opóźnienia fazy co

odpowiada zmianie amplitudy,

która może być widziana jako

różnica w kontraście obrazu.

Modulacyjny

kontrast Hoffmana

został

zaprojektowany w

celu

Wzmocnienia

kontrastu obiektów

niebarwionych i

żywych poprzez

detekcję kątów

nachyleń

Mikroskop fluorescencyjny

Mikroskop fluorescencyjny

Światło

wzbudzenia

oddzielone

jest

od światła

emisji przez

odpowiednie

filtry

Filtr = lustro dichroiczne odbija światło

o krótszej fali i przepuszcza światło o fali

dłuższej

Filtr emisji blokuje pozostałości światła
wzbudzenia

Konwolucja

nakładanie się promieni pochodzących z ugięcie na
strukturach w warstwach leżących wyżej lub niżej niż
płaszczyzna ostrego widzenia na obraz, znajdujący się w
płaszczyźnie ostrego widzenia.

•Promień laserowy skanuje badany obiekt uginając się na jego
strukturach

•Skanowanie sterowane jest przez zestaw ruchomych luster

•Promienie świetlne biegną do fotopowielacza

•Przed nim znajduje się przesłona, która eliminuje światło emitowane
przez obiektywy leżące poza płaszczyzną fokalną obiektywu – daje czarne
tło. Filtruje promienie światła wychodzących z innych płaszczyzn
badanego obiektu niż płaszczyzna ostrości widzenia

•Informacje dotyczące poszczególnych punktów obrazu przekazywane są
do komputera

•Program komputerowy pozwala na odtwarzanie trójwymiarowej
struktury badanego obiektu

.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego

Zasada działania mikroskopu konfokalnego

Różnice między mikroskopem

fluorescencyjnym

a

konfokalnym

:

1. Źródło światła (

światło

/

laser

)

-

wiązka światła emitowana przez lampę jest
szeroka złożona z widm o różnej długości fali

-

laser emituje wiązkę światła o określonej
długości fali i średnicy ok. kilkuset nm

2. Oświetlenie obiektu:

-

obiekt jest oświetlany jednocześnie w 3D,
oprócz obiektu widzimy również swiatło
rozproszone

lub odbite na strukturach leżących obok

( boczna interferencja); nieostre zarysy struktur
leżących

poza płaszczyzną ogniskową – niska

rozdzielczość wertykalna)

-

w danej jednostce czasu oświetlany jest jeden
punkt preparatu co eliminuje boczną
interferencję

i zwiększa kontrast

Mikrometr
okularowy

Mikrometr
przedmioto
wy

Pomiary

Pomiary

mikrometr okularowy okular z podziałką, w którym
wyznaczono absolutną wartość (tzw. wartość
mikrometryczną) w jednostkach długości, odstępu
dwu kolejnych kresek w podziałce dla danego
obiektywu w mikroskopie
mikrometr przedmiotowy szkiełko przedmiotowe,
na którym precyzyjnie wyryta jest podziałka.
Odległość między dwiema kolejnymi (najmniejszymi)
kreskami podziałki wynosi 0.01 mm

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Powiększenie: do 50mln x
Rozdzielczość: do 0,05 nm
Przygotowanie materiału:
utrwalanie utrwalaczami
aldehydowymi i
kontrastowanie metalami
ciężkimi.

Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)

Powiększenie: do 50mln x
Rozdzielczość: do 0,05 nm
Przygotowanie materiału:
materiał po odwodnieniu
napylany metalem
szlachetnym.

Techniki molekularne

Techniki molekularne

Southern, Northern,

Southern, Northern,

Western blot

Western blot

PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy

RT-PCR

RT-PCR

– matrycą jest RNA, w pierwszym

etapie wykorzystuje się plimerazę DNA
zależną od RNA, tzw. odwrotną transkryptazę,
po wytwozeniu pierwszej nici DNA poddaje
się ją powieleniu w reakcji PCR

Inżynieria genetyczna – tworzenie mutantów

Inżynieria genetyczna – tworzenie mutantów

W jakim celu tworzone są

W jakim celu tworzone są

mutanty

mutanty

1. Unieczynnienie – nokaut badanego genu

2. Ndprodukcja białka kodowanego przez badany gen

3. Lokalizacja badanego białka – białka fuzyjne z GFP

4. Delecja lub wymiana aminokwasów podlegających
zmianom posttranslacyjnym