Leczenie choroby

Leczenie choroby

Parkinsona przy pomocy

Parkinsona przy pomocy

przeszczepów

przeszczepów

komórkowych.

komórkowych.

Sylwia Leppert

Sylwia Leppert

Biotechnologia grupa2

Biotechnologia grupa2

Przedstawienie problemu

Przedstawienie problemu

klinicznego

klinicznego

Choroba Parkinsona (PD):

Choroba Parkinsona (PD):

►

Degeneracja i utrata neuronów

Degeneracja i utrata neuronów

dopaminergicznych w istocie czarnej

dopaminergicznych w istocie czarnej

►

Formowanie ciałek Lewy’ego w istocie czarnej

Formowanie ciałek Lewy’ego w istocie czarnej

Objawy kliniczne:

Objawy kliniczne:

►

Drżenie spoczynkowe

Drżenie spoczynkowe

►

Spowolnienie ruchowe

Spowolnienie ruchowe

►

Zesztywnienie

Zesztywnienie

►

Zaburzenia równowagi

Zaburzenia równowagi

Przebieg doświadczenia

Przebieg doświadczenia

CEL

CEL

►

Przywrócenie utraconych neuronów dopaminergicznych w

Przywrócenie utraconych neuronów dopaminergicznych w

istocie czarnej oraz unerwienia dopaminowego w prążkowiu.

istocie czarnej oraz unerwienia dopaminowego w prążkowiu.

►

Wykorzystanie komórek zrębowych szpiku kostnego-

Wykorzystanie komórek zrębowych szpiku kostnego-

mezenchymalnych komórek macierzystych (BMSCs)

mezenchymalnych komórek macierzystych (BMSCs)

►

Porównanie efektu terapeutycznego:

Porównanie efektu terapeutycznego:

Przeszczepionych komórek zróżnicowanych

Przeszczepionych komórek zróżnicowanych

Przeszczepionych komórek niezróżnicowanych

Przeszczepionych komórek niezróżnicowanych

METODYKA

METODYKA

►

Bezpośrednie wszczepienie BMSCs

Bezpośrednie wszczepienie BMSCs

►

Wszczepienie wcześniej indukowanych do

Wszczepienie wcześniej indukowanych do

różnicowania BMSCs

różnicowania BMSCs

►

Ocena poprzez: próbę obrotową, barwienie

Ocena poprzez: próbę obrotową, barwienie

immunohistochemiczne

immunohistochemiczne

Hodowla, pasażowanie i identyfikacja BMSCs

Hodowla, pasażowanie i identyfikacja BMSCs

Indukowanie różnicowania:

Indukowanie różnicowania:

+EGF (epidermalny czynnik wzrostu),+ BFGF ( czynnik wzrostu

+EGF (epidermalny czynnik wzrostu),+ BFGF ( czynnik wzrostu

fibroblastów), +BDNF ( neurotropowy czynnik pochodzenia

fibroblastów), +BDNF ( neurotropowy czynnik pochodzenia

mózgowego), +GDNF ( glejopochodny czynnik neurotroficzny)

mózgowego), +GDNF ( glejopochodny czynnik neurotroficzny)

►

Wyznakowanie pc nestyny – ocena zróżnicowania

Wyznakowanie pc nestyny – ocena zróżnicowania

►

+ 100uM BrdU, Wyznakowanie pc BrdU- ocena proliferacji

+ 100uM BrdU, Wyznakowanie pc BrdU- ocena proliferacji

Model szczura z PD

Model szczura z PD





stereotaktyczne podanie 6- OHDA w

stereotaktyczne podanie 6- OHDA w

obrębie obszarów MFB (pęczka przyśrodkowego

obrębie obszarów MFB (pęczka przyśrodkowego

przodomózgowia) oraz prawej strony VTA (brzusznej części

przodomózgowia) oraz prawej strony VTA (brzusznej części

nakrywki śródmózgowia)

nakrywki śródmózgowia)

+apomorfina

+apomorfina

Próba obrotowa- ocena uszkodzeń mózgu

Próba obrotowa- ocena uszkodzeń mózgu

Przed transplantacją komórek- trypsynizacja, przepłukanie

Przed transplantacją komórek- trypsynizacja, przepłukanie

DMEM, wirowanie.

DMEM, wirowanie.

3grupy diagnostyczne

3grupy diagnostyczne

:

:

1

1

- 25 szczurów z przeszczepionymi wcześniej

- 25 szczurów z przeszczepionymi wcześniej

zróżnicowanymi

zróżnicowanymi

komórkami BMSCs

komórkami BMSCs

2

2

- 25 szczurów z przeszczepionymi

- 25 szczurów z przeszczepionymi

nie zróżnicowanymi

nie zróżnicowanymi

komórkami BMSCs

komórkami BMSCs

3

3

- 21 szczurów, grupa kontrolna z solą fizjologiczną

- 21 szczurów, grupa kontrolna z solą fizjologiczną

Każdy szczur- 6*10

Każdy szczur- 6*10

5

5

komórek

komórek

+apomorfina

+apomorfina





pomiar ilości obrotów w przedziale czasu

pomiar ilości obrotów w przedziale czasu

Histologiczna identyfikacja po transplantacji

Histologiczna identyfikacja po transplantacji





1 tydzień

1 tydzień

+pc anty BrdU

+pc anty BrdU

+pc anty nestyna

+pc anty nestyna

+pc anty NSE (enolaza swoista dla neuronów)

+pc anty NSE (enolaza swoista dla neuronów)

+pc anty GFAP (kwaśne białko włókienkowe)

+pc anty GFAP (kwaśne białko włókienkowe)

+pc anty TH ( hydroksylaza tyrozyny)

+pc anty TH ( hydroksylaza tyrozyny)





1,3,5 miesięcy

1,3,5 miesięcy

Detekcja TH dodatnich komórek (TH- IR)

Detekcja TH dodatnich komórek (TH- IR)



Detekcja poziomu DA w prążkowiu przy pomocy HPLC

Detekcja poziomu DA w prążkowiu przy pomocy HPLC

Ocena statystyczna wyników - ANOVA

Ocena statystyczna wyników - ANOVA

WYNIKI

WYNIKI

Immunohistochemiczne barwienie hodowli BMSCs in vitro poddanej

Immunohistochemiczne barwienie hodowli BMSCs in vitro poddanej

działaniu czynników różnicujących

działaniu czynników różnicujących

A- komórki nestyno- dodatnie

A- komórki nestyno- dodatnie

64,8

64,8

+/- 7,8%

+/- 7,8%

B- komórki BrdU- dodatnie

B- komórki BrdU- dodatnie

72

72

+/- 10,6%

+/- 10,6%

►

Zmniejszone zahowanie rotacyjne u szczurów po 5 miesiącach

Zmniejszone zahowanie rotacyjne u szczurów po 5 miesiącach

od transplantacji

od transplantacji

Tydzień po

Tydzień po

tranplantacji

tranplantacji

(komórek grupy 1)

(komórek grupy 1)

Miesiąc po

Miesiąc po

transplantacji

transplantacji

(komórek grupy 1)

(komórek grupy 1)

Brak znaczących różnic

Brak znaczących różnic

wśród komórek TH-

wśród komórek TH-

dodatnich w istocie czarnej.

dodatnich w istocie czarnej.

►

Zawartość DA w prążkowiu 3miesiące po transplantacji:

Zawartość DA w prążkowiu 3miesiące po transplantacji:

334

334

ug/g w grupie 1

ug/g w grupie 1

325

325

ug/g w grupie 2

ug/g w grupie 2

76 ug/g w grupie kontrolnej

76 ug/g w grupie kontrolnej

►

W obecnych badanich odsetek powstałych astrocytów w prążkowiu po

W obecnych badanich odsetek powstałych astrocytów w prążkowiu po

tranplantacji był większy w przypadku grupy1 niż w pozostałych dwóch,

tranplantacji był większy w przypadku grupy1 niż w pozostałych dwóch,

co wkskazuje, iż wszczepienie już zróżnicowanych BMSCs zapewnia

co wkskazuje, iż wszczepienie już zróżnicowanych BMSCs zapewnia

lepszy efekt terapeutyczny

lepszy efekt terapeutyczny

wnioski

wnioski

►

BMSCs in vivo mogą przekraczać barierę krew- mózg,

BMSCs in vivo mogą przekraczać barierę krew- mózg,

integrować z lokalną tkanką, migrować wewnątrz mózgu,

integrować z lokalną tkanką, migrować wewnątrz mózgu,

wywoływać rekonstrukcję

wywoływać rekonstrukcję

►

Są zdolne do trans- dyferencjacji (po działaniu induktorów) w

Są zdolne do trans- dyferencjacji (po działaniu induktorów) w

komórki nerwowe i glejowe

komórki nerwowe i glejowe

►

Ponadto są łatwe do izolowania, oczyszczenia, hodowania i

Ponadto są łatwe do izolowania, oczyszczenia, hodowania i

zdolne do przeżycia przez długi czas po transplantacji do OUN.

zdolne do przeżycia przez długi czas po transplantacji do OUN.

Nadzieja dla terapii genowej chorób układu nerwowego

Nadzieja dla terapii genowej chorób układu nerwowego

żródło

żródło

Na pdst.

Na pdst. Min Ye, Xi-Jin Wang, Yu-Hong Zhang, Guo-
Qiang Lu, Liang Liang, Jie-Yi Xu, Sheng-Di Chen

„

„Therapeutic effects of differentiated bone marrow
stromal cell transplantation on rat models of
Parkinson’s disease” 2007