Co to jest hodowla in vitro?
Hodowla komórek in vitro to metoda utrzymwyania komórek prokariotycznych, eukariotycznych, zwirzęcych lub roślinnych przy życiu poza organizmem w ściśle kontrolowanych warunkach.
Hodowla in vitro narzadów, tkanek i komórek odbywa się w określonej temperaturze w inkubatorze, w medium zawierającym czynniki wzrostowe oraz składniki odżywiające komórki.
Hodowla in vitro trwa dłużej niż 24 godziny. W trakcie hodowli powstają klony, w których wszystkie komórki mają identyczny genotyp (chyba że wystąpią mutacje).

Hodowle różnią się, oczywiście, w zależności od materiału:
Hodowla tkankowa (tissue culture) – hodowla wszystkich elementów pochodzących z tkanki (eksplanty)
Hodowla narządów (organ culture) – hodowla całych narządów
Hodowla komórek (cell culture) – hodowla komórek zdyspersowanych
Hodowla histotypowa (histotypic culture) – hodowla komórek na elementach macierzy pozakomórkowej reagregujących i odtwarzających strukturę tkanki.
Hodowla organotypowa (organotypic culture) – hodowla komórek na elementach macierzy reorganizujących się w narządach.

Hodowla narządowa:
- Hodowla narządów, głównie pochodzących z embrionów;
- Zachowuje sferyczną lub trójwymiarową strukturę.
Zalety:
+ Utrzymuje prawidłowe funkcje fizjologiczne
+ Komórki pzoostają terminalnie zróżnicowane
Wady:
- Ograniczenie rozmiaru
- Dla każdego eksperymentu konieczne jest pobranie świeżego eksplantu

Hodowla tkankowa:
- Hodowla fragmentu tkanki pobranego z organizmu.
- Po umieszczeniu w naczyniu przyczepia się i następuje migracja komórek.

Zalety:
+ Część fizjologicznych funkcji zostaje zachowana
+ Korzystniejszy stosunek wielkości niż w przypadku narządowej
Wady:
- Stopniowa utrata oryginalnej organizacji tkanki.

Hodowla komórkowa.
Uzyskana z komórek migrujących z eksplantu lub z umieszczonych jako inculum, uprzednio wyizolowanych pojedynczych komórek.
Komórki mogą rosnąć w zawiesinie (np. komórki krwi) lub jako monolayer.
Zalety:
+ Uzyskanie kolejnych generacji komórek (linie komórkowe)
+ Stosowana może być na szeroką skalę
Wady:
- Cechy komórek ulegają zmianie w porównaniu z warunkami in vivo.
Powodzenie hodowli:
- Zagrożeniem dla hodowli są mikroorganizmy, które są wszędobylskie.
- Przed zakażeniami zabezpieczają antybiotyki i aseptyczne warunki laboratoryjne (czysta powierzchnia do pracy, zachowanie czystości przez personel – mycie rąk, fartuch, nakrycie głowy, rękawiczki i maska; sterylność naczyń, przedmiotów, pożywek i odczynników).

Mykoplazma... Zagapiłem się.

Wszystkie materiały wchodzące w kontakt z hodowlami komórkowymi muszą być sterylne: jednorazowe pipety, butelki i płytki. Szkło jałowione lub autoklawowane przez dwie godziny w 180 st. C.
Surowica, antybiotyki, dodatki (witamin, soli) – sterylizowane przez filtrowanie 0,22 mikrometra.
Praca w warunkac jałowych, pod komorą, częste kontrole jałowości poprzez posiewy – zarówno komory, jak i inkubatora.
Kontrola w kierunku zanieczyszczeń mykoplazmami.

Sterylność: pozbawienie wszelkich żywych form (bakterie, grzyby, wirusy)
Aseptyczność: po prostu redukcja liczby powyższych do akceptowalnego poziomu
Większosć rzeczy używanych do hodowli musi być sterylna. Nie wystarczy aseptyczność.
- Promieniowanie UV, gamma
- Wysoka temperatura (sterylizacja)
- Autoklaw – wysoka temperatura i ciśnienie pary
- Filtrowanie (0,22 mikrometra)

Miejsce pracy:

Komora laminarna:
- Filtry HEPA wykonane ze szkła spiekanego
- Filtracja powietrza odbywa się przez pory wielkości 0,3 mikrometra
- Zatrzymuje większość (co najmniej 99,97%) zanieczyszczeń mechanicznych, a także komórki grzybów, pierwotniaków, bakterii oraz część wirusów.
- Mają też lampy UV.

Dwa typy komór laminarnych:
> Nadmuch powietrza poziomy (powietrze nie krąży, wydostaje się z komory i dostaje się do niej) lub pionowy (komory typu biohazard: zamknięty obieg powietrza)

> Komora horyzontalna – powietrze płynące w kierunku pracującego. Nie może być stosowana do pracy z materiałem niebezpiecznym. Chroni materiał, ale nie pracownika.
> Komora wertykalna – powietrze filtrowane, zanim wydostanie się z komory. Kierunek przepływu powietrza chroni zarówno materiał, jak i pracującego.

Efektywność komory laminarnej.
> Zależy od ciśnienia, z jakim powietrze przechodzi przez filtr
> Kiedy oporność filtrów wzrasta, wzrasta ciśnienie i spada prędkość przepływu przez filtry
> Przepływ poniżej 0,4 m/s powoduje spadek sterylności komory laminarnej
> Rutynowo należy kontrolować wydajność filtrów HEPA (co 3-6 mies).

Poziom ryzyka zależy od materiału, na jakim się pracuje.
Niskie: materiał z przebadanego źródła (zwierzęta laboratoryjne, np.), ustalone linie komórkowe niepochodzące od człowieka/naczelnych oraz dobrze scharakteryzowane ludzkie linie diploidalne o określonym czasie życia.
Średnie ryzyko – słabo scharakteryzowane linie komórek ssaków.
Wysokie – linie komórkowe z tkanek lub krwi ludzkiej, także te z endogennymi patogenami (wirusy i inne), a także linie używane jako model eksperymentalnych infekcji (modele komórkowe chorób zakaźnych).

Antybiotyki.
> Redukują zakażenia
> Pomagają w rozwoju oporności hodowli na zakażenia
ALE!
> Mogą tłumić i ukrywać zakażenia
> Mogą mieć wpływ na wzrost i metabolizm komórek.

Niski indeks terapeutyczny (wysoce toksyczne): amfoterycyna B (grzyby, drożdże), chloramfenikol, tetracykliny, nystatyna (grzyby).

Wysoki indeks terapeutyczny (mała toksyczność): Penicylina, streptomycyna, gentamycyna, kanamycyna, neomycyna.

Kluczowe czynniki w hodowli:
Temperatura
Tlen, CO2
pH
Wilgotność powietrza

Komórki zwierzęce hodować można w inkubatorze CO2, w temperaturze 37 st. C, w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla.

Naczynia do hodowli komórek in vitro:
- Komórki na błonie posiadają ujemne ładunki
- Plastik zazwyczaj jest odpowiednio przygotowany, by ułatwiać komórkom przyczepianie. Ma ładunki dodatnie.
- Można dodać czynniki ułatwiające przyczepianie (kolagen, fibrynę, fibrnektynę, lamininę, polilizynę, poliornitynę).

Butelki
- Zakręcane
- Chronią przed rozlaniem
- Trudna manipulacja wewnątrz.
- Zakrętki lite lub z filtrem

Płytki wielodołkowe
- Umożliwiają przeprowadzenie serii powtórzeń i kombinacji doświadczalnych
- sześcio, dwunasto, dwudziestocztero, czterdziestoośmio lub 96-dołkowe
Szalki Petriego
- Łatwa manipulacja
- Duża powierzchnia, duża powierzchnia parowania
- Łatwe do rozlania, ale i zakażenia przy manipulacjach.

Znaczenie pożywki
> Źródło energii
> Źródło substancji budulcowych
> Utrzymuje odpowiednie pH i osmolarność hodowli
> Pożywka pokrywa komórki na tyle cienką warstwą, by możliwa była penetracja gazów. Dlatego też naczyń hodowlanych nie napełnia się nigdy w całości!
> Zbalansowany roztwór soli: fosforanowy z jonami Mg2+ i Ca2+;
> Jony i mikroelementy – utrzymujące odpowiednie osmoticum
> Źródła energii to glukoza i glutamina;
(Glukoza jest głównym węglowodanem dostarczającym energii. Może być czasem zastępowana fruktozą.)
> Aminokwasy (prekursory do biosyntezy białek: 9 egzogennych His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe, Thr, Trp, Val, a do tego endogenne Cys, Gln i Tyr).

> Wskaźnik pH – czerwień fenolowa. Wyjściowe pH wynosi 7.2-7.6, po umieszczeniu w inkubatorze pH staje się lekko kwaśne (kolor pomarańczowy, żółtawy). Kolor granatowy oznacza pH zasadowe, które jest zabójcze dla komórek.

> Dwuwęglan sodu (sodium dicarbonate):
Tworzy ukł. Buforowy, który działa podobnie do systemu buforowego krwi in vivo:
CO2 + H2O <=> HCO3- + H+

Zawartość około 24 mM NaHCO3, współdziała z 5% CO2 w utrzymaniu właściwego pH pożywek.

> Antybiotyki: penicylina, streptomycyna (Pen/Strep). Mało szkodliwe dla komórek.
> Pirogronian sodu – produkt rozkładu glukozy w cyklu Krebsa; pomaga wygenerować więcej ATP (energii).

Przykłady najczęściej stososwanych pożywek:
- Minimum Essential Media (MEM),
- Dulbeco's Modified Eagle Media (DMEM)
- RPMI-1630 (do hodowli komórek rosnących w zawiesinie)
- RPMI-1640 (dla większości komórek ssaków)

> Surowica: najprostszy naturalny i najczęściej stososwany suplement pożywki. Sama pożywka ich nie zawiera.
Medium niezdefiniowane – zawiera surowicę (skład może się różnić w zależności od dnia (?))
Medium zdefiniowane – nie zawiera surowicy (jego skład jest dokładnie znany)

Jakie rodzaje surowicy stosujemy?
- Płodowa surowica bydlęca (fetal bovine serum, FBS lub fetal calf serum, FCS)
- Surowica końska – horse serum, HS.
- Surowica cielęca ang. Bovine calf serum lub newborn calf serum (NCS, CS, BCS)

Stosuje się dodatek 0.-20%
Rola i skład surowicy:
Czynniki wzrostowe
Hormony
Transferryna (Fe)
Lipidy
Insulina
Czynniki hamujące działanie enzymów proteolitycznych
Minimalizuje tarcie i "shear stress"
Czynniki adhezyjne ułatwiające przyczepianie komórek


Ograniczenia w używaniu surowic:
- Źródło zakażeń mykoplazmami i wirusami (dlatego nie wolno pod żadnym pozorem korzystać z surowic z nieznanego źródła!)
- Może zawierać toksyny
- Serie surowic nigdy nie są identyczne
- Występują w niej swoiste przeciwciała

Inaktywacja surowicy:
- 30 min w temp. 56 st.C (zniszczenie dopełniacza, ale i wielu czynników wzrostowych, witamin, aminokwasów)
- Stężenie składników dopełniacza w surowicy płodowej stanowi 1-3% stężenia osobnika dorosłego
- Nawet ogrzanie do 37 st. C jest w stanie zniszczyć dopełniacz
- Inaktywacja wskazana jest tylko w przypadku hodowli komórek układu immunologicznego, komórek mięśni gładkich i komórek macierzystych.

Media kondycjonowane
- Tzw. Condidtioning medium, czyli takie, w którym wcześniej hodowano jakiegoś rodzaju komórki.

Wybielacz
- Używany do niszczenia pozostałych w naczyniach i próbówkach po zakończeniu hodowli komórek
- Po 5 minutach w wybielaczu można wylać pozostałości do zlewu i wyrzucić naczynia.

Rząd wielkości:
Pojedyncza komórka >0,01 mm. Kolonia komórek około 1 mm. Naczynie z koloniami komórek – 100 mm.

Wygląd komórek: mikroskop świetlny (kontrast faz – żywe, lub wybarwione, np. Immunofluorescencyjnie).
Monitoring polega na obserwacji tempa proliferacji i formowaniu kolonii.

Morfologia komórek w hodowli in vitro:
- Zwiesina – pojedyncze komórki lub agregaty swobodnie pływające w pożywce
- Monolayer – warstwa komórek przyczepionych do dna naczynia
- Zachwoanie komórek w hodowli zależy od ich pochodzenia
- Kształt komórek przyczepionych do podłoża także ma związek z pochodzeniem i można je klasyfikować jako endotelialne, epitelialne, neuronalne lub fibroblastyczne.

Komórki dzielimy na zależne i niezależne od przyczepienia.
- Komórki z prawidłowych tkanek (nie-nowotworowych) określa się terminem zależnych od przyczepienia.
Wyjątek stanowią komórki krwi.
- Komórki rosnące w zawiesinie są niezależne od przyczepienia. Zwykle są to komórki nowotworowe.

Komórki prawidłowe...
- Wykazują zahamowanie kontaktowe wzrostu. Kiedy zapełnią cała dostępną powierzchnię, przestaną się dzielić.
- Rosną tylko wtedy, gdy pomiędzy nimi jest miejsce.

Komórki transformowane nie wykazująkontaktowego zahamowania wzrostu – rosną i wtedy, kiedy zapełnią całą powierzchnię.
Mogą rosnąć warstwowo.

Konfluencja – gęstosć komórek w hodowli in vitro (ang. Confluency)
- Aby komórki w hodowli miały prawidłowy cykl komórkowy i namnażały się, muszą być pasażowane (sub-cultured)
- Jeśli komórki pokrywają całądostępną powierzchnię, tempo wzrostu spada, komórki starzeją się i umierają
- Pasażowanie zapobiega również przetrwaniu w hodowli komórek, które uległy selekcji cech i mutacjom (tworzeniu subklonów)
- Zbyt mała ilość komórek w hodowli jest równie niekorzystna jak zbyt duża.

Klasyfikacja hodowli in vitro ze wzg. Na rodzaj hodowanego materiału:
- Hodowle narządów – utrzymywanie sferycznego lub trójwymiarowego kształtu. Utrzymanie specyficznych rekacji histologicznych.
- Hodowle eksplantów: fragmenty tkanek, po przyczepieniu następuje migracja komórek na powierzchnię naczynia
- Hodowle komórkowe – hodowla rozdzielonych komórek. Przyczepione komórki tworzą monolayer. W pożywce zawiesina komórek.

Inna klasyfikacja – pochodzenie komórek i czas trwania:
- Hodowle pierwotne (pierwszorzędowe)
- Linie komórkowe (pierwotne, ustalone lub transformowane – unieśmiertelnione)

Hodowle pierwotne – pochodzą bezpośednio z tkanki lub narządu i mogąbyć hodowane jako komórki migrujące w hodowli z eksplantów lub komórki wyizolowane przez dyspersję i wprowadzone do hodowli jako inoculum (zawiesina).

Zalety:
- Zachowują wiele cech komórek zróżnicowanych, podobnie in vivo, ale mogą zmieniać się w warunkach in vitro.

Wady hodowli pierwotnej:
- Często wymaga usmiercenia zwierzęcia
- Procedura zakładania jest czasochłonna i żmudna
- Może być utrzymywana tylko przez określony, zwykle krótki czas
- Musi być zakłądana dla każdego eksperymentu
- Stanowi heterogenną populację komórek
- Z tego powodu, stopniowo dochodzi do przerostu wszędobylskimi fibroblastami

Narząd – pocięcie tkanki lub narządu – hodowla w medium

Eksplanty w hodowli pierwotnej
- Fragment tkanki zanurzony w odpowiednio napowietrzanej pożywce
- Utrzymana jest struktura 3D oraz interakcje międzykomórkowe
- Ograniczenie stanowi rozmiar pozwalający na dyfuzję gazów i składników odżywczych
- Ograniczona ilość eksperymentów
- Powolny i ograniczony rozrost tkanek
- Hodowla może być wykorzystana do prowadzenia hodowli komórek

Poprzez wysianie pojedynczych komórek:
Narząd/tkanka – rozdrobnienie mechaniczne i izolacja enzymatyczna komórek – odwirowanie i zawieszenie w pożywce – wysianie inoculum – adhezja komórek – identyfikacja.

Metody izolacji.

Izolacja polega na oddzieleniu komórek od macierzy międzykomórkowej, ew. Od innych komórek i uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek, które wprowadza się do hodowli (czyli uzyskaniu inoculum).

Mogą być:
- Mechaniczna (skrobanie, przecieranie przez sitka)
- Enzymatyczna (trawienie enz. Proteolitycznymi tj. Kolagenaza lub trypsyna – najczęściej chyba wykorzystywana)
- Wirowanie w gradiencie (np. surowicy, perkolu, fikolu)
- Sortery (cytofluorymetr przepływowy i inne)

Metody można łączyć.
Rozdrabnia się tkankę, np. Naczynie, mechanicznie, trawi kolagenazą, płuka z kolagenazy (czas jest dłuższy niż np. Na ćwiczeniach), trawi trypsyną, inaktywuje trypsynę, wiruje komórki, a potem zawiesza w pożywce i wysiewa.

W gradiencie gęstości:
- Frakcje wędrują w zależności od rozmiaru i kształtu, gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%).
- W zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu (20-70%).

Liczenie komórek
- Wiadomo, komora Thoma, Burkera i inne takie.

Określenie żywotności komórek:
Stosowanymi barwnikami są np.:
- Błękit trypanu – komórki martwe mają niebieskie jądra
- Bromek etydyny – komórki martwe mają jądra czerwone
- Jodek propydyny – komórki martwe mają jądra czerwone
- Dwuoctan fluoresceiny – komórki żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Zawieisna:
- Komórki rosną pływając w pożywce
- Mogą proliferować w zawiesinie niezależnie od przyczepienia.

Monolayer (metoda 1 warstwy)
- Komórki przyczepione do podłoża migrują/proliferują

Adhezja komórek
- Odbywa się dzięki obecnym na ich powierzchni receptorom dla cząsteczek matrix pozakomórkowego
- Rozpłaszczanie komórek zaczyna się w momencie, kiedy wydzielą one specjalne białka i peptydoglikany tworzące matrix, np. Fibronektynę, lamininę, kolagen.
- Substancje te wiążą się z podłożem, a dopiero do nich wiążą komórki.

W wiązaniu komórek z podłozem biorą też udział białka pochodzące z surowicy dodawanej do medium (wiążą się one zarówno z komórkami, jak i podłożem.
W procesie przyczepiania się komórek do podłoża biorą też udział jony wpania i magnezu.
Komórki wyizolowane się identyfikuje, biorąc pod uwagę kariotyp, antygeny powierzchniowe (immunohistochemicznie), elementy cytoszkieletu (immunohistochemia, immunofluorescencja) i markery (PCR, western).

Cykl komórkowy dzieli się na poszczególne fazy:
G1 – synteza RNA, białek, wzrost komórki
S – replikacja DNA
G2 – przygotowanie do podziału
M – podział

Ew. G0 – "wyjście" z cyklu komórkowego.

Zachowanie komórek w hodowli:
1. Faza lag – rozpoczyna się po pasażu i wysianiu. Okres adaptacji.
W przypadku hodowli rosnących w zawiesinie tej fazy nie ma.
Wówczas komórki:
- odbudowują elementy glikokaliksu zniszczone przez trypsynę
- Przyczepiają się do podłoża i rozpłaszczają
- Nie dzielą się, ich liczba może się nawet zmniejszać (część zniszczonych nie przyczepia się)
- Wzrasta ilość enzymów, głównie polimeraz DNA
- Komórki wchodzą w fazę G1.

2. Faza log – faza logarytmicznego wzrostu
- Jest to okres największego wzrostu liczby komórek. Komórki dzielą się intensywnie (w czasie mitozy odrywają się od podłoza, a po podziale ponownie się przyczepiają).
- Faza ta kończy się jednym lub dwoma podwojeniami populacji komorek i osiągnięciem konfluencji.
- Komórki w tej fazie są bardzo żywotne i mają b. Szybki metabolizm.
- Długość fazy log zależy od gęstości wyjściowej hodowli.
- Komórki przeprowadzają poszczególne fazy cyklu komórkowego.

3. Faza plateau – stacjonarna.

> Komórki osiągają konfluencję i przestają się dzielić -cała dostępna powierzchnia zajęta
> W przypadku komórek prawidłowych, w tych warunkach dochodzi do zahamowania migracji i kontaktowego zahamowania wzrostu
> Początkowo ilość komórek już się nie zmienia, potem część zacyzna umierać, sporadycznie obserwuje się jeszcze pojedyncze podziały.

Hodowla konfluentna – komórki zajmują całą dostępną powierzchnię naczynia hodowlanego.
- Najszybciej wykorzystuje medium
- Komórki trzeba jak najszybciej pasażować, bo dłuższe przetrzymanie komórek w stanie konfluencji może doprowadzić do transformacji, albo do wejścia w fazę G0. Takich już nie da się pasażować, a hodowla w G0 obumiera.

Najlepiej pasażować komórki przy tzw. Semikonfluencji, kiedy ciągle są w fazie log wzrostu (najlepsza kondycja komórek).

Ocena konfluencji:
- Wygląd powierzchni naczynia pokrytej przez rosnące komórki oceniana "na oko".
- Optymalna konfluencja dla przenoszenia (pasażu) komórek do nowego naczynia to 70-80%.
- Zbyt mała – komórki długo w fazie lag i nie będą proliferować
- Zbyt wysoka – mogą się odróżnicować, wejść w fazę G i nie będzie można ich odkleić od podłoża.

Hodowla pierwotna – uzyskana z pojedynczch komórek, ew. Z eksplantów tkanek lub narządów pobranych bezpośrednio z organizmu.
Linia komórkowa – populacja komórek, która powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu
Pasażowanie – przeniesienie komórek z jednego naczynia hodowlanego do innego.
* Numer pasażu mówi, ile razy komórki były pasażowane, a więc odnosi się do wieku komórek!

Podwojenie polujacji lub czas podwojenia populacji to czas, w którym podwaja się liczba komórek w logfazie.

Ilość podwojeń populacji w obrębie jednego pasażu wyraża się wzorem:

= log10 (N/N0)*3.33, gdzie N to ilość komórek uzyskanych po pasażu, a N0 wyjściowa.

Linie komórkowe w nazwach mają zakodowane następujące informacje:
- Pochodzenie, np. NHB – Normal Human Brain
- Numer linii, jeśli wyprowadzono kilka, np. NHB-2.
- Numer pasażu lub l. Podwojeń populacji i informacje, w jakim stosunku rozdzielano komórki: 1:2 czy 1:4, NHB 2/2 lub NHB 2/4.

Wyprowadzanie linii komórkowej:
A. Izolacja enzymatyczna komórek -> przyczepienie i rozpłaszczenie komórek (ok. Kilku godzin)
B. Izolacja eksplantów z tkanki lub narządu -> adhezja tkanki do podłoża i migracje komórek (1 tyg.)
-> hodowla pierwotna -> proliferacja -> pierwszy pasaż: Początek linii komórkowej -> Identyfikacja komórek.

Komórki przechować możemy w postaci zamrożonej, ale w tym celu trzeba je poddać działaniu krioprotektanta, oraz specjalnych plastikowych probówek, na tyle odpornych, że po prostu nie pękną.

Przykładowe medium: 10% DMSO (Dimetylosulfotlenku) + 90% płodowej surowicy cielęcej.
10% DMSO + 90% medium z odpowiednim stężeniem surowicy, jak w medium do hodowli, lub
10% glicerolu + 90% surowicy.

Linie komórkowe w ciekłym azocie przechowywać można nawet do kilkudziesięciu lat.

Zamrażanie musi odbywać się wolno, obniżając temperaturę o około 1 st. Celsjusza na minutę.
Używa się do tego specjalnych pudełek, ale można po prostu wziąć kostkę styropianu.
Komórki w krioprotektancie wkładamy do lodówki:
W 4 st. C – 45 minut
Potem w -20 st. Celsjusza – 2 godziny
W -70 st. C – 24 godziny
Na końcu do ciekłeo azotu (-196 st. C)

Jak wygląda procedura?
- Odklejenie komórek od podłoża
- Odwirowanie i usunięcie supernatantuu
- Zawieszenie komórek w medium do mrożenia (bankowania)
- Umieszczenie w pudełku z izopropanolem w -70 st. C na 24 godziny,
- Przeniesienie komórek do ciekłego azotu (-196)

Rozmrażanie nastąpić musi szybko, najlepiej na łaźni wodnej w temp. 37 st. C i szybko przenieść komórki do czystej pożywki. W temperaturze pokojowej bowiem DMSO jest toksyczny dla komórek.
Efektywność mrożenia (bankowania) komórek to liczba (%) komórek żywych, które przyczepiają się do podłoża po rozmrożeniu.

Linie zamrożone przewozi się na suchym lodzie.
(Zwykle w takich warunkach pozostają zamrożone przez trzy dni. Jeżeli trwa to dłużej, to mogą się rozmrozić i ulec zniszczeniu.)
Można transportować też linie rosnące, czyli w butelkach napełnionych po brzeg pożywką.

Amerykańska kolekcja hodowli komórkowych dysponuje ponad 5000 linii komórkowych ludzkich i zwierzęcych. Są to linie komórkowe wyprowadzone zarówno z prawidłowych tkanek ludzkich, jak i z nowotworów. Dysponują też liniami opornymi na farmaceutyki, posiadają linie stanowiące modele dla badania wielu chorób tj. Cukrzyca, Alzheimer, schizofrenia czy nowotwory piersi.
Wszystkie linie komórkowe przed włączeniem ich do kolekcji przechodzą długie procedury identyfikacji i kontrolę jakościową, np. Testy na obecność mykoplazmy, bakterii, wirusów, drożdży i grzybów.
Wszystkie rodzaje linii komórkowych sprzedaje się wraz z kompletnym opisem i dokładnymi praktycznymi procedurami dotyczącymi hodowli.

Można uzyskać linie komórkowe od innych laboratoriów, ale mogą być zakażone albo źle zidentyfikowane. (Woah, poważka?)

Nowe linie mogąbyć wyprowadzane z tkanek nowotworowych pobieranych bezepośrednio od pacjentów albo przez podawanie w postaci injekcji komórek nowotworowych zwierzętom doświadczalnym.
HeLa to linia komórkowa wyprowazona z nowotworu nabłonka szyjki macicy Henrietty Lacks, w 1952.
CHO-K1: 1957 (Chinese Hamster Ovary) – wykorzystywana do uzyskiwania rekombinowanego DNA.
BHK-21: 1961 – wyprowadzona z nerki chomika, używana m. in. do produkcji szczepionek.

Hodowle pierwotne czy linie?
Pierwotne:
- Bliższe stadium in vivo
- Bardziej zależne od czynników wzrostowych i macierzy pozakomórkowej
- Lepsze do badania interakcji komórkowej

Linie komórkowe
- Łatwa dostępność, duża ilość materiału
- Lepiej zdefiniowane i scharakteryzowane
- Szybka proliferacja
- Mniejsza różnica między eksperymentami, większa powtarzalność
- Nie ma potrzeby zabijania zwierząt

Cloning – metoda służąca do wyselekcjonowania klonu komórek o konkretnych własnościach (danego typu) ponieważ do dominacji w hodowli mają tendencje komórki niewyspecjalizowane, tj. Fibroblasty.
(To NIE jest klonowanie.)
Zazwyczaj w hodowli pierwotnej mamy komórki wyspecjalizowane i niewyspecjalizowane, zazwyczaj lubiące się dzielić fibroblasty, które chętnie i szybko przerastają hodowlę.
Metoda polega na izolacji pożądanej komórki z hodowli i namnożeniu jej osobno.

Plating efficiency, czyli wydajność wysiewania komórek.
Plating – in. wysiewanie zawiesiny komórkowej.
Przez wydajność rozumiemy liczbę komórek formujących wokół siebie kolonie.
Komórki transformowane rosną szybko i mają wysoką efektywność wysiewu, nawet w zawiesinie. Prawidłowe rosną wolno i efektywność nie jest duża.

Cloning jest prosty w przypadku linii komórkowych ciągłych. Jest trudny w przypadku hodowli pierwotnej (niski life span).
Wykonuje się go w szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych i w butelkach.
Dość łatwo można rozróżnić między sobą kolonie – pod mikroskopem.

Cloning komórek rosnących w zawiesinie wykonuje się, umieszczając komórki w agarze albo innym materiale (methocel).
Materiał oddziela komórki tworzące kolonie.
Metoda cloningu jest rutynową metodą, którą rozdziela się komórki po transformacji/transfekcji.
Komórki przyczepione w dołkach odkleja się trypsyną. Oglądamy taką płytkę w mikroskopie, znajdujemy "oczka", a potem je trypsynujemy.

Metoda cloning rings:
W szalce Petriego można fizycznie izolować poszczególne kolonie za pomocą obrączek, cylindrów (szklanych, ceramicznych plastikowych lub metalowych).

Czynniki wykorzystywane w cloningu:
- Media selektywne, np. Ham's F12.
- Media kondycjonowane – pożywki, w których rosły inne komórki. Te pożywki zawierają składniki wyprodukowane przez tamte komórki.

- Hormony: insulina 1x10^-10 IU/ml, deksametazon 1x10^-5
- Substraty matriks pozakomórkowego (do pokrywania naczyń):
polilizyna 1 mg/mL
fibronektyna 5 mikrog/mL

Cloning komórek rosnących w zawiesinie.
- Metoda stosowana do otrzymywania klonów komórek hematopoetycznych.
- Kolonie utrzymywane otoczone przez sztywny materiał (agar, methocel)
- Kolonie formują się pomiędzy agarem i methocelem.

Unieśmiertelnianie linii komórkowej.
Normalne komórki zachowują się według krzywej wzrostowej. Unieśmiertelnione tracą potencjał wzrostowy, następuje kryzys (około 30 dnia apogeum – nagły spadek liczby powstających komórek), a potem ponowny wzrost unieśmiertelnionych komórek.

Transformowane linie komórkowe
- Pochodzą z tkanek nowotworów lub
- Powstają przez spontaniczne transformacje (mutacje) lub
- Powstają przez indukcję transformacji chemicznie lub za pomocą wirusów.

Transformacja komórek w hodowli in vitro
- Unieśmiertelnienie
- Utrata zahamowania kontaktowego wzrostu
- Uzyskanie zdolności do wzrostu niezależnie od przyczepienia

Transfekcja – transformacja + infekcja.
- Wprowadzenie kwasu nukleinowego za pomocą wirusa.
Po raz pierwszy dokonał tego Frederick Griffith (Streptococcus pneumoniae)
1944 r. - Avery, Macleod i McCarty odkryli, że DNA jest czynnikiem transformującym
1964 r. - Foldes i Trautner po raz pierwszy użyli tego terminu – transfekcja
1965 - Vaheri i Pagano opisali metodę transfekcji za pomocą DEAE-Dekstranu, a więc nie za pomocą wirusa.

Transformacja – aktywne wprowadzenie obcego materiału genetycznego do komórki (termin używany w przypadku procaryota)
Transfekcja – proces dostarczenia materiału genetycznego do komórek eukariotycznych metodami nie-wirusowymi.

Transfekcja jest procesem wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki.
- Wprowadzanie do komórek transgenu (genu reporterowego lub terapeutycznego) oraz syntetycznych oligonukleotydów.

Transfekcja:
- Stabilna – charakteryzuje się integracją DNA do genomu.
- Przejściowa – cząsteczka DNA nie ulega integracji, ekspresja wprowadzonego genu zostaje zgubiona w miarę kolejnych podziałów komórkowych.

Transfekcja przejściowa:
- Wysoki poziom ekspresji wprowadzonego materiału w komórkach
- Różny procent komórek wykazujący ekspresję transgenu
- Wymaga dużej ilości DNA
- DNA nie jest dziedziczone przez komórki potomne
- Szybka i łatwa do wykonania

Transfekcja stabilna:
- Transgen na stałe zintegrowany z genomem
- Słabsza ekspresja w porównaniu z przejściową
- Nie wszystkie komórki mogą wykazywać ekspresję
- Koekspresja jest trudniejsza
- Wymaga selekcji klonów
- Może wymagać czasu (nawet do jednego miesiąca)

Metody transfekcji:
- Fizyczne (mikroinjekcja, elektroporacja, metoda biolistyczna, czyli tzw. Strzelba genowa)
- Chemiczne (DEAE-dekstran, fosforan wapnia i jony Ca2+, syntetyczne polimery będące nośnikami DNA, liposomy)
- Wirusowe (adenowirusowe, retrowirusy, lentiwirusy i inne)

Elektroporacja – transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku elektrycznego (wysokie napięcie) w roztworze zawierającym kwas nukleinowy
Szok elektryczny powoduje przejściowe utworzenie się w błonie mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.
- Wykorzystuje się wysokie napięcie do transfekcji
- W wyniku napięcia formują się pory
- Odpowiednia amplituda i czas trwania są istotne, by nie rozerwać błony
- Mniej zależna od linearnej korelacji między ilością DNA obecnego w komórce a użytego do transfekcji
- Wykorzystywana jest do stabilnej transfekcji

Elektroporacja:
- Zawieszenie komórek w buforze
- Dodanie DNA do zawiesiny
- Elektroporacja
- Selekcja transfekowanych komórek

Mikroiniekcja – roztwór tzw. Nagiego DNA jest wstrzykiwany prosto do jądra komórkowego lub – w przypadku RNA – do cytoplazmy za pomocą spreparowanej odpowiednio szklanej kapilary.

Strzelba genowa – wprowadzany DNA opłaszcza się na mikropocisku, który nastepnie wstrzeliwuje się do wybranego materiału genetycznego
- Strzelba genowa nadaje cząsteczkom prędkość dzięki np. Fali uderzeniowej helu z butli ze sprzężonym gazem
- Można wprowadzić dowolny obcy DNA do komórek
- Nie wymaga stosowania toksycznych odczynników (pociski zbudowane są ze złota lub wolframu)

Metody chemiczne
- Użycie fosforanu wapnia
- Dietylaminoetyl (DEAE)-dekstran
- Syntetyczne polimery kationowe
- Lipofekcja – transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA

Ko-precypitacja fosforanem wapnia jest tania i skuteczna, wykorzystywana do obu typów transfekcji
- Polega na zmieszaniu DNA z chlorkiem wapnia oraz kontrolowanym podawaniu do zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej celem wytworzenia precypitatu
- Precypitat jest pobierany przez komórki na drodze endocytozy lub fagocytozy.

Transfekcja wykorzystywana jest:
- W badaniach biochemicznych
- W badaniach ekspresji genów kontrolujących procesy komórkowe
- W produkcji specyficznych białek
- W terapii genowej
- Uzyskiwanie organizmów transgenicznych

Metoda dekstranowa.
DEAE-dekstran jest kationowym polimerem wiążącym się z DNA. Ułatwia wiązanie z błoną komórki i endocytozę.
Nadmiar ładunków dodatnich umożliwia związanie się polimeru z ujemnie naładowaną błoną komórkową i endocytozę kompleksu
Metoda jest skuteczna do dostarczania kwasów nukleinowych do krótkotrwałej trasnfekcji, nie może jednak być używana do stabilnej.

Syntetyczne nośniki DNA
- Grupę nie-wirusowych nośników tworzą różne związki chemiczne i struktury ponadmolekularne (supramolekularne) obdarzone ładunkiem dodatnim:
Lipopleksy – lipidy i liposomy kationowe
Polipleksy – kationowe polipeptydy i białka, polimery i kopolimery kationowe, dendrymery

Liposomy to sferyczne dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidu obdarzonego ładunkiem + i cząsteczek lipidu obojętnego elektrostatycznie.

Liposomy kationowe
- Oddziaływania jonowe pomiędzy liposomami i DNA umożliwiają formowanie kompleksów
- Ułatwiają fuzję z błoną komórkową
- Ułątwiają uwalnianie DNA z endosomu

Polimery i kopolimery kationowe:
Naturalne (chitozan)
Syntetyczne (rozgałęziona PEI, poli-beta-aminoestry).

Dendrymery to makrocząsteczkowe polimery o dobrze zdefiniowanej architekturze i wyróżniające się jednorodnością w rozkładzie łądunków. Przykładem są polimery poliamidoaminowe (PAMAM). Mają mnóstwo rozgałęzionych grup funkcyjnych.

Transfekcja za pośrednictwem polikationów jest podobna. Dodatnie ładunki neutralizują elektrostatyczne oddziaływania z błoną, następuje endocytoza, uwalnianie z endosomu DNA i przeniesienie go do jądra.

Techniki niewirusowe mają wiele zalet:
- Brak ograniczeń wielkości transgenu
- Brak integracji nośników z genomem
- Małe ryzyko rekombinacji
- Możliwość transfekcji wielu typów komórek
- Nie powodują odczynu zapalnego, więc można je stosować in vivo.

Bariera wewnątrzkomórkowa.
- Lipopleksy i polipleksy łączą sięz daną komórką za sprawą oddziaływań z ujemnie naładowanymi proteoglikanami na powierzchni komórek lub receptorów dla ligandów obecnych na powierzchni nośników. Oba mechanizmy prowadzą do pobrania tych związków przez komórkę na drodze endocytozy.

Wydajność uwalniania kompleksów nośnik-DNA z endosomów do cytoplazmy jest uzależniona od obecności w nośniku składnika zdolnego do destabilizacji błony endosomu.
Wykorzystywane czynniki fuzyjne:
- W liposomach – fosfatydylo-etanolo-amina (DOPE)
- Podjednostki pewnych toksyn bakterii, np. Diphteria czy Pseudomonas)
- Elementy strukturalne niektórych wirusów, np. Białka kapsydu adenowirusa labo fragment hemaglutyniny wirusa grypy.

Warunki udanego transferu genów do komórek:
- Dotarcie DNA do powierzchni komórki
- Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej
- Przejście kompleksu przez błonę
- Wejście DNA do jądra komórkowego
- Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym

Sposoby wnikania transgenu do jądra komórki:
- Pasywne – plazmidowy DNA może biernie wnikać do jądra podczas podziau komórki (łatwość transfekowania komórek intensywnie się dzielących)
- Aktywne – plazmidowy DNA związany z białkiem lub inną cząsteczką zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) rozpoznawany przez receptory jądrowe z rodziny importyn.

Czynniki obniżające efektywność transfekcji:
- Obecność antybiotyków – mogą zostać przeniesione do wnętrza komórki przez czynniki transfekcyjne, zaś same kompleksy przenoszące mogą z nimi oddziaływać.
- Obecność surowicy, ale też jej brak – np. Brak surowicy może sprawić, że liposomy są bardziej toksyczne dla komórek.

W pożywkach bez surowicy...
- Nie ma niekorzystnych efektów jej działania
- Powstaje możliwość stosowania pożywek selektywnych (korzystne do selekcji hodowli pierwotnych, np. Oddzielenia komórek epitelium lub keratynocytów od fibroblastów)
- Regulują proliferację i różnicowanie (można łatwo modulować ilość i jakość czynników wzrostowych)

Wady transfekcji komórek w pożywkach bez surowicy
- Różnorodność pożywek – dla każdej linii jest inne medium
- Selektywność – mogą zostać wyselekcjonowane podszczepy w obrębie linii
- Ściśle określony skład pożywki – usunięcie surowicy pozbawia hodowlę czynników protekcyjnych
- Proliferacja komórek jest zwykle wolniejsza

Zmiany procedury pasażowania komórek hodowlanych w pożywkach bez surowicy.
- Może zaistnieć potrzeba dodania do naczynia hodowlanego czynników zwiększających adhezję (poli-lizyna, fibronektyna)
- Do przerwania działania trypsyny trzeba używać jej inhibitorów (nie ma surowicy)
- Trypsyna musi być słabsza (bardziej rozcieńczona)
- Komórki mogą być bardziej wrażliwe na działanie trypsyny.

Czynniki konieczne do hodowli komórek bez surowicy
- Hormony
- Czynniki wzrostowe i odżywcze
- Białka
- Elementy macierzy pozakomórkowej
- Lipidy

Sprawdzanie wydajności
- Geny reporterowe, nie są naturalnie obecne.
Najczęściej używane: CAT (acetylotransferaza chloramfenikolu), lucyferaza, beta-galaktozydaza, zielone białko fluorescencyjne (GFP).

Geny selekcjne. (Np. transfekcja genami oporności na antybiotyki)
- Transfekcja plazmidem zawierającym gen odporności na neomycynę (najstarsza metoda)
- Hodowla komórek w pożywce zawierającej neomycynę
- Komórki nietrasnfekowane nie rozkładają neomycyny i giną
- Przeżywają tylko te stabilnie transfekowane, posiadające gen selekcyjny.

Zalety transfekcji:
- Umożliwiają transfer do komórek ujemnie naładowanych cząsteczek mimo ujemnych ładunków błony komórkowej
- Liposomy posredniczą w transporcie DNA z wysoką wydajnością, a dzięki stabilności transfekcji umożliwiają prowadzenie długich doświadczeń.

Wady:
- Chemiczne substancje szkodzą komórkom na dłuższą metę
- Wydajność transfekcji zależy w dużej mierze od kondycji komórki, ilości i jakości DNA, konfluencji (opt. 40-80%)
- Bezpośrednia mikroiniekcja i strzelba genowa są trudne do stosowania i kosztowne.