15.11.2011

Ćwiczenie 4

Bilirubina

Funkcje wątroby:

1. Metaboliczne

1. Metabolizm węglowodanów

• izomeryzacja różnych cukrów prostych (fruktoza, galaktoza, mannoza) w glukozę

• przemiany węglowodanów w procesie glikolizy, cyklu pentozowego, glikogenezy i glikogenolizy

• glukoneogeneza - prowadzi do syntezy glukozy z materiału niewęglanowego (mleczan, pirogronian, glicerol, większość AA)

Metabolizm białek i aminokwasów

• synteza i rozkład białek

• synteza białek z aminokwasów pochodzących z jelita cienkiego, z rozpadu białek własnych i syntezy endogennej

• białka syntetyzowane w wątrobie to:

1. białka osocza - albuminy i globuliny (z wyjątkiem immunoglobulin)

2. białka transportowe - albuminy, hemopektyna, białka transportujące lipidy - apolipoproteiny, haptoglobina, transferryna, ceruloplazmina, globulina wiążąca tyroskynę, prealbuminy

3. białka - układ krzepnięcia: protrombina, czynniki V, VII, IX, X, plazminogen, antytrombina III, fibrynogen

4. białka - inhibitory enzymów proteolitycznych i białka ostrej fazy (α-1 antytrypsyna, α-2 makroglobina, orozomukoid, białko CRP, fibrynogen, haptoglobina

przemiana azotu z pochodzącego białek i wytwarzanie mocznika

Metabolizm lipidów

• dostarczanie endogennego cholesterolu

• wytwarzanie acetylotransferazy lecytynowo-cholestorolowej (LCAT) - estryfikuje cholesterol głównie w osoczu

• synteza VLDL - TG

• synteza i całkowity rozpad HDL

• katabolizm LDL

• Wytwarzanie kwasów żółciowych

• synteza w komórkach wątrobowych z cholesterolu (kwas cholowy, chenodezoksycholowy)

• w żółci kwas dezoksycholowy i litocholowy są produktami bakteryjnej przemiany w jelicie endogennych kwasów żółciowych

• w żółci występują w formie połączeń z glicyną lub tauryną jako sole żółciowe.

• Metabolizm bilirubiny

• Metabolizm hormonów - redukcja grup ketonowych w cząsteczce progesteronu powodująca inaktywację, przemienia go w związek

2. Detoksykacja

Przemiany biochemiczne, katabolizowane przez układy enzymatyczne prowadzące do detoksykacji, głównie w siateczce śródplazmatycznej komórek wątrobowych, która tworzy tzw. frakcję mikrosomalną. Inaktywacja lub spadek aktywności biologicznej i toksyczności związków.

Dwie fazy:

1. faza - utlenianie lub redukcja i hydroliza związków. Utlenianie katabolizowane przez układ enzymatyczny hepatocytów - głównie cytochrom P-450 oraz reduktazę cytochromu C współdziałającą z NADPH+H⁺

2. faza - sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarkowym, octowym, glutationem lub metioniną bądź metylacja. Powstałe produkty reakcji są na ogół dobrze rozpuszczalne w wodzie, tracą zdolność rozpuszczania w lipidach i nie wchłaniają się w kanalikach nerkowych - wydalane z moczem lub żółcią.

• amoniak

• detoksykacja poprzez przekształcenie do nietoksycznego mocznika w cyklu ornitynowym

• wytwarzanie w przebiegu metabolizmu AA i działaniu bakterii jelitowych na białka

• NH₃ wywiera toksyczne działanie na ośrodkowy układ nerwowy

• leki i trucizny

• sulfonamidy, antybiotyki, hormony, barbiturany, fenacetyna, amfetamina, fenobarbital, kodeina i inne działania szkodliwe na pewne mechanizmy fizjologiczne zwłaszcza przy przedawkowaniu

• w przypadku trucizn działających bardzo szkodliwie na czynności życiowe organizmu

• są to w większości związki organiczne aromatyczne lub heterocykliczne, polarne lub małopolarne o charakterze słabych elektrolitów, słabo rozpuszcza się w wodzie, a dobrze w substancjach lipidowych

• modyfikacja leków i trucizn polega na prowadzeniu do wzrostu polarności i rozpuszczalności w wodzie, co umożliwia wydalanie z moczem lub żółcią

• przemiany te polegają na wprowadzeniu do związków grup funkcyjnych o charakterze polarnym - w metabolizmie bierze udział cytochrom P-450

• alkohol etylowy - przekształcanie w wątrobie pod wpływem dehydrogenazy alkoholowej i aldehydowej do kwasu octowej, wykorzystywanego w licznych procesach metabolicznych

• środki barwiące i konserwujące w przemyśle spożywczym, w pokarmach

• zanieczyszczenia środowiska - wody i powietrza, składniki dymów fabrycznych i gazów spalinowych (węglowodory aromatyczne)

3. Funkcje wydzielnicze

• bilirubina

• kwasy żółciowe

• cholesterol

• Funkcje magazynujące - glikogen, lipidy, białka, żelazo, miedź, witaminy.

Przemiana hemoprotein - barwników żółciowych

• hemoglobina - erytrocyty, 4 pierścienie hemu z Fe²⁺

• mioglobina - mięśnie, jeden pierścień hemu

• cytochromy - we wszystkich tkankach, przenoszą elektrony w reakcjach redoks

1. Układ siateczkowo-śródbłonkowy - wychwyt i rozpad starych erytrocytów, uwolnienie hemoglobiny (dobowe niszczenie erytrocytów 1%).

2. Wiązanie hemoglobiny z haptoglobiną osocza.

3. Układ siateczkowo-śródbłonkowy (wątroby, śledziony, szpiku) - wychwyt hemoglobiny z haptoglobiną i degradacja do haptoglobiny, globiny, żelaza i biliwerdyny (zielony barwnik) przechodzącą w:

1. wolną bilirubiną α (niezwiązana, niesprzężona, nierozpuszczalna w wodzie)

2. ok. 7,5 g hemoglobiny rozpada się w ciągu doby i powstaje 250 mg bilirubiny

3. katabolizm pierścienia hemowego mioglobiny i cytochromów jest źródłem ok. 10% wytwarzania dobowego bilirubiny.

4. W 90% transportowana jest w postaci kompleksu z albuminą do wątroby - wolna bilirubinaβ, niesprzężona, pośrednia. Występuje we krwi osób zdrowych. Połączenie jest na tyle trwałe, że zapobiega przechodzeniu przez kłębki nerkowe i pozwala na swobodną dyfuzję przez ścianę naczyń włosowatych wątroby (zatok).

5. W wątrobie ulega sprzęganiu z kwasem glukuronowym, częściowo z glicyną, tauryną, jonem siarczanowym w reakcji katalizowanej przez UDP-glukuronozylotransferazę.

6. Powstaje bilirubina sprzężona, bezpośrednia γ rozpuszczalna w wodzie, którą stanowią dwuglukuroniany (ok. 75%) i monoglukuroniany. Sprzężona postać bilirubiny odznacza się lepszą rozpuszczalnością w wodzie i są łatwiej wydalane z organizmu.

7. We krwi bilirubina związana występuje częściowo w postaci „wolnej” a częściowo związanej z albuminami - tzw. bilirubina delta (δ). T_1/2 bilirubiny delta jest dłuższy niż gamma. Po usunięciu przeszkody w drogach żółciowych frakcja bilirubiny delta pozostaje podniesiona przez dłuższy czas, a sprzężona γ szybko się obniża. Różnicowanie tych postaci jest przydatne w ocenie stopnia cholestazy.

8. Bilirubina sprzężona γ ulega sekrecji do kanalików żółciowych w składzie żółci wchodząc do jelit.

9. W jelitach pod wpływem enzymów bakteryjnych przekształcana jest w sterkobilinogeny i urobilinogeny.

10. Sterkobilinogen (bezbarwny) utleniany do sterkobiliny (barwna), która wydalana jest z kałem. Cholestaza powoduje bezbarwny kał (acholiczny).

11. Część urobilinogenu resorbowana z jelita dostaje się do krążenia wrotnego i wątroby.

12. W wątrobie większość wchłoniętego urobilinogenu zostaje przekształcona w bilirubinę i ponownie wydalona z żółcią (krążenie jelitowo-wątrobowe barwników żółciowych).

13. Urobilinogen w niewielkiej części wydala się z moczem jako urobilina.

Bilirubina (bil)

Oznaczana w surowicy nie jest swoistym wskaźnikiem chorób wątroby, w połączeniu z oznaczeniem aktywności enzymów wątrobowych stanowi zestaw badań 1 rzutu.

• bilirubina całkowita i bilirubina bezpośrednia (związana/sprzężona)

• prawidłowa bilirubina całkowita w surowicy ~17 μmol/l (0,3-1,2 mg/dl)

• prawidłowa bilirubina bezpośrednia - 1,7-6,8 μmol/l (0,1-0,4 mg/dl)

• prawidłowa bilirubina pośrednia - 3,4-12 μmol/l (0,2-0,7 mg/dl)

Bilirubina pośrednia = bilirubina całkowita - bilirubina bezpośrednia

Hiperbilirubinemie

• z przewagą bilirubiny wolnej

• z przewagą bilirubiny związanej

Wzrost bilirubiny związanej (bezpośredniej) świadczy o:

• zaburzenia odpływu żółci z wątroby ( cholestaza wewnątrz lub zewnątrz wątrobowa)

• uszkodzenie hepatocytów (WZW, czynniki i substancje toksyczne, alkohol, leki -lewodopa, metylodopa, adrenalina, fenelzyna)

• zmiany naciekowe i rozrostowe - przerzuty nowotworowe, ropień, amyloidowa

• chorób dziedzicznych (zespół Dubin-Johnsona, Rotora)

Wzrost bilirubiny pośredniej (wolnej)

• choroby hemolityczne - związane ze zwiększonym niszczeniem erytrocytów: hemoglobinopatie, dysfunkcje enzymów krwinkowych, DIC, hemoliza z autoimmunizacji (może towarzyszyć żółtaczka hemolityczna, przedwątrobowa)

• krwiaki

• transfuzja krwi

• choroby genetyczne (choroba Gilberta, zespół Criglera-Najjara)

• stosowanie leków powodujących hemolizą

Stężenie bilirubiny całkowitej > 2 mg/dl (2,5 mg/dl) lub >34 μmol/ (42,75 μmol/l) - żółtaczka

Stężenie bilirubiny całkowitej + żółtaczka = objaw wtórny dla chorób wątroby

Jeżeli występuje wzrost stężenia bilirubiny całkowitej w surowicy - uzupełniamy to badaniem moczu na obecność bilirubiny.

UWAGA! Z moczem wydalana jest jedynie bilirubina sprzężona.

Następstwem zaburzeń przemian bilirubiny są zmiany wydalania urobilinogenu z kałem i moczem.

• Zamknięcie dróg żółciowych = brak UBG w moczu i sterkobilinogenu w kale

• wzmożone wytwarzanie bilirubiny lub uszkodzenia miąższu wątrobowego = UBG wchłonięty ze światła jelita nie może być całkowicie wychwycony przez hepatocyty wątroby i jest w zwiększonych ilościach wydalany z moczem.

	Z przewagą bilirubiny wolnej	Z przewagą bilirubiny sprzężonej	Podobny wzrost obu
Przyczyna	hemoliza zaburzenie wychwytu bilirubiny przez hepatocyty zaburzenie sprzęgania bilirubiny	cholestaza	uszkodzenie hepatocytów
Przykładowe jednostki chorobowe	żółtaczka hemolityczna żółtaczka noworodkowa zespół Gilberta zespół Criglera-Najjara	żółtaczka zaporowa (mechaniczna) zespół Dubin-Johnsona	WZW

Wzrost stężenia bilirubiny bezpośredniej stanowiącej

• 20-40% bilirubiny całkowitej - bardziej charakterystyczne dla żółtaczki wątrobowej niż pozawątrobowej

• 40-60% bilirubiny całkowitej - charakterystyczne dla żółtaczki wątrobowej i pozawątrobowej

• >60% - bardziej żółtaczka pozawątrobowa niż wątrobowa

Stężenie bilirubiny całkowitej > 40 mg/dl (684 μmol/l) przemawia za niedrożnością wewnątrzwątrobową niż pozawątrobową.

Hiperbilirubinemia wrodzona

• zespół Gilberta

• występuje u ok. 5% osób, zachowuje się prawidłową funkcję wątroby

• zaburzenia transportu wolnej bilirubiny z krwi do hepatocytów

• spadek aktywności wewnątrzwątrobowej UDP bilirubiny katalizującej sprzęganie bilirubiny wolnej z kwasem glukuronowym

• w 60% przypadków zwiększona hemoliza

• we krwi wzrost wolnej bilirubiny

• zespół Criglera-Najjara

• zaburzenie dziedziczone autosomalnie recesywnie typ I i dominująco typ II

• typ I (bardzo ciężki) - brak aktywności UDP katalizującej sprzęganie

• wzrost stężenia bilirubiny wolnej w surowicy do wartości 340 μmol/l i więcej (>20 mg/dl)

• typ II (lżejszy) - stężenie bilirubiny wolnej nie przekracza 340 μmol/l (6-20 mg/dl, <20 mg/dl)

hiperbilirubinemie nabyte

• żółtaczka fizjologiczna noworodków

• niedojrzałość komórek wątroby do wychwytywana bilirubiny, układów enzymatycznych wątroby do procesu glukuronizacji bilirubiny pochodzącej z nadmiernego rozpadu erytrocytów zawierających Hb płodową

• żółtaczka mechaniczna

• wątrobowa (zastoinowa, zaporowa)

• pozawątrobowa (cholestaza pooperacyjna, kamica)

• uszkodzenie hepatocytów- upośledzony wychwyt bilirubiny wolnej

• przechodzenie bilirubiny sprzężonej zamiast do żółci do płynu pozakomórkowego i do krwi

• wzrost stężenia bilirubiny sprzężonej

wzrost stężenia bilirubiny bezpośredniej stanowiącej

20-40% bilirubiny całkowitej bardziej charakterystyczny dla żółtaczki wątrobowej niż pozawątrobowej

40-60% bilirubiny całkowitej bardziej charakterystyczny dla żółtaczki wątrobowej i pozawątrobowej

60% i więcej bilirubiny całkowitej bardziej charakterystyczny dla żółtaczki pozawątrobowej niż

wątrobowej

Metody oznaczania bilirubiny

1. Próba van den Bergha

Rozróżnianie dwóch form bilirubiny, reakcja zachodzi w wodzie.

Bilirubina sprzężona, rozpuszczalna w wodzie reaguje z kwasem sulfanilowym, dając czerwono-fioletowe zabarwienie (odczyn dodatni, tzw. bezpośredni - bilirubinę określa się jako bezpośrednią).

Bilirubina wolna, niesprzężona połączona z albuminą daje reakcję po dodaniu akceleratora (np. alkohol, metanol), który niszczy połączenie z albuminą (tzw. odczyn pośredni).

2. Oznaczanie metodą Jendrassika-Grafa

• Wykorzystanie reakcji Van der bergha. Bilirubina reaguje z diazolowym kwasem sulfanilowym, powstają rozpuszczalne w wodzie azobilirubiny (pochodne azowe) dające w środowisku obojętnym różowo-czerwone zabarwienie

• oznacza się bilirubinę całkowitą (bilirubina pośrednia + bezpośrednia)

• dla oznaczenia bilirubiny całkowitej konieczne jest przeprowadzenie bilirubiny

Akceleratorem jest benzoesan sodu, inne: mocznik, DMSO.

3. Metoda Malloya i Erelyna.

Źródła błędów

• badanie nie później niż kilka godzin

• materiał chronić przed światłem słonecznym lub fluorescencyjnym - bilirubina jest fotowrażliwa, światło obniża stężenie bilirubiny o 50% po 1 h - ma większy wpływ na wolną

• surowica hemolizowana - zaniżenie wyników

• stosowanie leków - barbituranów - obniża stężenie bilirubiny całkowitej

Czułość mała - zależy o zdolności rozdzielczej fotokolorymetru.

Precyzja - przy stężenie bilirubiny <17 μmol/l (1 mg/dl, CV=ok. 20%), a powyżej 34 μmol/l (2 mg/dl, CV=ok. 10%).

HCV ma duże zróżnicowanie genetyczne. W Polsce najczęstszy genotyp to 1b, który stwierdzono u >90% zakażonych.

Materiał genetyczny zawiera informację o 3 białkach.

• ↑aktywności ALT w surowicy- wskaźnik uszkodzenia miąższu wątroby

• U chorych u których rozpoznano WZW C można spotkać się z jednym z 3 głównych typów przebiegu podwyższonej aktywności ALT

• Jednofazowy (krótki okres ↑ aktywności ALT, często nieuchwytny)

• Typ plateau

6

---