PATOMORFOLOGIA wykład 10 (4 XII 00)

APOPTOZA

(gr. apoptosis, opadanie liści z drzew)

Cechy morfologiczne komórek apoptotycznych:

• mniejsze o nieregularnym kształcie

• kondensacja chromatyny (hiperchromazja DNA) jądro ciemniejsze w hematoksylinie, jaśniejsze w barwieniu fluorescencyjnym

• brak ziarnistości chromatyny

• fragmentacja jądra komórkowego (karryorhexis)

• uwypuklenia błony komórkowej

• obecność ciałek apoptotycznych

• organella komórki niezmienione

Apoptoza w warunkach fizjologicznych:

• obumieranie komórek w trakcie embriogenezy

• inwolucja

• apoptoza komórek endometrium w cyklu miesiączkowym

• atrezja pęcherzyków Graafa np. po menopauzie

• zanik prostaty po kastracji

• zmiany w sutku po zakończeniu karmienia

• apoptoza komórek nabłonka jelitowego

Apoptoza w warunkach patologicznych:

• apoptoza komórek nowotworowych

• apoptoza neutrofili w zapaleniach ostrych

• apoptoza limfocytów B i T w niedoborach cytokin

• apoptoza cytotoksyczna limfocytów T w odrzucaniu przeszczepów

• apoptoza komórek miąższowych przy niedrożności przewodów wyprowadzających (trzustka, ślinianki, nerki)

• ciałka Councilmana w hepatitis viralis

• w odpowiedzi na uszkodzenie wywołane napromienianiem, CHTH (chemoterapią), niedotlenieniem (niskie stężenie, wysokie wywoła nekrozę)

Choroby związane z apoptozą i ↑ przeżyciem komórki (dłuższym):

• nowotwory złośliwe

• choroby autoimmunologiczne

Choroby związane z apoptozą i ↓ przeżyciem komórki (krótszym):

• choroba degeneracyjna UN

• choroby wywołane niedotlenieniem (infarctus myocardii, najpierw apoptoza, potem nekroza)

• deplecja limfocytów T (AIDS)

Zmiany biochemiczne i molekularne w komórkach apoptotycznych:

- promotory (bax)

----------------------- (zwiększenie stosunku)

inhibitory (bcl-2)

• zmiany w mitochondriach:

• ↓ potencjału mitochondrialnego

• uwolnienie cytochromu C → aktywuje nieodwracalnie enzymy kaspazy

• ↑ Ca²⁺ (uciekają z mitochondriów)

• utrata asymetrii fosfolipidów w błonie komórkowej

• aktywacja kaspaz:

• caspases = cysteine-dependent aspartate specific proteases

• proteoliza „death substrates” np. PARP

• aktywacja endonukleaz odpowiedzialnych za fragmentację DNA

• fragmenty (300-50 kB)

• fragmenty wielkości nukleosomów (180-200 bp)

• aktywacja transglutaminaz

uszkodzenie DNA komórki:

→ aktywacja genu p53

→ produkcja białka p53 (normalnie to białko zatrzymuje komórkę w cyklu = „policjant molekularny = strażnik genomu komórki”)

→ gdy za dużo p53, to komórki zatrzymują się w cyklu, aby móc naprawić DNA, aby go nie powielać → czasem naprawa jest niewykonalna, trzeba zniszczyć złe DNA

→ p53 odpowiada za syntezę białka bax

→ bax wchodzi do mitochondriów

→ tworzą się kanały w błonie mitochondrialnej)

→ ↓ potencjału mitochondrialnego

→ wpływ na istniejące już kanały (dotychczas zamknięte)

→ otwiera się megakanał

→ ucieka Ca²⁺ i cytochrom C i H₂O oraz inne czynniki aktywujące kaspazy

→ proteoliza różnych składników komórki (białek cytoplazmy i jądra) np. polimerazy

bcl-2 (xe) hamuje wejście komórki w apoptozę

Apoptozę mogą wywołać:

• zmiany w DNA, ↑p53

• napromieniowanie, toksyny, wolne rodniki

• otoczenie bez hormonów i czynników wzrostu

• czynniki działające na receptory bezpośrednio w błonie komórkowej

• cytotoksyczne limfocyty T

• wydzielają perforyny, powstają kanały w błonie, tędy granenzym, aktywator kaspaz

Wykrywanie:

• cytometr przepływowy

• badanie natężenia fluorescencji (wzbudzanie laserem)

• szybkość bardzo duża (10 tys. kom/s)

• laserowy cytometr skaningowy

• komórki na szkiełku podstawowym

Barwniki:

• Rh123 (rhodamina)

• akumuluje się w mitochondrium (zależy od potencjału: ↑pot. = ↑Rh)

• intensywne świecenie

• apoptoza: ↓pot. = ↓Rh = ↓świecenie

• JC1

• akumuluje się w mitochondrium (normalnie zielony)

• agregacja - pomarańczowy

• apoptoza: nie agreguje, zielony

• DiOC₆(3)

• apoptoza = mniejsza akumulacja

• komórki „późnoapoptotyczne” akumulują go więcej (pomarańczowy)

Badanie zawartości DNA w komórkach: histogram

W apotozie endonukleazy, świeżo pocięte DNA wypłukiwane, mniej DNA.

Utrata asymetrii fosfolipidów:

• fosfatydyloseryna normalnie tylko w błonie wewnętrznej

• w apoptozie na zewnątrz

• substancje wykazujące powinowactwo do fosfatydyloseryny to np. anepsyna

• anepsyna to fluoresceina: zielone świecenie

Fragmentacja DNA:

• oligonekluazy

• na żelu charakterystyczny obraz drabiny (w martwicy przypadkowa fragmentacja)

• BrdUTP przyłącza się do fragmentów (tam, gdzie pęknięcia)

• + przeciwciała + fluorescencja → widać

Czasami zdarzają się fałszywe komórki apoptotyczne: monocyty fagocytujące ciałka apoptotyczne

---