Wykład 2 - INTERFERENCJA RNA. TERAPIA GENOWA

DNA----> mRNA-----> białko

„Caenthebidils elegans” ---> eksperymenty na nicieniu

jak wprowadzimy jednoniciowy DNA --> kompleks mRNA => tzw. strategia antysensu --> łączą się i już nie ma translacji

Wprowadzenie przypadkowe sekwencji identycznej do mRNA --> a okazało się że jest taki sam efekt (Fira Mello - 1998)

--> to może hamowanie przez dwuniciowy DNA?

gen kodujący UNG - 22 (białko mięśniowe)

wprowadzenie „ antysens” - nie

wprowadzenie „sens” - nie

• dwuniciowe DNA -> skuteczniej hamuje ekspresję

mRNA jest wtedy degradowane

„ interferencja DNA”

Po wprowadzeniu dwuniciowego RNA ---> rozpoznane prez DICER(kompleks białkowy) i tnie na ---> siRNA

siRNAs ---> +RISC => kompleks i odchodzi jedna nić---> kompleks znajduje kompleks elementarny ----> i degradacja mRNA

2 kroki:

dwuniciowe RNA + DICER----kinaza---> RdRPolimeraza(RNAzależna od polimerazy polimeraza;)

Wykorzystanie:

• do prób terapii genowej

- micro RNAs - endogenne

- siRNA—j.w. - ale egzogennie

• próba blokady genów (odpowiedzialnych za nowotwory)

• próba blokady wirusów

TERAPIA GENOWA

Problem z nowotworami --> przerzuty (nawet jak mikroprzerzuty) a RTG i chemioterapia różnie skuteczne

Można próbować--- ale w terapii chorób jednogenowych (np. mukowiscydoza)

Chory gen => choroba

Wprowadzenie prawidłowego genu --> wektory wirusowe lub niewirusowe

Wprowadzenie prawidłowego genu ---> zmodyfikowane wirusem - bardziej efektywne i swoiste

• adenowirusy

• retrowirusy(RNA-wirusy)

• HSV, Lentivirus

Wprowadzenie niewirusowe - mniej swoiste, ale bardziej bezpieczne(nie powoduje reakcji zapalnej):

• liposomy

• elektropolacja

• polimery kationowe

• mikroiniekcje

Retrowirusy

Genom retrowirusa:

• Gen gag - składniki kapsydu, macierzy oraz nukleokapsydu

• Gen Pol - odwrotna transkryptaza i integraza

• Geny env - białka otoczki wirusa

• LTR - Long Terminal Repeats - sekwencje promotorowe

• Sekwencje ш - odpowiedzialne za pakowanie materiału genetycznego

Genom wektora:

• w miejsce sekwencji wirusowych gag, pol i env - gen wprowadzany do transferu

• + otoczka wirusowa(otrzymywana z tzw. komórek pakujących - retrowirus pozbawiony sekwencji ш)

Retrowirusy - bardzo opłacalne przy wprowadzaniu obcych genów:

• Niezdolne do transdukcji komórek niedzielących się (problem choroby OUN)

• Problem losowej integracji retrowirusa --> ryzyko aktywacji onkogenów

Pseudotypowanie

• zastąpienie produktu genu env białkiem innego wirusa - rozszerzenie zakresu zakażanych komórek

• np. białko ludzkiego vesicular stomatitis wirus dla mysiego wirusa białaczki(wektor terapii genowej , nie powoduje chorób)

Lentiwirusy:

• Retrowirusy wywołujące choroby niedoboru odporności u człowieka

• Mogą infekować komórki niedzielące się

Adenowirusy:

• DNA wirusy, bardzo rozpowszechnione

• W większości symptomatyczne infekcje

Adenowirusy - genom:

• Cztery regiony wczesnej transkrypcji (E1E4) - funkcje regulatorowe

• Geny białek strukturalnych

• Wektor - mutanty genu E nie ulegają replikacji

• Prace nad wycięciem sekwencji E2 i E4

Brak integracji z genomem gospodarza

• małe ryzyko aktywacji onkogenu

• krótki czas syntezy prawidłowego białka

Herpes wirus:

• HIV - neurotropizm - choroby OUN

• Podobnie jak adenowirusy niszczą komórkę efektorową - immunizacja

• Wektory - mutanty genów kinazy tymidynowej, reduktazy rybonukleazy - niszczenie komórek szybko dzielących się (neo)

Liposomy:

• Drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe

• Wiążą i kompensują DNA spontanicznie, tworzą kompleksy o wysokim powinowactwie do błon komórkowych

- mniej wydajny transfer niż retrowirusy

- nie wywołują immunizacji

Biobalistyka:

• Wystrzelenie światłem lasera ładunku (egzogennego DNA) - mikrokulki z metali szlachetnych opłaszczonych DNA

Elektropolacja:

• Krótkotrwałe ładunki elektryczne o wysokim napięciu tworzą pory w błonach komórkowych

Kationowe polimery

• duże powinowactwo do błon komórkowych

Mikroiniekcje

• Wstrzykiwanie DNA bezpośrednio do jąder za pomocą szklanych mikroigieł

Próby kliniczne:

• Choroby jednogenowe

• Brak skutecznego leczenia

• Możliwość transferu genu do komórek nowotworowych

Rodzinna hipercholesterolemia:

• mutacje genu rLDL

• pobranie koórek wątrobowych - insercja genu rLDL - iniekcje i.v.

• efekt - krótkotrwałe, nieznaczne obniżenie poziomu CHE

Mukowiscydoza:

• Mutacje genu CFTR

• First cystic fibrosis gene therapy trias were carried out in 1993

• Repeat administration of adenoassociated virus to the lung was safe

• Nonviral nanoparticles used, for the first time, in the nose of cystic fibrosis patients were also safe and led to partial correctin of the chloride transport defect in nasal epithelium.

• terapia genowa dotyczy postaci oddechowej(działa)

• inhalacje sprey'ów ze zmodyfikowanymi retrowirusami (duże ilosci zdrowych genów CFTR) --> częściowo hamują objawy kliniczne

• po klikunastu tygodniach po inhalacji --> nawroty, bo te zdrowe komórki się starzeją(a to są komórki germinalne) - nowopowstałe nadal mają uszkodzony gen;(

• lepsze wyniki - na etapie zarodkowym

SCID - severe combined immunodeficiency syndrome

• ADAgen deaminazy adenozyny

• 14. 09. 1990 - pierwszy transfer genu ADA do limfocytów 4 letniej dziewczynki

• Znaczna poprawa podczas terapii nie musiała żyć w warunkach sterylnych

• Transfer co kilka tygodni lub miesięcy

• Izolacja limfocytów T -> do laboratorium i strzelamy laserem gen ADA--> bardzo dużo razy, żeby częściowo się udało -->hodowanie i namnażanie prawidłowych limfocytów---> podanie i.v.

• Transfer ADA (retrowirusy) do komórek szpiku (stem cells)

• Długotrwałe efekty

• Opublikowano kilka przypadków wyleczeń

Hemofilia

• Brak czynnika VIII lub IX

• Komórka docelowa: fibroblasty skóry

• Ewentualnie przeszczep szpiku

• A number of phase 1 clinical trials have been conducted, and, although connection of the bleeding disorder was neither complete nor long-lasting, they do offer hope for a permanent gene therapy cure for the disease

Nowotwory

Melanoma

• Modyfikacja komórek neo in vitro i in vivo

• Konieczność zainfekowania znacznej ilości komórek guza

• Wprowadzamy gen HSVtk (kinaza tymidynowa) do komórek nowotworowych - podanie dożylne zmienionych autologicznych komórek nowotworowych

• Podanie Gancykloviru - fosforyzacja przez HSVtk - wbudowanie do DNA - terminacja replikacji

Terapia nowotworów OUN - retrowirus z deaminazą cytozynową (ECCD)

Konwersja obojetej 5fluorozytozyny do 5fluorouracylu

Antisense approach

I generacja - Wprowadzenie genu kodującego sekwencje antysensowną onkogenu(dobrze działa w wirusach HPV!)

II generacja - Complementary RNA sequences such as antisense RNAs and ribozymes to regulate the expression of specific genes. Despite the simplicity of this approach, this technique usually results in only partial suppression of gene expression and, in some instants, even fails to regulate the gene of interest

Strategia antysensu

• S - oligomery - co najmniej 15 nuklotydów

• Oligonukleotyd wycelowany w transkrypty genu wirusowego koniecznego do namnażania wirusa HIV - ustępowanie brodawek

• Oligonukleotydy skierowane przeciw VERF (Vascular Endothelial Growth Factor)

HLA -B7 - gene therapy

• iniekcje do guza DNA z HLA - B7 gene - 14 pacjentów - clinical response less than 25%

• nie powodujemy nekrozy guza, ale wzmagamy immunizację;)

• problem - dostarczenie leczniczego genu do wszystkich komórek guza

- modyfikacja układu immunologicznego

- wprowadzenie genTNF, rIL2

- TIL -Tumor Infiltating Lymphocytes -> limfocyty swoiście naciekające nowotwory --> wyizolowanie TILów, pobrać, zmodyfikować,żeby był np.w czerniaku skuteczny(wprowadzenie genTNF, lub rIL2),

wprowadzamy cytokiny prozapalne - bo ma działać

- TNFα --> działa na naczynia (a guzy naczyniowe), receptor a potem Il podanie ogólne

- Immunoterapia w Poznaniu(czerniaki) -> sIL - 6R(receptor) i Il - 6, ale odpowiedź kliniczna powyżej 25%

Cancer Center in Poznań, Poland a GMTVhas been tested in malignant melanoma patients. For the last 6 years more than 220 patients were enrolled into study of GMTV consisting melanoma cells modified with genes encoding IL6 and its agonistic solube recepetro (sIL6R). More than 25% of objective clinical responses and significant life extension were observed. The encouraging results formed a basis for design of a phase III prospective, randomized clinical study

Intratumoral or peritumoral injection of vectors expressing IFN gamma

• Gene modified cancer vaccines (GMTV) modified with genes encoding (i) cytokines or (ii) costimulatory molecules and dendritic cells modified with (iii) genes encoding tumor antigens or (iv) immunostimulatory factors.

• TIL -Tumor Infiltating Lymphocytes

• Wprowadzony genTNF, rIL2

• Since January 1996 in Departament of cancer Immunology USOMS, at Great Poland

Próby kliniczne innych nowotworów

• Rak jelita grubego

• Nerki

• Jajnika

• Piersi

• Płuc

• Wątroby

• Prostaty

• Chłoniak

• Białaczka

4

---