Enzymy
Izoenzymy, izoformy, makroenzymy
Enzymy w diagnostyce laboratoryjnej
Znaczenie enzymów w diagnostyce klinicznej
zmiany aktywności enzymów we krwi  odbicie zmian zachodzących w narządach
rodzaj uszkodzenia determinuje rodzaj enzymów uwalnianych z uszkodzonej
tkanki -  konstelacja zmian enzymatycznych
uszkodzenie narządu = uszkodzenie struktur komórkowych
lub zmiana przepuszczalności błon komórkowych
ucieczka enzymów spadek syntezy enzymów
zwiększenie zmniejszenie
ich ilości w płynach ustrojowych i wydalinach
 Izoenzymy
enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych
tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki
produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów
różne właściwości fizyczne i chemiczne:
punkt izoelektryczny
ruchliwość elektroforetyczna
powinowactwo do substratów
wrażliwość na czyniki regulatorowe
wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mAb
niepożądanych izoenzymów
dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz.
znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można
przypisać ich aktywności enzymatycznej!
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
enzym cytoplazmatyczny, wyst. we wszystkich komórkach organizmu
katalizuje odwracalną reakcję mleczan �!pirogronian
największa aktywność w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym
mózg, mięsień sercowy,
erytrocyty, leukocyty, płytki krwi (hemoliza ę!akt.)
nerki, wątroba, płuca
występuje 5 izoenzymów
wykrywanie:
elekroforeza (różna ruchliwość elektroforetyczna poszczególnych
izoenzymów)
dla LDH1  reakcja z �-hydroksymaślanem (swoisty substrat)  kiedyś w
diagnostyce zawału mm sercowego
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek  tetramer
dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie:
M  typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11)
H  typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12)
geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach
w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu
wytwarzane
rożne połączenia podjednostek  5 izoenzymów:
LDH1  HHHH
LDH2  HHHM
LDH3  HHMM
LDH4  HMMM
LDH5  MMMM
 Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
w surowicy ludzkiej obecne wszystkie izoenzymy LDH
ich proporcje zmieniają się w różnych stanach chorobowych, w
zależności od tego, które izoenzymy są produkowane przez uszkodzony
narząd
u osób zdrowych - LDH2>LDH1
zawał serca, uszkodzenie mięśnie szkieletowych  LDH1>LDH2
anemia hemolityczna - ę!LDH1, ę!LDH2, LDH2>LDH1
dystrofia mięśniowa, nowotwory, ch. wątroby - ę!LDH4, ę!LDH5
(10-20x)
zawał serca z niewydolnością w krążeniu wrotnym  ę!LDH1,
ę!LDH2, ę!LDH5
nasieniak najądrza  ę! LDH1 izolowany
Izoformy enzymów
produkty tego samego genu
katalizują tę samą reakcję chemiczną
inna budowa cząsteczki enzymu na skutek:
zmian posttranslacyjnych struktury białka
fosfataza alkaliczna (ALP)  izoformy kostna i wątrobowa
degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i
osocza
kinaza kreatynowa  CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2
wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem
przeciwciał moloklonalnych
Fosfataza zasadowa (ALP)
hydrolaza  odszczepia monofosforany od reszt organicznych w
środowisku silnie zasadowym (pH 10)
białko zewnętrznej błony plazmatycznej lub w kompleksach z innymi
białkami błonowymi
funkcja:
transport jonów fosforanowych przez błony
uczestniczy w interakcji między osteoblastami a macierzą
nieorganiczną
transport IgG z osocza matki do płodu (?)
występują izoenzymy, izoformy i frakcje
hemoliza, tłusty posiłek, menstruacja, doustne estogeny 
podwyższenie akt. ALP
Fosfataza zasadowa (ALP)
1.Izoenzym tkankowo niespecyficzny
wyst. praktycznie w każdej tkance
cztery izoformy (glikozylacja): kostna, wątrobowa i nerkowa
izoforma kostna
uwalniana przez aktywne osteoblasty
dominuje u dzieci w okresie wzrostu
wzrost akt. w chorobach kości (osteomalacja, krzywica, osteoporoza)
wzrasta w okresie rekonwalescencji, podczas zrastania kości, po
zabiegach operacyjnych
Obecnie oznacza się masę izoformy tech. immunoenzymatycznymi
Fosfataza zasadowa (ALP)
izoforma wątrobowa
produkowana przez hepatocyty
wzrost akt. w chorobach wątroby i cholestazie
w cholestazie i przerzutowych guzach wątroby pojawać się
mogą frakcje (nawet, gdy całkowita ALP w normie)
f. żółciowa  wielonzymatyczny kompleks błonowy
f. makromolekularna  kompleks e. z lipoproteiną X
izoforma nerkowa
nie wyst. u osób zdrowych
w chorobach nerek (bez znaczenia diagnostycznego)
Fosfataza zasadowa
(ALP)
1.Izoenzym tkankowo niespecyficzny
2.Izoenzym jelitowy
gr. krwi O i B
produkowana przez enterocyty
wzrost w chorobach wątroby: przewlekłe zap. wątroby, marskość
(osłabione usuwanie przez wątrobę)
3.Izoenzym komórek zarodkowych
nie obecny w osoczu osób zdrowych
ektopowo w nowotworach zarodkowych, przysadki i grasicy
4.Izoenzym łożyskowy
fizjologicznie u ciężarnych, od II trymestru, zanika wkrótce po porodzie
ektopowo w nowotworach płuc, jajnika, macicy, jąder, ukł.
żołądkowo-jelitowego
Makroenzymy
enzymy występujące we krwi, które tworzą kompleksy o dużej masie
cząsteczkowej poprzez:
polimeryzację
łączenie z immunoglobulinami (IgG, rzadziej IgA) lub lipidami
prawdopodobnie związane z powstawaniem autoprzeciwciał,
niekiedy u chorych z nowotworami
u 1,5  2,5% populacji ogólnej, najczęściej u osób starszych
dotyczy przede wszystkim amylazy i aminotransferazy asparaginowej (AspAT)
najczęściej zjawisko niezwiązane z chorobą
kiedy? - izolowana, kilkakrotnie stwierdzana podwyższona aktywność enzymu bez
objawów klinicznych lub z symptomami nietypowymi dla danej enzymopatii
duża masa cząsteczkowa osłabiona filtracja kłębkowa wydłużony czas
półtrwania podwyższona aktywność
wykrywanie: strącanie makromolekuł glikolem etylenowym, HPLC, elektroforeza
Klasyfikacja enzymów
ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji
EC 1  oksydoreduktazy
EC 2  transferazy
EC 3  hydrolazy
EC 4  liazy
EC 5  izomerazy
EC 6  ligazy (syntetazy)
ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej
(podział kliniczny)
e. wskaz
nikowe
e. sekrecyjne
e. ekskrecyjne
Enzymy wskaz
nikowe (indykatorowe)
enzymy wewnątrzkomórkowe
uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki 
wzrost aktywności we krwi
zawartość enzymu wskaz
nikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od:
jego ilości w uszkodzonej tkance
liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia
rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów
przykłady:
kinaza kreatynowa (CK)
dehydrogenza mleczanowa (LDH)
aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)
Aminotransferaza alaninowa (AlAT, ALT)
występowanie:
cytoplazma komórek wątroby
komórki ścian cewek nerkowych
mięśnie poprzecznie prążkowane, w tym serce
w niewielkich ilościach  wszystkie tkanki (hemoliza zawyża wynik)
fizjologicznie niewielkie ilości w osoczu, pł. mózgowo-rdzeniowym, moczu
wzrost akt. w osoczu  gł. przyczyny wątrobowe
uszkodzenie wątroby (stany zapalne, gł. zakażenia HBV, HCV,
poalkoholowe, toksyczne uszkodzenia)
uszkodzenie mięśni szkieletowych (urazy, niedokrwienie, mioliza)
zawał serca
często oznacza się wraz z akt. aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)
 wskaz
nik de Ritisa
Enzymy sekrecyjne
fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi
tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza
niewydolność narządu produkującego i wydzielającego
powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach
wątroby)
przykłady:
czynniki krzepniecia i fbrynolizy
esteraza cholinowa
ceruloplazmina
lipaza lipoproteinowa
Cholinoesteraza, pseudocholinoesteraza (ChE)
katalizuje hydrolizę estrów choliny do choliny i kw. tłuszczowego
acetylocholinesteraza (AchE) ukł. nerwowego i erytrocytów, rozkłada
acetylocholinę
pseudocholinoeateraza (ChE)  produkowana przez wątrobę, wydzielana do
krwi, funkcja nieznana
znaczenie diagnostyczne:
diagnostyka/monitorowanie osób narażonych na kontakt ze związkami
fosforoorganicznymi (niodwracalne inhibitory AchE)
�! aktywności
miąższowe choroby wątroby
niedożywienie
wstrząs pourazowy
terapia promieniami X, lekami cytotoksycznymi
Enzymy ekskrecyjne
produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych:
śliny
światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy)
płynu nasiennego
ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania
(zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu
przykłady:
amylaza
lipaza
fosfataza zasadowa
ł-glutamylotranspeptydaza
ą-amylaza i lipaza
enzymy ekskrecyjne
lipaza  trzustka, zoładek, jelita
ą-amylaza  trzustka, ślinianki , wątroba, mięśnie, neutrofile
ę! akt. amylazy
ostre zapalenie trzustki (max. ę! po 12 h., potem �! - wyczerpanie
zdolności wydzielniczej trzustki
kolka nerkowa
kolka zółciowa
perforacja wrzodu
niedrożnośc jelit
zapalenie ślinianek (izoenzym śliniankowy)
ę! akt. Lipazy
proces zapalny trustki (wyższa swoistośc narżdowa niż amylaza)
hemoliza  zaniża akt. lipazy
ą-amylaza i lipaza
MAKROAMYLAZEMIA
stan nie związany z chorobą
ę! akt. we krwi bez ę! w moczu
polimeryzowanie cz. enzymu lub łączenie się z immunoglobulinami
duże kompleksy białkowe nie przechodzą do moczu
Triacyloglicerole (hipertriglicerydemia) hamują aktywność amylazy
Amylaza w moczu
odzwierciedla akt. we krwi
monitorowanie przebiegu ostrego zapalenia trzustki
Oznaczanie enzymów
Pośrednio - aktywność
badanie przemiany chemicznej substratu katalizowanej przez dany enzym
pomiar ilości enzymu w układzie na podstawie pomiaru szybkości reakcji
w określonych warunkach szybkość reakcji jest proporcjonalna do
ilości enzymu
szybkość reakcji wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu
szybkość rekcji maleje z czasem (hamujący wpływ produktu, stopniowa
inaktywacja enzymu) mierzona jest prędkość początkowa vo ,
dostateczni duże stężenie substratu dla wysycenia enzymu
prędkość początkową  przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu
umożliwiającej zachodzenie reakcji odwrotnej
Bezpośrednio - masa
oznaczanie ilości białka enzymatycznego met. immunochemicznymi
Badanie aktywności enzymatycznej
w płynach ustrojowych
surowica/osocze
mocz
płyn mózgowo-rdzeniowy
aktywność w surowicy/osoczu <<< aktywność w tkankach (także w kwinkach) 
surowica z hemolizą  wyniki zawyżone
białka osocza, składniki surowicy (w tym leki) mogą być aktywatorami/inhibitorami
reakcji enzymatycznych
antykoagulanty (heparyna, fluorek)  pływ +/- na akt. enzymów
izoenzymy  różne powinowactwo do substratu i maks. aktywność przy różnych
stężeniach substratu
niekiedy krótki czas, w którym obserwuje się zmiany akt. enzymatycznej związane
ze stanem chorobowym
Jednostki aktywności enzymatycznej
Katal (kat)
ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy
układ SI; [mol/s]
duża jednostka używane mikro- , nano-, pikokatal
Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna,
międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit)
ilość enzymu katalizująca przemianę 1 źmola substratu (lub odpowienich
grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych
(30�C, optymalne pH, maksymalne wysycenie enzymu substratem)
1U = 1/60 źkatala = 16,67 nanokatala
Jednostki aktywności enzymatycznej
Aktywność właściwa
liczba jednostek enzymu na 1 mg białka
określa czystość preparatu enzymatycznego
Aktywność molekularna
liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych)
przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy
optymalnym stężeniu substratu)
Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze  kat(lub U)/1 ml roztworu
Test optyczny Warburga
wykorzystuje różnice w absorpcji światła o dł. fali 340 nm między
formą utlenioną a zredukowaną NAD i NADP
utenianie/redukcja NAD+/NADH proporcjonalny spadek/wzrost
absorbancji przy 340 nm
Pierścienie purynowy
i pirmidynowy
Pierścień
pirydynowy w
amidzie kw.
nikotynowego w
NADH  układ
dihydropirydy
Test optyczny Warburga
ilościowa analiza dehydrogenaz zależnych od NAD+ i NADP+
lub innych enzymów o reakcjach sprzężonych z dehydrogenazami
aktywność heksokinazy
proporcjonalna do
wzrostu absorbancji przy
340 nm