INSTYTUT CHEMII I OCHRONY ŚRODOWISKA
WYDZIAA
MATEMATYCZNO  PRZYRODNICZY
AKADEMIA im. JANA DA
UGOSZA
CZ
STOCHOWA
Instrukcja do ćwiczenia:
Chromatografia kolumnowa
Kierunek: Biotechnologia studia I stopnia
Rok II
Przedmiot: Procesy rozdzielania i oczyszczania produktów biotechnologicznych  laboratorium
Opracował dr Tomasz Girek
Częstochowa 2008
1. Wprowadzenie
Chromatografia adsorpcyjna jest najstarszą metodą chromatograficzną. Wykorzystuje różnice w
adsorpcji związków chemicznie podobnych na powierzchni sproszkowanego i nasyconego
rozpuszczalnikiem adsorbentu.
Adsorbent nie może reagować z substancjami rozdzielanymi ani z rozpuszczalnikiem, musi być
nierozpuszczalny w danym rozpuszczalniku i wykazywać odpowiednią aktywność w wiązaniu
rozdzielanych substancji. Rozdział zależy od natury adsorbentu i rozpuszczalnika. Poniżej podano
najczęściej używane adsorbenty i rozpuszczalniki uporządkowane według wzrastającej aktywności:
Adsorbenty: sacharoza < skrobia < talk < węglan sodowy < węglan potasowy < węglan wapniowy <
fosforan wapniowy < węglan magnezowy < tlenek magnezowy < tlenek wapniowy < żel
krzemionkowy < krzemian magnezowy < tlenek glinowy < węgiel aktywny < ziemia Fullera.
Rozpuszczalniki: eter naftowy (benzyna lekka) < czterochlorek węgla < cykloheksan < dwusiarczek
węgla < eter etylowy < aceton < benzen < estry kwasów organicznych < chloroform < etanol < woda
(zależnie od pH i rozpuszczonych soli) < pirydyna < kwasy organiczne.
Najsilniej adsorbuje węgiel aktywny i ziemia Fullera, najsłabiej sacharoza i skrobia. Najlepiej
adsorbują się związki rozpuszczone w eterze naftowym, a najsłabiej w pirydynie, wodzie i
kwasach organicznych. Do elucji lepiej nadają się rozpuszczalniki polarne (etanol, woda, pirydyna)
niż niepolarne, takie jak eter naftowy czy chloroform.
W chromatografii adsorpcyjnej rozdział zależy od siły, z jaką dana substancja jest adsorbowana z
rozpuszczalnika otaczającego fazę stałą. Warunkiem uzyskania dobrego rozdziału jest równomierne
wypełnienie kolumny suchym i odpowiednio oczyszczonym adsorbentem oraz właściwe wymiary
kolumny. Najczęściej stosunek średnicy rurki szklanej do jej długości wynosi 1:20.
W trakcie sączenia badanego roztworu przez kolumnę substancje silniej adsorbowane przesuwają się
wolniej, a słabo adsorbowane  szybciej. W przypadku barwników roślinnych, na różnej
wysokości kolumny powstają barwne pasma odpowiadające poszczególnym barwnikom. W celu
lepszego rozdzielenia pasm kolumnę przemywa się tym samym rozpuszczalnikiem, albo innym o większej
sile wymywania, wskutek czego warstwy szybciej przesuwają się ku dołowi i lepiej się rozdzielają.
II. Cel i wykonanie ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest chromatograficzne rozdzielenie barwników roślinnych: chlorofilu, ksantofilu
i karotenu. W ramach ćwiczenia należy przygotować kolumnę do rozdziału chromatograficznego,
wyekstrahować barwniki z materiału roślinnego oraz przeprowadzić ich chromatograficzne rozdzielenie.
Przygotowanie kolumny chromatograficznej
Kolumnę chromatograficzną stanowi szklana rurka o średnicy 5 cm, długości 60 cm, zwężająca się u
dołu z kranem teflonowym.
1. Wprowadzić do kolumny małymi porcjami około 20 g skrobi kartoflanej, lekko ubijając przez
potrząsanie kolumną. Na górnej powierzchni skrobi położyć mały kłębek waty. Pozostawić u góry
około 5 cm wolnej przestrzeni.
2. Po napełnieniu umieścić kolumnę w uchwycie statywu, podstawić u dołu odbieralnik.
3. Wlewać małymi porcjami (ostrożnie, po ściance kolumny) 10 cm3 heksanu, tak aby nie wzburzyć
powierzchni skrobi, pilnując, aby nad skrobią utrzymywała się stale około 0,5 cm warstewka płynu.
Przemywanie kolumny zakończyć w chwili, gdy nadmiar rozpuszczalnika zacznie wypływać u
dołu kolumny.
4. Nad górną powierzchnią skrobi musi pozostać 0,5 cm warstewka cieczy.
Przygotowanie wyciągu z liści
1. Około 2 g liści rozdrobnić w moz
dzierzu.
2. Dodać 10 cm3 mieszanki heksanu z metanolem (98% obj. eteru).
3. Przesączyć przez bibułę zwilżoną heksanem do czystej i suchej probówki.
Rozwijanie chromatogramu
1. Przesączony wyciąg z liści wprowadzić na kolumnę, zachowując 0,5 cm warstwę cieczy nad
powierzchnią skrobi.
2. Po wprowadzeniu całego wyciągu na kolumnę (około 15 min), dodać, wlewając małymi porcjami
po ściance, 15 cm3 rozpuszczalnika składającego się z mieszaniny heksanu, metanolu i eteru
etylowego (odpowiednio: 93% obj., 2% obj. i 5% obj.).
3. Po 20 min otrzymuje się wyraz
ny rozdział barwników liścia w następującej kolejności:
żółtozielony chlorofil b, który najsilniej adsorbuje się na skrobi,
niebieskozielony chlorofil a,
żółty ksantofil,
karoten, który jako najsłabiej adsorbujący się na skrobi wypływa z kolumny.
Sprawozdanie
W sprawozdaniu zamieścić rysunek pokazujący uzyskany rozdział barwników roślinnych.