Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez

inwertazę

Prowadzący:

dr hab. inż. Ilona WANDZIK

mgr inż. Sebastian BUDNIOK

mgr inż. Marta GREC

mgr inż. Jadwiga PASZKOWSKA

Miejsce ćwiczenia: sala 7

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa (Km) oraz szybkości maksymalnej (Vmax) dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę oraz określenie wpływu stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.

WSTĘP TEORETYCZNY

Kinetyka reakcji enzymatycznych

(na podstawie „Ćwiczenia z biochemii”, praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa-Poznań 1982)

Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w zależności od różnych czynników (stężenia reagentów, temperatury, obecności katalizatorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu.

Podstawą

katalitycznej

reakcji

enzymatycznej

jest

odwracalne

wzajemne

oddziaływanie substratu (S) z enzymem (E), przy którym powstaje nietrwały kompleks (ES), który następnie rozpada się na enzym i produkt reakcji (P).

Schemat reakcji enzymatycznej można przedstawić równaniem:

k1

k

E + S

3

ES

E + P

k2

Gdzie: E

wolny enzym

S

substrat

ES

kompleks enzym-substrat

P

produkt

k1, k2, k3

stałe szybkości reakcji

W równaniu tym zakłada się nieodwracalny mechanizm reakcji.

Przy małym stężeniu enzymu, lecz przy zmieniającym się w szerokich granicach początkowym stężeniu substratu, zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako ilość substratu przetworzonego w jednostce czasu, można przedstawić w postaci krzywej: szybkość

V=-d[S]/dt

-d[S]/dt=k[E]

-d[S]/dt=k[E][S]

stężenie substratu [S]

Wpływ zwiększania stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

2

Krzywa w pewnym punkcie zgina się i osiąga wartość maksymalną. Przy małym stężeniu substratu reakcja jest I rzędu i szybkość reakcji jest uzależniona od stężenia substratu [S].

Przy zwiększeniu stężenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, która jest niezależna od stężenia substratu. Tłumaczy się to faktem, że przy zbyt małym stężeniu substratu niektóre cząsteczki enzymu nie są połączone z substratem w danym momencie i niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, że nie wykazuje on maksymalnej aktywności katalitycznej.

W miarę zwiększania stężenia substratu dochodzi do momentu, gdy wszystkie cząsteczki enzymu są z nim połączone i wówczas enzym pracuje z maksymalną szybkością. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już na zwiększenie szybkości reakcji- reakcja przebiega ze stałą szybkością.

Dla reakcji (1) szybkość poszczególnych przemian jest następująca:

v1=k1[E][S]=k1[Ec-ES][S]

(2)

v2=k2[ES]

(3)

v3=k3[ES]

(4)

gdzie: [E] – stężenie enzymu wolnego

[S] – stężenie substratu

[ES] – stężenie kompleksu enzym-substrat

[Ec] – stężenie całkowite enzymu biorącego udział w reakcji

Kompleks ES tworzy się z szybkością v1, a rozkłada z szybkością v2+v3

k1[Ec-ES][S]=k2[ES]+k3[ES]

(5)

Po przekształceniu otrzymujemy:

[Ec-ES][S]

k2+k3

=

= K

[ES]

m

(6)

k1

Uwzględniając, że [Ec-ES]=[E], otrzymujemy:

[E][S] = K

(7)

[ES]

m

Wielkość Km zwana stałą Michaelisa jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu.

Enzymy o niskiej wartości Km działają znacznie sprawniej niż enzymy o wysokiej Km.

Szybkość tworzenia produktu v3 zależy od [ES], a więc im wartość [ES] jest większa, a tym samym stała Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie produktu.

Szybkość reakcji enzymatycznej można zapisać równaniem

v3 = v1-v2

(8)

Reakcja v2 przebiega bardzo wolno, więc można przyjąć, że szybkość procesu enzymatycznego v przebiega z szybkością v3:

v = v3 = k3[ES]

(9)

Gdy substrat występuje w dużym nadmiarze, cały enzym jest nasycony substratem,

[ES]=[Ec], szybkość reakcji osiąga swą wartość maksymalną:

Vmax = k3[Ec]

(10)

Korzystając z odpowiednich przekształceń równań otrzymujemy zależność: Vmax[S] = V (11)

Km+[S]

3

szybkość

reakcji

V

Vmax

1/2 V

Km

[S]

Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten

Jeżeli do równania (11) wstawimy v=vmax/2, to otrzymamy po przekształceniu: Km = [S]

(12)

Czyli stała Michaelisa odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej.

Praktyczną metodą określania stałej Michaelisa i szybkości reakcji jest metoda graficzna.

Doprowadzając równanie (11) do postaci:

1

Km 1

1

=

+

V

Vmax [S]

Vmax

(13)

Otrzymujemy rónanie o postaci ogólnej y = ax + b, gdzie: b = 1/Vmax

Równanie (13) nosi nazwę równania Lineweavera-Burka. Przekształcenie to ma na celu uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej. W układzie współrzędnych wartości 1/v odkłada się na osi rzędnych, a wartości 1/[S] na osi odciętych. Równanie daje wówczas linię prostą, której nachylenie określa stosunek Km/Vmax. Przecina ona oś rzędnych w punkcie 1/Vmax, a oś odciętych w punkcie 1/Km. W ten sposób można określić maksymalną szybkość Vmax oraz stałą Michaelisa Km.

Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten według Lineweavera-Burka

4

Aktywność optyczna

Związki optycznie czynne posiadają zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła.

Gdy światło spolaryzowane, wykazujące drgania w określonej płaszczyźnie przejdzie przez substancję optycznie czynną, wówczas jego drgania pojawiają się w innej płaszczyźnie. Kierunek i stopień skręcenia można mierzyć za pomocą polarymetru.

Skręcenie w lewo oznaczamy znakiem (-), a skręcenie w prawo znakiem (+). Na przykład (+)-sacharoza jest prawoskrętna. Wielkość kąta skręcenia zależy od liczby cząsteczek znajdujących się na drodze wiązki światła podczas jej przechodzenia przez rurkę polarymetryczną, a zatem zależy od stężenia próbki i od długości rurki pomiarowej.

Skręcalność właściwą [α]D danego związku definiujemy jako zaobserwowaną wartość skręcenia, gdy długość rurki pomiarowej wynosi 1 decymetr, stężenie próbki wynosi 1g/ml, a długość fali światła wynosi 589 nm.

α

[α]

D = l c

α - obserwowane skręcenie (w stopniach),

l – długość rurki polarymetrycznej (w dm),

c – stężenie roztworu (g/ml).

Skręcalność właściwa [α]D jest wielkością fizyczną charakterystyczną dla danego związku optycznie czynnego, podobnie jak temperatura topnienia, temperatura wrzenia, gęstość lub współczynnik załamania światła.

Hydroliza sacharozy

Sacharoza jest dwucukrem zbudowanym z cząsteczki D-glukopiranozy i D-fruktofuranozy. Wiązanie łączące glukozę z fruktozą ulega hydrolizie i to zarówno pod wpływem kwasów mineralnych, jak i enzymu zwanego inwertazą. Z tą reakcją związane jest zjawisko zwane inwersją sacharozy, polegające na zmianie znaku skręcalności roztworu sacharozy (+), gdyż w powstałej równomolowej mieszaninie cukrów fruktoza silniej skręca płaszczyznę polaryzacji w kierunku (-) niż glukoza (+) i cały roztwór przyjmuje skręcalność ujemną, czyli po reakcji znak skręcalności roztworu zmienia się na przeciwny ( inwersja). Otrzymywany produkt, który jest mieszaniną D-glukozy i D-fruktozy nazywany jest cukrem inwertowanym.

C

+

12H22O11

+

H2O

C6H12O6

C6H12O6

sacharoza

D-glukoza

D-fruktoza

[α]D = +66.4o

[α]D = +52.1o [α]D = -93.1o

cukier inwertowany

[α]D = -20.5o

5

WYKONANIE ĆWICZENIA

Sprzęt:

polarymetr,

rurka polarymetryczna,

kolba miarowa o poj. 100 ml, 6 szt,

pipeta miarowa o poj. 25 ml,

kolby stożkowe o poj. 50 ml, 6 szt.,

mikropipeta, ,

waga analityczna.

Materiał i odczynniki:

sacharoza,

bufor octanowy o pH 4,7

roztwór inwertazy

Zadanie 1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy

sacharozy katalizowanej przez inwertazę.

Wykonanie ćwiczenia:

Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 4 g/100 ml w buforze octanowym.

Do 25 ml roztworu dodać 0.100 ml (100µl) roztworu inwertazy, wymieszać, szybko napełnić rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcania. Pomiary wykonać w 2, 4, 6, 8 i 10 minucie od wprowadzenia inwertazy do roztworu.

Analogicznie przeprowadzić hydrolizę sacharozy wobec takiej samej ilości enzymu dla roztworów o stężeniu 0,5 g/100 ml, 1 g/100 ml, 1,5 g/100 ml, 2 g/100 ml i 3 g/100

ml.

Opracowanie wyników:

1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli (dla każdego stężenia substratu): Stężenie

Stężenie

Szybkość

Czas, Skręcalność, substratu, c produktu, c

początkowa, v

1/c

min

stopnie

s

o-cs,

o,

O

1/vO

g/100 ml

g/100 ml

g/min

2

4

6

8

10

1

,

1 6

c =

*α + ,

0 23 * c

S

O

l

l- długość rurki polarymetrycznej, dm

α- kąt skręcania, stopnie

cO- stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów, g/100 ml.

6

2. Dla każdego stężenia sacharozy wykreślić zależność ilości wytworzonego produktu (cO – cS) od czasu.

3. Na każdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0 i wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tgα.

4. Sporządzić wykres Michaelisa-Menten na podstawie wyznaczonych szybkości początkowych vO oraz wyznaczyć na tej podstawie stałą Michaelisa Km.

5. Sporządzić wykres zależności 1/vO od 1/cO dla równania Lineweavera-Burka i wyznaczyć stałą Michaelisa Km oraz maksymalną szybkość reakcji Vmax.

Zadanie 2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.

Wykonanie ćwiczenia:

Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 10 g/100 ml w buforze octanowym i do 25 ml tego roztworu wprowadzić 0.25 ml roztworu inwertazy.

Wymieszać, szybko napełnić roztworem rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcenia. Pomiary powtórzyć w 5, 10, 15 i 20 minucie doświadczenia.

Analogicznie przeprowadzić badania stosując: 0.125 ml, 0.050 ml, 0.025 ml roztworu inwertazy.

Opracowanie wyników:

1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli – dla każdego stężenia inwertazy: Stężenie

Stężenie

Szybkość

Czas, Skręcalność, substratu, c produktu, c

początkowa, v

min

stopnie

s

o-cs,

o,

g/100 ml

g/100 ml

g/min

0

5

10

15

20

2. Dla każdego stężenia enzymu sporządzić wykresy zależności ilości produktu od czasu.

3. Wyznaczyć szybkości początkowe reakcji.

4. Przedstawić graficznie zależność szybkości vO od stężenia enzymu.

5. Zinterpretować uzyskane wyniki.

Warunki zaliczenia ćwiczenia:

• Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia

• Wykonanie sprawozdania,

Uwaga: na zajęcia należy przynieść papier milimetrowy

7