Strona 1 z 5
Sprawozdanie 7.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
Ćwiczenie 9.
Mateusz Jędrzejewski
laboratorium
grupa
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
mgr inż. Michał Jakób
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
białka metodą Bradford.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Wstęp teoretyczny
Kolorymetria jest techniką analityczną wykorzystującą zdolność związków chemicznych do absorbancji światła (np. VIS, UV) w celu oznaczania ich stężenia w roztworze. Zakłada się często liniową zależność absorbancji od stężenia . Stosuje się wówczas prawo Lamberta-Beera (1), gdzie to współczynnik ekstynkcji (absorbancji), a to długość drogi optycznej.
· ·
(1)
Zawsze należy sporządzić krzywą standardową (jest to zależność absorbancji od stężenia/masy/liczności) dla danego związku który się oznacza.
Jedną z metoda kolorymetrycznego oznaczania stężenia białka jest metoda Bradford. Opiera się ona na wiązaniu barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem. Barwnik ten występuje w trzech różnych formach jonowych. Zależy to od uprotonowania barwnika, czyli od pH
roztworu. Forma I koloru czerwonego dominuje przy pH < 0,5. Forma II koloru zielonego dominuje w zakresie 1< pH < 2. Forma III koloru niebieskiego dominuje w 3 < pH < 9. Barwnik związany z białkiem ma kolor niebieski. Widmo absorbancji kompleksu posiada dwa maksima, jedno przy 465 nm dla formy kationowej, drugie przy 595 nm dla formy anionowej.
Na tej podstawie można szacować ubytek barwnika, a przez to stężenia białka w roztworze.
Białko poprzez reszty arginylowe, aromatyczne i lizynowe oddziałuje z barwnikiem (jest to proces odwracalny). Siła tego specyficznego oddziaływania zależy od stężenia oznaczanego białka. Jest to jednocześnie prosta i czuła metoda kolorymetryczna.
Zabarwienie utrzymuje się do 90 minut. Pozwala oznaczać od 1 do 50 μl białka.
Na oznaczanie nie mają wpływu kwasy nukleinowe obecne w roztworze. Natomiast wrażliwa jest do obecność surfaktantów. Różne białka, ale o identycznym stężeniu mogą dawać bardzo różne intensywności zabarwienia po reakcji z barwnikiem.
Protokół
Do probówki dodano 2 ml buforu (10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7,0). Wyzerowano spektrofotometr. Do probówki dodano 0,5 ml standardu białkowego (roztwór immunoglobuliny G). Zmierzono absorbancję roztworu przy 280 nm.
0,2366
,%
· ·
gdzie: ,%
1,5 ml
mg·cm
1 cm
Stężenia białka standardowego w badanej próbce:
0,2366
mg
0,158
,% ·
1,5 · 1
ml
Strona 2 z 5
Sprawozdanie 7.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
Ćwiczenie 9.
Mateusz Jędrzejewski
laboratorium
grupa
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
mgr inż. Michał Jakób
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
białka metodą Bradford.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Stężenia wyjściowe białka standardowego:
standardu $ Vbuforu
0,5 $ 2,0
5
standardu
0,5
mg
µg
· 5 · 0,158 0,79
0,79
ml
µl
Przygotowano 15 ponumerowanych próbówek. Zgodnie z tabelami 1., 2. oraz 3.
przygotowano roztwory w kolejnych próbkach.
Tabela 1. – Przygotowanie roztworów standardu
.
V
nr próbki
standardu
standardu
buforu
,µl-
,µg-
,µl-
1
0
0,00
100
2
2
1,58
98
3
3
2,37
97
4
6
4,73
94
5
13
10,25
87
6
25
19,72
75
7
51
40,22
49
gdzie: .standardu to rzeczywista masa standardu
Tabela 2. – Przygotowanie roztworów immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu V
nr próbki
IgG
buforu
,µl-
,µl-
8
10
90
9
20
80
10
40
60
11
60
40
Tabela 3. – Przygotowanie roztworów białka w obecności SDS
V
V
C
nr próbki
standardu
buforu
SDS
SDS
,µl-
,µl-
,µl-
4w/v8
12
13
87
0
0,0 %
13
13
77
10
1,0 %
14
13
67
20
2,0 %
15
13
37
50
5,0 %
gdzie: .standardu 10 µg
9
standardu
standardu
12,7 µg = 13 µg
:standardu
,;<
Stężenie wyjściowe C SDS 10% 4w/v8
Objętość całkowita próbki > standardu $ Vbuforu $ VSDS 100 µl
?
@
(dla V
A
SDS B 0)
SDS
ASDS
Stężenie w próbce:
CD
%·A
A
C
SDS
SDS
SDS
SDS
%
E
Strona 3 z 5
Sprawozdanie 7.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
Ćwiczenie 9.
Mateusz Jędrzejewski
laboratorium
grupa
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
mgr inż. Michał Jakób
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
białka metodą Bradford.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Do przygotowanych 15 probówek dodano po 2 ml odczynnika Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Roztwory delikatnie wymieszano. Odczekano 5 minut. Spektrofotometr wyzerowano przy 595 nm na bufor standardowy. Zmierzono absorbancję 15 próbek przy 595 nm. Zerowano i pomiary powtórzono dla 465 nm. Wyniki umieszono w tabeli 4. oraz 5a.
Wyniki
Wyznaczane ilorazy F<F/GHF dają dobra linearyzację wyników metody Bradford.
Tabela 4. – Absorbancja dla roztworów standardu
.
nr próbki
standardu
standardu
,µg-
,µl-
F<F
GHF
F<F/GHF
1
0,00
0
0,674
1,172
0,58
2
1,58
2
0,671
1,135
0,59
3
2,37
3
0,722
1,158
0,62
4
4,73
6
0,846
1,136
0,74
5
10,25
13
0,926
1,032
0,90
6
19,72
25
1,084
0,983
1,10
7*
40,22
51
1,536
0,744
2,06
gdzie: .standardu to rzeczywista masa standardu
* przy obliczeniu regresji liniowej (Wykres 1.) pominięty punkt pomiarowy próbki 7.
ponieważ jest znacznie oddalony od prostej wyznaczonej przez pozostałe punkty.
Wykres 1. – Krzywa standardowa IgG
2,50
2,00
1,50
564
/A 595A 1,00
0,50
0,00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
m
[μg]
standardu
Wyznaczono równanie regresji z wykresu 1.:
F<F/GHF 0,0278 · .standardu $ 0,5764
więc:
F<F/GHF K 0,5764
.x
0,0278
Strona 4 z 5
Sprawozdanie 7.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
Ćwiczenie 9.
Mateusz Jędrzejewski
laboratorium
grupa
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
mgr inż. Michał Jakób
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
białka metodą Bradford.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Tabela 5a. – Obliczenia stężeń białek w badanych próbkach
,
nr
F<F/GHF L4. ,µg-8
.
próbki*
x
x
x
F<F
GHF
F<F/GHF
,µg-
,µl-
,µg/µl-
8
0,715
1,146
0,624
1,71
10
0,17
9
0,736
1,115
0,660
3,01
20
0,15
10
0,834
1,099
0,759
6,56
40
0,16
11
0,901
1,049
0,859
10,16
60
0,17
12
0,920
1,020
0,902
11,71
13
0,90
13
1,174
0,788
1,490
32,86
13
2,53
14
1,158
0,789
1,468
32,06
13
2,47
15
1,154
0,782
1,476
32,35
13
2,49
9
gdzie:
x
M
?x
* 8-11 to próbki z immunoglobuliną G o nieznanym stężeniu, 12-15 to próbki z SDS.
Tabela 5b. – Obliczenia stężeń białek w próbkach badanych przez inne grupy
,
nr
F<F/GHF L4. ,µg-8
.
próbki*
x
x
x
F<F
GHF
F<F/GHF
,µg-
,µl-
,µg/µl-
16**
0,764
1,069
0,715
4,97
10
0,50
17
0,779
1,107
0,704
4,58
20
0,23
18
0,929
1,027
0,905
11,80
40
0,30
19
0,966
1,012
0,955
13,60
60
0,23
20**
0,785
1,685
0,466
-3,98
10
-0,40
21
0,950
1,074
0,885
11,08
20
0,55
22**
1,490
0,777
1,918
48,25
40
1,21
23
1,265
0,907
1,395
29,44
60
0,49
24
0,920
1,059
0,869
10,52
13
0,81
25
0,944
1,042
0,906
11,85
13
0,91
26
0,894
1,066
0,839
9,43
13
0,73
27
0,872
1,086
0,803
8,15
13
0,63
9
gdzie:
x
M
?x
* 16-19 to próbki z lizozymem, 20-23 to próbki z albuminą wołową, 24-27 to próbki z NaCl.
** odrzucone pomiary, ponieważ ich wyniki znacznie różnią się od pozostałych w serii.
Wyznaczona ujemna wartość stężenia w próbce 20 nie na sensu chemicznego. Pomiar wykonano względem innej krzywej standardowej niż odniesiono w obliczeniach (*).
Wnioski
Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów udało się oznaczyć stężenia białek (tabela 6a.). Wyznaczono stężenia immunoglobuliny G w badanej próbce na 0,16 μg/μl.
Stężenie to jest właściwie określone ponieważ korzystano z krzywej standardowej (wykres 1.) dla immunoglobuliny G. Takie samo białko w kompleksie białko-barwnik absorbuje zależnie od swojego stężenia. Natomiast wyznaczone stężenia lizozymu i albuminy wołowej odpowiednio na 0,25 μg/μl i 0,52 μg/μl są wyznaczone niewłaściwie. Odnoszono się cały czas do krzywej standardowej (wykres 1.) dla immunoglobuliny G. Lizozym jednak słabiej oddziałuje z barwnikiem Bradford. Białko to posiada silnie naładowaną powierzchnię. Rzeczywiste
Strona 5 z 5
Sprawozdanie 7.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
Ćwiczenie 9.
Mateusz Jędrzejewski
laboratorium
grupa
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
mgr inż. Michał Jakób
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
białka metodą Bradford.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
stężenia lizozymu jest więc większe niż oznaczone. Z kolei albumina wołowa silniej oddziałuje z barwnikiem Bradford niż IgG, więc rzeczywiste jest mniejsze niż oznaczone.
Tabela 6a. – Oznaczone stężenia białek
stężenia* białka
białko
,µg/µl-
IgG
0,16
lizozym
0,25
albumina wołowa
0,52
gdzie: * to średnia arytmetyczna odpowiednich stężeń (z tabeli 5a i 5b) bez odrzuconych.
Zbadano także wpływ SDS (czynnika denaturującego) oraz NaCl (zmiana siły jonowej roztworu) na oznaczane stężenia białka metodą Bradford. Wyniki zebrano w tabeli 6b. Każda próbka miała identyczne stężenia białka, więc oznaczane stężenia również powinny być identyczne. Tak nie jest. Na oddziaływanie białko-barwnik wpływa roztwór w którym się znajdują. Denaturacja białka, przez dodanie SDS, powoduję ekspozycję grupy hydrofobowych na powierzchnię białka. Zmienia się naładowanie i zwiększa się powierzchnia oddziaływania białka z roztworem. Zgodnie z oczekiwaniami dodatek SDS powoduje zwiększenie oddziaływania białko-barwnik. Więcej barwnika jest wiązane z białkiem, a przez to oznaczane stężenie białka są zawyżone. Już niewielkie stężenie SDS (1,0% (w/v)) powoduje denaturację.
Efekt ten utrzymuje się dla użytych większych stężeń SDS.
Zwiększenie siły jonowej roztworu, przez dodanie NaCl, również zmienia oddziaływanie białko-barwnik. Efekt ten widoczny jest najbardziej dla 1,5 M NaCl. Oznaczane stężenia białka jest niższe niż rzeczywiste. Jest to spowodowane słabszym oddziaływaniem białko-barwnik.
Tabela 6b. – Oznaczone stężenia białek
oznaczone
nr
stężenie
stężenie
próbki
SDS/NaCl
białka
,µg/µl-
12
0,0 %
0,90
13
1,0 %
2,53
14
2,0 %
2,47
15
5,0 %
2,49
24
0,0 M
0,81
25
0,3 M
0,91
26
0,6 M
0,73
27
1,5 M
0,63
Ważnym aspektem (*) jest to, że wyniki absorbancji próbek dla lizozymu, albuminy wołowej oraz standardu białkowego w obecności NaCl pochodzą z innych grup. Zachowanie identyczności próbkowania oraz czasu inkubacji są mniejsze niż w obrębie serii pomiarowej dla jeden grupy. Jednak każda grupa korzystała z takiej samej instrukcji do wykonania ćwiczenia.