Określanie żywotności i proliferacji
komórek metodami
spektrofotometrycznymi
Spektrofotometria
Spektrofotometria UV-VIS oparta jest na pomiarze absorbancji
Al badanego roztworu przy określonej długości fali l (200  780
nm) zgodnie z prawem Lamberta-Beera:
Al= el x l x c
el  współczynnik absorbcji
l  grubość warstwy absorbującej
c  stężenie analitu w roztworze
Absorbancję definiujemy jako :
Al= log I0/I
I0- natężenie promieniowania padającego na ośrodek
I  natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek
detektor
Płytka 96
dołkowa
Rozdzielacz
y
ródło
światła
Monochromator
filtr
Określanie proliferacji i żywotności - test
MTT
Zasada testu: dehydrogenaza
bursztynianowa, enzym obecny w
dehydrogenaza
wewnętrznej błonie mitochondrium
redukcja
przekształca rozpuszczalną w wodzie
żółtą sól tetrazoliową - MTT (bromek-
3[4,5-dwumetylotiazylo-2-yl]-2,5-
dwufenylotetrazolu) do
nierozpuszczalnych kryształów
Przekształcenie MTT do formazanu
formazanu o barwie purpurowej.
Kryształy rozpuszcza się stosując
różnego rodzaju detergenty (np. SDS).
Intensywność zabarwienia (mierzona
spektrofotometrycznie) jest wprost
proporcjonalna do ilości żywych
komórek. W zależności od czasu
inkubacji, test MTT może służyć do
określania cytotoksyczności
substancji (24h inkubacja) lub jej
wpływu na proliferacje komórek
(96h).
Płytka 96 dołkowa z wykonanym testem MTT
Inne sole tetrazoliowe
" XTT - większa czułość,
krótszy czas inkubacji oraz
produkt rozpuszczalny w
XTT
wodzie.
" WSTs (Water soluble
Tetrazolium salts) 
Wykorzystując transport
elektronów związany z
NAD(P)H i 1-metoksy PMS
dochodzi do redukcji WST
na zewnątrz komórki
(większa czułość, produkt
rozpuszczalny w wodzie).
Stopień uszkodzenia błon komórkowych -
test LDH
Test pozwala ocenić
cytotoksyczność związku.
Badanie opiera się na pomiarze
aktywności dehydrogenazy
mleczanowej (LDH) uwalnianej do
środowiska na skutek uszkodzenia
błony komórkowej przez badaną
substancje. LDH przekształca
mleczan do pirogronianu, czemu
towarzyszy redukcja NAD+ do
NADH. Następnie diaforaza
redukuje przy udziale NADH sól
tetrazoliową (żółta) do formazanu
(purpurowy). Intensywność
barwy, mierzona
spektrofotometrycznie jest
proporcjonalna do ilości
uwolnionego LDH, a więc jest
miarą cytotoksyczności badanego
związku.
Neutral Red (NR)
Wychwyt czerwieni obojętnej
polega na pobieraniu barwnika
(Neutral Red/Toluylene Red/Basic
Red 5) przez żywe komórki i
gromadzeniu go w lizosomach (słaby
kation, pH lizosomów < pH
cytoplazmy, co umożliwia NR
wiązanie się miejscami anionowymi
do macierzy lizosomalnej. Zazwyczaj
3 godzinna inkubacja z roztworem
NR). Następnie komórki utrwala się,
lizuje i uwalnia barwnik. Komórki
martwe lub uszkodzone nie pobierają
NR. Ilość pochłoniętego barwnika jest
więc wprost proporcjonalna do ilości
żywych komórek co umożliwia
przeprowadzenie pomiaru metodami
spektrofotometrycznymi i określenie
cytotoksyczności badanego związku.
Immunoenzymatyczny test BrdU
Polega na wykrywaniu przy
pomocy przeciwciał
monoklonalnych znakowanych
enzymem (test ELISA) analogu
tyminy - BrdU (5-bromo-2-
deoksyurydyny), która
wbudowuje się do nowo
syntezowanych nici DNA. Po
BrdU
denaturacji dsDNA, stosuje się
przeciwciała anty-BrdU
znakowane np. peroksydazą
chrzanową, która przekształca
bezbarwny substrat
tetrametylbenzydyne (TMB) w
barwny produkt (żółty, po
zatrzymaniu reakcji kwasem
siarkowym - niebieski).
Intensywność zabarwienia jest
proporcjonalna do poziomu
syntezy DNA i liczby dzielących się
komórek.
Elementy testu BrdU