Politechnika WrocÅ‚awska Strona 1 z 5 Sprawozdanie 3. WydziaÅ‚ Chemiczny Data zajęć: 2008/11/07 Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV Ćwiczenie 3. laboratorium Anna Dawiec Preparacja aldolazy z mięśni królika mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz JÄ™drzejewski wedÅ‚ug metody Taylora i wsp. PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ› Ćwiczenie 3. WstÄ™p Preparacja biaÅ‚ek polega na izolowaniu danego biaÅ‚ka z próbki biologicznej. Dobrze dobrana metoda pozwala na uzyskanie czystego biaÅ‚ka do dalszych badaÅ„. Taylor i współpracownicy opracowali metodÄ™ preparacji aldolazy z mięśni królika. Jak każda preparacja jest wieloetapowa (Rysunek 1.). SkÅ‚ada siÄ™ zasadniczo z: dwóch wysalaÅ„ (50% i 52% wysyconym roztworem siarczanu amonu), dwóch wirowaÅ„ oraz koÅ„cowej krystalizacji. Za każdym razem osad siÄ™ odrzuca. Metoda jest dość prosta i krótka, jednak maÅ‚o specyficzna. rozmrożenie krystalizacja i homogenizacja wirowanie wirowanie i rekrystalizacje ekstrakcja wysalanie (50%) wysalanie (52%) supernatantu supernatantu Rysunek 1. Etapy preparacji aldolazy metodÄ… Taylora i wsp. Wydajność (masowa) preparacji aldolazy jest stosunkiem masy aldolazy w danym przesÄ…czu do teoretycznej masy caÅ‚kowitej izolowanej aldolazy w próbce. Najczęściej wydajność preparacji wyraża siÄ™ w procentach. ZaÅ‚ożono, że w przesÄ…czu pierwszym masa aldolazy jest równa masie aldolazy zawartej w mięśniach (czyli 100%), wówczas wyraża wzór (1). przesÄ…czu AktprzesÄ…czu 1 spec ald · 100% · 100% (1) calÅ‚kowita AktprzesÄ…czu 2 ald spec Ćwiczenie 3. Cel Izolacja aldolazy z mięśni królika. Ćwiczenie 3. Wykonanie Rozmrożono, a nastÄ™pnie pokrojono i zmielono rozmrożone mięśnie królika. Zhomogenizowano w 100 ml wody dejonizowanej w zlewce. Ekstrahowano biaÅ‚ka mieszajÄ…c bagietkÄ… przez 10 min w Å‚azni lodowej. Przelano mieszaninÄ™ do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min, 15 min, 2-4°C). Supernatant przelano do czystej, schÅ‚odzonej zlewki przez lejek z watÄ… szklanÄ…. Pobrano 0,5 ml mieszaniny do oznaczenia aktywnoÅ›ci aldolazy w przesÄ…czu 1. PostÄ™powano zgodnie z Ćwiczeniem 1. Zanotowano objÄ™tość pozostaÅ‚ej mieszaniny. Pod wyciÄ…giem miareczkowano mieszaninÄ™ 5% roztworem amoniaku do pH 7,5. Zanotowano objÄ™tość dodanego amoniaku. Wysalano biaÅ‚ka dodajÄ…c maÅ‚ymi porcjami 97,5 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu przygotowanego w Ćwiczeniu 2. przez 5 min. ZlewkÄ™ trzymano w Å‚azni lodowej, zawartość mieszano bagietkÄ… przez kolejne 15 min. Sprawdzano pH mieszaniny. Przelano mieszaninÄ™ do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min, 25 min, 2-4°C). Supernatant przelano do czystej, schÅ‚odzonej zlewki. Pobrano 0,5 ml mieszaniny do oznaczenia aktywnoÅ›ci aldolazy w przesÄ…czu 2. PostÄ™powano zgodnie z Ćwiczeniem 1. Zanotowano objÄ™tość pozostaÅ‚ej mieszaniny. Wysalano biaÅ‚ka dodajÄ…c maÅ‚ymi porcjami 7,9 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu przygotowanego w Ćwiczeniu 2. przez 10 min. ZlewkÄ™ trzymano w Å‚azni lodowej, zawartość mieszanÄ… bagietkÄ…. Sprawdzano pH mieszaniny. OtrzymanÄ… mieszaninÄ™ przelano do kolby stożkowej i pozostawiono w temperaturze 5°C na tydzieÅ„ do krystalizacji. Politechnika WrocÅ‚awska Strona 2 z 5 Sprawozdanie 3. WydziaÅ‚ Chemiczny Data zajęć: 2008/11/07 Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV Ćwiczenie 3. laboratorium Anna Dawiec Preparacja aldolazy z mięśni królika mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz JÄ™drzejewski wedÅ‚ug metody Taylora i wsp. PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ› Ćwiczenie 3. Wyniki Tabela 1. ObjÄ™toÅ›ci roztworów przesÄ…cz 1 NH SO przesÄ…cz 2 NH SO ml ml ml ml 95,0* 97,5** 190,0* 7,9*** gdzie: * zmierzona objÄ™tość ** miareczkowano do pH 7,5 dodajÄ…c 25 kropli 5% roztworu amoniaku (1 kropla to ok. 100 źl) 25 kropli 2,5 ml NH ·H O NH SO przesÄ…cz 1 NH ·H O *** objÄ™tość nasyconego roztworu siarczanu amonu, aby uzyskać 52% stopieÅ„ wysycenia: 100% · 50% · przesÄ…cz 2 52% · przesÄ…cz 2 NH SO NH SO NH SO przesÄ…cz 2 Tabela 2. Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych przesÄ…cz 1 przesÄ…cz 2 uwagi 100 - µl odczyt 0,6854 0,3197 ze spektrofotometru biaÅ‚ek biaÅ‚ek , % 0,753 0,351 · mg/ml 100 - µl Akt ald Akt ald · Akt ald 0,8244 0,4392 U/ml odczyt z wykresu 1. 0,275 0,14 odczyt z wykresu 1. 0,65 0,34 " /" " 0,125 0,0667 1/min " 3 min biaÅ‚ek biaÅ‚ek 0,04183 0,0195 biaÅ‚ek mg/ml /" Akt ald Akt ald · 10 0,0458 0,0244 · U/ml Akt tot Akt tot Akt ald · 0,0824 0,0439 U Akt ald Akt spec Akt spec 1,095 1,251 biaÅ‚ek U/mg gdzie: dÅ‚ugość drogi optycznej (szerokość kuwety): 1 cm , % ml masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 0,91 mg·cm 1 molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): 2730 M·cm objÄ™tość: 1,5 ml 200 µl 100 µl 1800 µl 1,8 ml µl rozcieÅ„czenie: 18 µl Politechnika WrocÅ‚awska Strona 3 z 5 Sprawozdanie 3. WydziaÅ‚ Chemiczny Data zajęć: 2008/11/07 Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV Ćwiczenie 3. laboratorium Anna Dawiec Preparacja aldolazy z mięśni królika mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz JÄ™drzejewski wedÅ‚ug metody Taylora i wsp. PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ› Tabela 3. Obliczenia dla pobranych próbek przesÄ…czu przesÄ…cz 1 przesÄ…cz 2 uwagi · · · biaÅ‚ek biaÅ‚ek biaÅ‚ek biaÅ‚ek 23,3 10,9 mg/ml Akt ald Akt ald · · Akt ald · Akt ald 25,6 13,6 U/ml Akt tot Akt tot Akt ald · przesÄ…cz 2,43 " 103 2,58 " 103 U Akt ald · ·Akt ald Akt spec Akt spec Akt spec 1,095 1,251 · · biaÅ‚ek biaÅ‚ek U/mg caÅ‚kowita masa biaÅ‚ek biaÅ‚ek 2,21 2,07 g · przesÄ…cz biaÅ‚ek biaÅ‚ek zgodnie ze wzorem (1) 100 87,5 % gdzie: objÄ™tość: 3000 µl 100 µl 3100 µl 3,1 ml µl rozcieÅ„czenie: 31 µl Ćwiczenie 3. Wnioski Wysalanie biaÅ‚ek przeprowadzano przez powolne dodawanie nasyconego roztworu siarczanu amonu oraz intensywne mieszanie w celu unikniÄ™cia miejscowego przesycenia roztworu. Stężenie biaÅ‚ek w przesÄ…czu 2 jest mniejsze niż w przesÄ…czu 1. Kontrolowano ważne parametry podczas preparacji takie jest temperatura i pH. Gdy wysalano to pH mieszaniny z aldolazÄ… utrzymywaÅ‚o siÄ™ w przedziale 7-7,5. Nie trzeba dodawać byÅ‚o amoniaku w celu alkalizacji odczynu roztworu. WyznaczajÄ…c szybkość zmiany absorbancji na wykresie 1. dla przesÄ…czu 2. poprowadzono stycznÄ… do wykresu pomijajÄ…c poczÄ…tkowÄ… zmianÄ™ absorbancji, która miaÅ‚a charakter nieliniowy, w celu lepszego oszacowania faktycznej szybkoÅ›ci zmiany absorbancji. Aktywność specyficzna aldolazy w przesÄ…czu 1 wynosi 1,095 U/mg natomiast w przesÄ…czu 2 wynosi 1,251 U/mg. Im wyższa aktywność specyficzna tym wyizolowana aldolaza aktywniejsza ( czystsza ). W Ćwiczeniu 1. z dnia 2008/10/17 aktywność specyficzna aldolazy z mięśni królika wynosiÅ‚a 7,58 U/mg. Jest to znaczÄ…ca różnica. Może wynikać ona z jakoÅ›ci użytego miÄ™sa, ale przede wszystkim z wybranej lepszej metody preparacji. Aktywność totalna w kolejnych preparacjach powinna maleć, natomiast aktywność specyficzna powinna rosnÄ…c. Uzyskano wydajność preparacji wynoszÄ…cÄ… 87,5% dla przesÄ…czu 2. Politechnika WrocÅ‚awska Strona 4 z 5 Sprawozdanie 3. WydziaÅ‚ Chemiczny Data zajęć: 2008/11/07 Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV Ćwiczenie 1. laboratorium Anna Dawiec Zapoznanie siÄ™ z metodÄ… okreÅ›lania aktywnoÅ›ci mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz JÄ™drzejewski aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrazynowy. PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ› Zmiany stężeÅ„ biaÅ‚ek i aktywnoÅ›ci aldolazy przy preparacji aldolazy w Ćwiczeniu 3. badano spektrofotometrycznie tak jak w Ćwiczeniu 1. Ćwiczenie 1. WstÄ™p Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. WystÄ™pujÄ… w różnych izoformach. Izolowane sÄ… z tkanki mięśniowej, wÄ…troby i mózgu. BiorÄ… udziaÅ‚ w jeden z reakcji glikolizy oraz glikoneogenezy. KatalizujÄ… reakcjÄ™ rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.). 2- 2- CH2OPO3 CH2OPO3 C O C O H O aldolaza C HO C H H C OH + H C OH H C OH H 2- CH2OPO3 C OH CH2OPO2- 3 fruktozo-1,6-disfosforan fosfodihydroksyaceton aldehyd 3-fosfoglicerynowy Reakcja 1. Reakcja katalizowana przez aldolazÄ™ Stężenia enzymu można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm oraz stosujÄ…c prawo Lamberta-Beera (2), gdzie to współczynnik ekstynkcji, a to dÅ‚ugość drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla maÅ‚ych stężeÅ„. · · (2) Aktywność enzymu wyznacza siÄ™ poprzez zmianÄ™ stężenia (poprzez zmianÄ™ absorbancji) w czasie szybkość zmiany stężenia. JednostkÄ™ aktywnoÅ›ci U definiuje siÄ™ zgodnie ze wzorem (3). µmol substratu U (3) min Test hydrazynowy sÅ‚uży do wyznaczania aktywnoÅ›ci aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm. W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny w stosunku 1:1. Stężenia i aktywnoÅ›ci aldolazowe sÄ… proporcjonalne do rozcieÅ„czenia (4). (4) Ćwiczenie 1. Cel Wyznaczenie stężenia aldolazy oraz oznaczenie jej aktywnoÅ›ci testem hydrazynowym. Politechnika WrocÅ‚awska Strona 5 z 5 Sprawozdanie 3. WydziaÅ‚ Chemiczny Data zajęć: 2008/11/07 Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV Ćwiczenie 1. laboratorium Anna Dawiec Zapoznanie siÄ™ z metodÄ… okreÅ›lania aktywnoÅ›ci mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz JÄ™drzejewski aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrazynowy. PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ› Ćwiczenie 1. Wykonanie W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 100 źl roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). OdnoÅ›nik sporzÄ…dzono używajÄ…c samego buforu. Zmierzono absorbancjÄ™ wzglÄ™dem odnoÅ›nika przy 280 nm. W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartym w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 źl 30 mM fruktozodifosforanu. OdnoÅ›nik sporzÄ…dzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr wzglÄ™dem odnoÅ›nika. Dodano 100 źl roztworu aldolazy z części I, natomiast do odnoÅ›nika dodano takÄ… samÄ… objÄ™tość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmierzono absorbancjÄ™ wzglÄ™dem odnoÅ›nika przy 240 nm przez 3 minuty. Ćwiczenie 1. Wyniki Wyniki umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wyniki. Ćwiczenie 1. Wnioski Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wnioski. ZaÅ‚Ä…czniki 1. Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch preparacji (Wykres 1.). 2. Instrukcja Ćwiczenie 1. wraz z bieżącymi obliczeniami. 3. Instrukcja Ćwiczenie 3. wraz z bieżącymi obliczeniami.