GLIKOGEN
Glikogen jest polimerem zbudowanym z cząsteczek glukozy połączonych głównie wiązaniem α-1,4-glikozydowym. W niektórych miejscach mogą powstawać rozgałęzienia, a cząsteczki połączone są wiązaniami α-1,6-glikozydowymi. Łańcuchy i rozgałęzienia są dłuższe niż na rysunku. Glukoza magazynowana jest w postaci glikogenu w wątrobie i komórkach mięśni.
Katabolizm glikogenu
Fosforylaza glikogenowa katalizuje odszczepienie kolejnych reszt glukozowych od jednego z końców łańcucha α-1,4-glikozydowego, uwalniając jako produkt reakcji glukozo-1-fosforan.
glikogen (n reszt) + Pi → glikogen (n-1 reszt) + glukozo-1-fosforan
Ta reakcja fosforolizy może być porównywana do rozszczepienia wody podczas hydrolizy: Hydroliza: R-O-R' + HOH → R-OH + R'-OH
Fosforoliza: R-O-R' + HO-PO 2-
2-
3 → R-OH + R'-O-PO3
Fosforan pirydoksyny (PLP), pochodna witaminy B6, służy jako grupa prostetyczna dla fosforylazy glikogenowej.
Fosforan pirydoksyny jest utrzymywany w centrum aktywnym fosforylazy z udziałem wiązania wodorowego, poprzez reakcję grupy aldehydowej PLP z grupą aminową łańcucha bocznego lizyny.
Reszta fosforanowa Pi łączy się z fosforanem PLP i tlenem glikozydowym w wiązaniu skrajnej reszty glukozowej w glikogenie.
Po tym jak fosforan przekazuje proton podczas rozszczepienia wiązania glikozydowego, otrzymuje proton z reszty fosforanowej PLP. PLP następnie odbiera proton, kiedy tlen z fosforanu atakuje węgiel C1 rozszczepiając glukozę i tworząc glukozo-1-fosforan.
Fosforylaza glikogenowa jest enzymem homodimerycznym podległym kontroli allosterycznej, wykazuje przemianę pomiędzy konformacją „zrelaksowaną” (aktywną), a
„napiętą” (inhibowaną).
Analog glukozy, N-acetyloglukozoamina (GlcNAc), jest obecna w centrum aktywnym struktury krystalicznej.
Klasa leków wynalezionych do leczenia hiperglikemii u cukrzyków (chloroindolo-karboksamidy) inhibuje wątrobową fosforylazę glikogenową allosterycznie. Te inhibitory wiążą się na powierzchni dimeru, stabilizując konformację nieaktywną (napiętą).
Miejsce wiążące glikogen na powierzchni enzymu fosforylazy przyłącza cząsteczkę glikogenu. Odległość pomiędzy miejscem wiązania glikogenu, a miejscem aktywnym, w którym fosforylaza rozszczepia wiązanie α-1,4-glikozydowe jest ograniczone do 4 reszt od rozgałęzienia α-1,6. Jest to tzw. "ograniczenie rozgałęzienia".
Enzym hydrolizujący rozgałęzienia zawiera dwa niezależne miejsca aktywne, znajdujące się w różnych segmentach pojedynczego łańcucha polipeptydowego, które katalizują reakcje α-
1,6-glukozydazy i transferazy (transglikozylazy).
Transferaza enzymu hydrolizującego rozgałęzienia przenosi trzy reszty glukozy z 4-reszt rozgałęzienia na koniec kolejnego rozgałęzienia, zmniejszając „limit rozgałęzienia”
pojedynczej reszty glukozowej.
Następnie α-1,6-glukozydaza katalizuje hydrolizę wiązania α-1,6, uwalniając cząsteczkę glukozy. Jest to mniejsza frakcja glukozy uwalniana z glikogenu. Głównym produktem rozpadu glikogenu jest glukozo-1-fosforan, powstający w wyniku aktywności fosforylazy.
Włączenie glukozo-1-fosforanu do innych cykli:
Fosfoglukomutaza katalizuje odwracalną reakcję:
Glukozo-1-fosforan → Glukozo-6-fosforan
Glukozo-6-fosforan może wejść w cykl glikolizy lub (głównie w wątrobie) zostać defosforylowany i uwolniony do krwi.
Enzym wątrobowy Glukozo-6-fosfataza katalizuje reakcję, odpowiadającą za będącą podstawową rolę wątroby jako organu utrzymującego poziom glukozy we krwi:
Glukozo-6-fosforan + H2O → glukoza + Pi
Większość innych tkanek nie posiada tego enzymu.
Synteza glikogenu
Urydyno difosforan glukozy (UDP-glukoza) jest pośrednim prekursorem do syntezy glikogenu. W momencie kiedy reszty glukozowe są dodawane do glikogenu, UDP-glukoza jest substratem, a UDP jest uwalniany jako produkt reakcji. Nukleotydy difosforanów cukrów są prekursorami również dla syntezy innych złożonych węglowodanów, w tym
oligosacharydowych łańcuchów protein, itp. UDP-glukoza jest tworzona z Glukozo-1-fosforanu i urydyno trójfosforanu (UTP), zgodnie z reakcją:
Rozerwanie PPi jest jedynym energochłonnym etapem podczas syntezy glikogenu (jedno wiązanie fosforanowe na cząsteczkę glukozy)
Glikogenina inicjuje proces syntezy glikogenu.
Glikogenina jest enzymem który katalizuje przyłączenie cząsteczki glukozy do jednej z reszt tyrozynowych enzymu. Glikogenina jest dimerem, a badania wskazują na fakt, że dwie podjednostki enzymu glikozylują się nawzajem.
Wiązanie glikozydowe jest tworzone pomiedzy anomerycznym węglem C1 reszty glukozowej pochodzącej z UDP-glukozy i hydroksylowym tlenem tyrozyny bocznego łańcucha glikogeniny.
Następnie glikogenina katalizuje glikozylację węgla C4 przyłączonej glukozy, z cząsteczką UDP-glukozy będącą donorem glukozy. Produkt jest dwucukrem z wiązaniem α-1,4-glikozydowym. Proces ten powtarzany jest do momentu powstania na glikogeninie krótkołańcuchowego, liniowego polimeru glukozy z wiązaniem α-1,4.
Syntaza glikogenowa katalizuje wydłużanie łańcucha glikogenu, poprzez przeniesienie reszty glukozowej z UDP-glukozy do hydroksylowego węgla C4 końcowej reszty łańcucha glikogenu i utworzenie wiązania α-1,4:
glikogen (n reszty) + UDP-glukoza → glikogen (n +1 reszta) + UDP
Enzymy rozgałęziające przenoszą fragment łańcucha z końca gllikogenu na grupę hydroksylową węgla C6 reszty glukozy znajdującej się w glikogenie dzięki czemu powstają wiązania α-1,6.
Izolowanie glikogenu z wątroby - metoda Osterna
Wykonanie:
•
Wątrobę (10 g) pociąć za pomocą nożyczek na drobne kawałki, umieścić w
suchej „moczówce”, dodać cylindrem 40 ml 5 % kwasu
trójchlorooctowego i ostrożnie homogenizować przez 3 minuty
•
Odstawić na 10 minut do osadzenia,
•
Ciecz znad osadu przesączyć na dużym szklanym lejku do szklanego cylindra
miarowego przez duży sączek bibułowy
•
Do pozostałego osadu dodać 30 ml 5 % kwasu trójchlorooctowego i ponownie
homogenizować przez 1 minutę
•
Odstawić na 10 minut do osadzenia,
•
Ciecz znad osadu przesączyć na dużym szklanym lejku do szklanego cylindra
miarowego (sączyć do przesączu po I sączeniu) przez duży sączek
bibułowy
•
Do pozostałego osadu dodać 30 ml 5 % kwasu trójchlorooctowego i ponownie
homogenizować przez 1 minutę
•
Odstawić na 10 minut do osadzenia,
•
Ciecz znad osadu przesączyć na dużym szklanym lejku do szklanego cylindra
miarowego (sączyć do przesączu po I i II sączeniu) przez duży sączek
bibułowy
•
Całość przesączu dodać do moczówki i dokładnie wymieszaj.
1 ml filtratu odpipetuj do plastikowej probówki wirówkowej (z korkiem)
•
Dodaj 5 ml 96% etanolu
•
Umieść w lodówce
Wytracony glikogen po odsączeniu będzie wykorzystany w kolejnych ćwiczeniach.
Oznaczanie ilości glikogenu metodą antronową
Odczynnik antronowy:
Roztwór zawierający 0.05% antronu, 1% tiomocznika i 72% H2SO4. Na każdy litr reagentu, umieść 280 ml wody destylowanej, ostrożnie dodaj 720 ml stężonego H2SO4. Umieść w kolbce 500 mg czystego antronu, 10 mg tiomocznika i 1 litr 72% H2SO4. Podgrzewaj mieszaninę do 80-90C, co pewien czas mieszając. Nie przegrzewaj mieszaniny. Schłódź i przechowywuj w lodówce. Odczynnik może być przetrzymywany w takich warunkach do 2
tygodni.
Standard glukozy
a) stock solution – rozpuść 100 mg suchej, czystej glukozy w 100 ml nasyconego roztworu kwasu benzoesowego. B) working standard – umieść 5 ml stock solution w 100 ml kolbie miarowej i dopełnij do kreski nasyconym roztworem kwasu benzoesowego. 2 ml tego
roztworu zawierające 0.1 mg glukozy używane jest jako standard.
• Wytrącony glikogen wirować przy 3000 rpm przez 15 minut.
• Klarowny płyn znad osadu delikatnie zdekantować, a naczynka wirówkowe pozostaw na 10 minut w odwróconej pozycji do obsuszenia.
• Rozpuść glikogen w 2 ml wody destylowanej (woda powinna być dodawana w ten
sposób, aby swobodnie spływać, popłukując ścianki naczynka).
• Jeżeli glikogen nie rozpuścił się w całości, wstrząsaj naczynkiem aż płyn stanie się klarowny.
• Próba ślepa przygotowywana jest poprzez odpipetowanie 2 ml wody destylowanej do czystego naczynka wirówkowego.
• Do każdej próbówki dodaj 10 ml odczynnika antronowego silnym strumieniem.
Strumień antronu powinien być skierowany do środka probówki i powinien zapewnić
dobre mieszanie.
• Zatkaj probówki koreczkami i umieść w łaźni wodnej z wodą kranową na około 5
minut.
• Przenieś probówki do wrzącej łaźni wodnej (poziom wody powinien przykrywać
poziom płynu w probówce) i inkubuj przez 15 minut.
• Schłodź wodą wodociągową do temperatury pokojowej.
• Przenieś zawartość probówek do kuwety spektrofotometrycznej i dokonaj pomiaru
przy 620 nm, używając ślepej próby jako blank.
• Ilość glikogenu oblicz z równania:
DU
1
,
0 ⋅
M =
⋅
V ⋅100 ⋅ 9.
0
DS
m
M – masa glikogenu [mg/100 g tkanki]
DU – absorpcja nieznanej próbki
DS – absorpcja standardu
0.1 – mg glukozy w 2ml roztworu standardowego
V – objętość filtratu
m – masa odważonej wątroby
0.9 – współczynnik konwersji glukozy do glikogenu