L A B O R A T O R I U M 1 0 / 2 0 0 9 LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE
|
Zakażenia mikrobiologiczne
Nowoczesne metody ich wykrywania
w przemyśle spożywczym
STRESZCZENIE Mikroorganizmy urowce żywnościowe stanowią dosko- cach, produktach oraz na poszczególnych
mogą zanieczyszczać żywność w różny nałe środowisko do rozwoju różnych etapach produkcji.
sposób, zależny od pochodzenia Sgrup drobnoustrojów, które mogą Wiele przedsiębiorstw zajmujących się
żywności oraz drogi zakażenia. doprowadzić do ich zniszczenia lub za- produkcją odczynników do badań labo-
Ważne jest zatem wykrycie i szybkie każenia. Na obecność drobnoustrojów ratoryjnych i molekularnych w ostatnich
zidentyfi kowanie już bardzo niewielkich istotny wpływ mają warunki klimatyczne latach poszerzyło swoją ofertę o szybkie
ilości drobnoustrojów, które mogą oraz całe środowisko zewnętrzne. Wpływ testy, gotowe podłoża hodowlane lub
przyczyniać się do zepsucia produktu lub różnych czynników zewnętrznych na ilość sprzęt laboratoryjny. Wykorzystywane
być patogenami zagrażającymi zdrowiu i jakość mikroflory na surowcach i pro- są one do badań mikrobiologicznych
lub życiu konsumentów. W artykule duktach spożywczych jest wynikiem wza- w różnych obszarach (badania wody, po-
przedstawiono szybkie testy i podłoża jemnego przenikania się różnych składo- wietrza, produktów spożywczych, leków,
hodowlane komercyjnie dostępne oraz wych otaczającego środowiska. kosmetyków i innych).
najnowsze metody biologii molekularnej Pojawienie się zanieczyszczeń mikrobio- W badaniu żywności zastosowanie
służące do identyfi kacji bakterii, logicznych w produktach żywnościowych mają szybkie testy, które pozwalają
drożdży oraz grzybów pleśniowych. powinno być przewidywalne i kontrolowa- na odczyt wyników już po 25 minutach
SA
OWA KLUCZOWE podłoża ne na każdym etapie produkcji. Zanieczysz- od pobrania próby. Nowymi, jednostop-
hodowlane, testy identyfikacyjne, czenia mogą pojawić się nagle i pochodzić niowymi testami są Singlepath L. mono
metody molekularne z różnych z
ródeł (np. drobnoustroje natu- do wykrywania i potwierdzenia Listeria
ralnie występujące na surowcach, wtórne monocytogenes w żywności i próbkach
SUMMARY Microorganisms may zanieczyszczenia i patogeny ze środowi- środowiskowych oraz Duopath Cereus
contaminate food in a variety of ways, ska zewnętrznego  zwierzęta, powietrze, Enterotoxins, wykrywający enterotoksyny
depending on the type and source gleba, woda, ludzie  oraz pochodzące wytwarzane przez Bacillus cereus w żyw-
of the food. Therefore detection and z kolejnych etapów produkcji). ności. Obie metody są porównywalne
fast identifi cation of just a small Aby zapobiec zanieczyszczeniom, na- z metodą ELISA i nie nastręczają trud-
quantity of microorganisms, which can leży stosować dobrą higienę produkcji ności w interpretacji.
spoil food or be pathogen dangerous na każdym jej etapie, a także podczas Inną możliwością służącą do badania
to consumers health or life, are important. mycia i dezynfekcji, które mają zapewnić żywności jest wykorzystanie gotowych
In this paper fast tests and substrates fizyczne usunięcie wszystkich szczątków specyficznych lub selektywnych poży-
of culture microorganisms have been przyklejonych np. do maszyn produkcyj- wek hodowlanych. Ciekawym rozwiąza-
presented, as well as new methods nych podczas produkcji żywności. Dzięki niem jest agar MMGA (agar mineralny
of molecular biology used in identifi cation temu w obrębie jednostek produkcyjnych zmodyfikowany z glutaminianem). Jest
of bacterials, yeasts and moulds. nie będzie odkładać się nadmierna liczba to pożywka namnażająca do odżywia-
KEY WORDS culture mediums, mikroorganizmów czy biofilmów. nia uszkodzonych komórek Escherichia
identifi cation kits, molecular methods coli w żywności, która w połączeniu
ZMODYFIKOWANE z podłożem agarowym Chromocult TBX
TESTY I PODA
OŻA umożliwia określanie liczby komórek przy
MIKROBIOLOGICZNE zastosowaniu metody filtrów membrano-
Tradycyjne metody identyfikacji różnych wych. Metoda jest szczególnie przydatna,
grup drobnoustrojów są zastępowane gdy obróbka żywności może prowadzić
szybkimi i nowoczesnymi metodami opar- do uszkodzenia poszukiwanych komórek,
tymi na klasycznych technikach mikro- np. w trakcie ogrzewania, liofilizacji, za-
biologicznych, analizach biochemicznych kwaszania lub innych sposobów utrwa-
oraz fizycznych. W wypadku żywności lania żywności. Ostatnio pojawiły się
dr Iwona Drożdż
dr Małgorzata Makarewicz chodzi bowiem o szybkość, dokładność pożywki do wykrywania Enterobacter saka-
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
i precyzję identyfikacji określonych zanie- zakii (Agar Chromocult dla E. sakazakii),
WYDZIAA
TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI
UNIWERSYTET ROLNICZY IM. H. KOA
A

TAJA W KRAKOWIE czyszczeń mikrobiologicznych w surow- Pseudomonas spp. (Agar CFC) czy Listeria
18
LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE L A B O R A T O R I U M 1 0 / 2 0 0 9
|
monocytogenes (Agar Chromocult wg Ottawianiego i Agostiego
dla L. monocytogenes). Pozwalają one na wykrywanie wymienio-
nych drobnoustrojów w różnych produktach żywnościowych,
np. w sproszkowanym mleku (w tym mleku dla niemowląt) czy
innych środkach spożywczych oraz w paszach.
Warto wspomnieć również o podłożach do monitoringu
czystości powietrza i powierzchni. Nowe płytki sedymentacyj-
ne do badania czystości powietrza w strefach produkcyjnych
Envirocheck Settle są sterylizowane radiacyjnie i pakowane
trójwarstwowo. Całkowicie spełniają one wymagania do użycia
w strefach czystych. Doskonale sprawdza się też próbnik gazowy
MAS 100 CG Ex, który wykorzystywany jest do badania sprę-
żonych gazów stosowanych w przemyśle spożywczym i farma-
ceutycznym pod kątem zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
Używając go, można wykorzystać standardowe szalki Petriego.
Płytki odciskowe do badania stref produkcyjnych w przemyśle
spożywczym Envirocheck Contact umożliwiają wykrycie wielu
różnych mikroorganizmów, m.in. Enterobacteriaceae, Staphylococcus
czy Salmonella. Służą one do badania powierzchni roboczych,
podłóg, ścian itp.
Oferta gotowych podłoży oraz szybkich testów do identyfika-
cji różnych grup drobnoustrojów jest bardzo szeroka i ogólnie
dostępna. Oczywiście istotną rolę w doborze technik wykrywania
mikroorganizmów, które mogą potencjalnie występować w pro-
duktach spożywczych i napojach, odgrywają czynniki ekono-
miczne. Okazuje się jednak, że zastosowanie droższych podłoży
czy testów, pozwalających na szybkie uzyskanie wyników, daje
wymierne korzyści. Przede wszystkim umożliwiają one identy-
fikację niebezpiecznych drobnoustrojów czy niepożądanych
zmian w żywności, które można wyeliminować na wczesnym
etapie bez większych strat w procesie produkcji.
METODY MOLEKULARNE
DO WYKRYWANIA DROŻDŻY
W ciągu ostatnich kilkunastu lat coraz większy nacisk kładzie się
na identyfikację i wykrywanie mikroorganizmów technikami bio-
logii molekularnej. Najszersze zastosowanie mają one w wypadku
szczepów drożdży. Techniki te są znacznie dokładniejsze i szybsze,
mniej pracochłonne i nie zależą od warunków hodowli.
Pierwsza z metod  PCR-RFLP (ang. Polymerase Chain Reac-
tion  Restriction Fragment Length Polymorphism, łańcuchowa re-
akcja polimerazy  analiza polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych)  polega na losowym restrykcyjnym trawieniu
amplifikowanych fragmentów DNA, które następnie zostają
rozdzielone za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Iden-
tyfikacji mikroorganizmów dokonuje się na podstawie porówna-
nia otrzymanych prążków, fragmentów dwóch rodzajów DNA.
Pierwszy to rybosomalne DNA, a dokładnie odcinek pomiędzy
genami kodującymi podjednostki 18S i 28S rRNA, czyli 5,8S-ITS
rDNA. W drugim wariancie wykorzystuje się DNA mitochondrial-
ne. W tym wypadku wymagana jest jedynie izolacja całkowitego
DNA, a nie izolacja mitochondriów (w gradiencie sacharozy) lub
mtDNA (w gradiencie CsCl). Użyte enzymy (HinfI, MaeIII, RsaI,
AluI, HaeIII, HpaI, MaeI, MaeII, MbolI, Sau3A) rozpoznają znacz-
nie mniej miejsc restrykcyjnych w mtDNA, dlatego otrzymane
fragmenty są dużo większe niż fragmenty zwykłego DNA.
Kolejną molekularną metodą identyfikacji drożdży jest PCR
(ang. Polymerase Chain Reaction  łańcuchowa reakcja polimerazy),
połączona z elektroforezą w żelu z gradientem temperatury (TGGE,
19
reklama
L A B O R A T O R I U M 1 0 / 2 0 0 9 LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE
|
ang. Temperature Gradient Gel Electrophoresis) fragmentów DNA). Jest to prosta metoda, zwiększyć dokładność rozdziału, stosuje
lub gradientem denaturującym (DGGE, polegająca na przypadkowej amplifikacji się zmienne pole elektryczne (PFGE, ang.
ang. Denaturing Gradient Gel Electrophore- DNA w celu scharakteryzowania gatunku Pulsed Field Gel Electrophoresis). Powstałe
sis). W obu tych metodach dokonuje się na podstawie otrzymanych produktów. prążki przedstawiają elektroforetyczny
najpierw amplifikacji fragmentów rDNA, Do amplifikacji wykorzystuje się nie- kariotyp, charakterystyczny dla danego
a następnie ich rozdziału elektroforetycz- specyficzne startery oligonukleotydo- gatunku, analogiczny do liczby i wielkości
nego w żelu poliakrylamidowym. W ten we. Otrzymane fragmenty rozdziela się jego chromosomów. Identyfikację może
sposób bada się różnice w sekwencji nu- w żelu agarozowym i porównuje otrzy- ułatwić zastosowanie sond DNA specy-
kleotydów w powielonych fragmentach, mane wzory prążków charakterystyczne ficznych dla ITS rDNA lub dla całych
które są podstawą do identyfikacji. Pierw- dla danego gatunku. chromosomów.
sza metoda pozwala rozdzielić fragmenty Kolejną techniką jest znacznie bardziej Dobrą metodą, łączącą dokładność
DNA o tej samej długości, ale różniące skomplikowana metoda AFLP (ang. Am- technik molekularnych i bezpośrednią
się sekwencją nukleotydów na podstawie plified Fragment Length Polimorphism PCR). wizualizację, jest metoda FISH (ang. Flu-
różnic w ruchliwości ze względu na czę- Jest ona oparta na przeprowadzeniu se- orescent in situ Hybridization). Wykorzystuje
ściową denaturację wzdłuż gradientu lektywnej reakcji amplifikacji PCR dla ona fluorescencyjnie wyznakowane sondy
temperatury. Temperatura, w jakiej frag- fragmentów restrykcyjnych uzyskanych skierowane na koniec 5 podjednostki 26S
ment DNA ulega denaturacji, zależy z całkowitej puli DNA. Po trawieniu dwo- rRNA specyficzne dla danego gatunku.
od proporcji i położenia nukleotydów ma różnymi enzymami restrykcyjnymi (np. Sondy będące oligonukleotydami powsta-
guanidynowych (G) i cytozynowych (C). EcoRI i MseI) do powstałych fragmentów ją na podstawie dostępnych i poznanych
W tej analizie wykorzystuje się amplifikację przyczepiane są poprzez legację cząsteczki sekwencji fragmentu 26S rRNA. A
ączą się
fragmentów 16S i 18S rDNA. W metodzie adaptorowe. Następnie przeprowadza się z komórkami drożdży z wyizolowanych
DGGE porównuje się sekwencję nukleoty- dwie reakcje amplifikacji  specyficzną kolonii. Efekt hybrydyzacji jest analizo-
dów we fragmentach kodujących domeny i niespecyficzną. Otrzymane produkty re- wany z wykorzystaniem mikroskopu flu-
D1/D2 z podjednostki 26S rDNA. Tak akcji rozdziela się na drodze elektroforezy orescencyjnego.
powstałe amplikony zostają rozdzielone w żelu poliakrylamidowym. Tak powstały
w żelu agarozowym o wzrastającym stęże- profil pozwala odróżniać gatunki, a nawet METODY MOLEKULARNE
niu czynnika denaturującego (mocznik). szczepy izolowanych drożdży. DO WYKRYWANIA BAKTERII
Pojedyncze prążki izoluje się z żelu, se- Niektóre gatunki drożdży można też Do identyfikacji bakterii technikami mo-
kwencjonuje i na tej podstawie dokonuje zidentyfikować na podstawie porówna- lekularnymi wykorzystuje się podobne
się identyfikacji szczepu. nia ich sekwencji kodującej 18S rDNA. techniki jak w wypadku drożdży. Różnią
Porównanie sekwencji genów kodują- W analizie tej dokonuje się amplifikacji się one sekwencjami docelowymi wykorzy-
cych domeny D1/D2 z podjednostki 26S z wykorzystaniem starterów P108 i M3989, stywanymi w analizie. U bakterii do tego
rDNA jest bardzo dokładną metodą, jed- elektroforezy w żelu agarozowym powsta- celu może służyć fragment kodujący 16S
nakże niepraktyczną w wypadku badania łych produktów reakcji, a następnie tra- rRNA. Jest to cząsteczka o długości ok.
dużej liczby próbek. Dlatego opracowano wienia restrykcyjnego z użyciem enzymów 1500 pz, w sekwencji której występują
metodę molekularnej identyfikacji droż- HaeIII i MspI. W ten sposób otrzymuje zarówno regiony wysoce konserwatyw-
dży MSP-PCR (micro/minisatellite-primed się profil sekwencji 18S rDNA charakte- ne (przydatne we właściwym dopasowa-
PCR), która pozwala wstępnie pogru- rystyczny dla danego gatunku. niu), jak i regiony o dużej zmienności.
pować badane próbki, a następnie prze- Kolejną metodą, którą można wykorzy- Sekwencja nukleotydów jest dostępna
prowadzić analizę 26S rDNA. Metoda stać do identyfikacji drożdży, jest SSCP w obszernych bazach danych.
opiera się na analizie profilów mikro/ (ang. Single Strand Conformation Polimor- Sekwencja kodująca podjednostkę
/minisatelitarnego DNA. Jej pierwszym phism). Polega ona na badaniu polimor- 16S-rRNA może też być wykorzystana
etapem jest reakcja PCR z wykorzysta- fizmu konformacyjnego jednoniciowego w identyfikacji metodą ARDRA (ang.
niem np. primerów M13 specyficznych DNA i służy do wykrywania mutacji. Ba- Amplified Ribosomal DNA Restriction Ana-
dla sekwencji minisatelitarnych. Następnie dany DNA jest amplifikowany klasyczną lysis). W technice tej następuje amplifika-
dokonuje się rozdziału elektroforetycz- techniką PCR, a uzyskany w tej reakcji cja wspomnianej podjednostki poprzez
nego otrzymanych produktów w żelu produkt zostaje denaturowany do jedno- reakcję PCR, a następnie trawienie jej re-
agarozowym. Tak otrzymane prążki przy- niciowego DNA, a następnie poddawany strykcyjnie przez enzymy BfaI, MseI oraz
porządkowuje się do grup na podstawie jest elektroforezie w żelu akrylamidowym AluI. Dalsza metoda identyfikacji jest
ich podobieństwa, konstruując dendrogra- w warunkach niedenaturujących. Po roz- podobna jak w przypadku drożdży.
my. W końcowym etapie przeprowadza dziale widoczne są różnice w odległości Kolejną sekwencją używaną w analizie
się analizę 26S rDNA dla danych grup pomiędzy nićmi normalnego a zmutowa- molekularnej bakterii (głównie kwasu mle-
badanych drobnoustrojów. nego DNA (wynik różnic w ruchliwości kowego) jest gen kodujący podjednostkę
Zróżnicowanie genetyczne, będące elektroforetycznej). b�-polimerazy RNA (rpoB). Znalazła ona
podstawą do identyfikacji poszczegól- Do identyfikacji drożdży można rów- zastosowanie m.in. w metodzie PCR-
nych gatunków, można też badać z wy- nież wykorzystać analizę ich chromo- -DGGE. Sekwencja ta jest lepsza do ana-
korzystaniem techniki RAPD (ang. Ran- somów. Wyizolowany chromosomalny lizy niż 16S rRNA, ponieważ występuje
dom Amplification of Polymorphic DNA DNA zostaje poddany rozdziałowi elek- w pojedynczej kopii, a nie w wielu, tak
 losowa amplifikacja polimorficznych troforetycznemu w żelu agarozowym. Aby jak geny rybosomalne. Jest to konieczne
20
LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE L A B O R A T O R I U M 1 0 / 2 0 0 9
|
w tego typu analizie, aby uniknąć błęd- sekwencja genu kodującego 18S rRNA
nych wyników. oraz genu mitochondrialnego kodującego
astosowanie
Gen rpoB może być też wykorzystany 16S rRNA z małej podjednostki ryboso-
w analizie PCR-RFLP. Zasady tej meto- malnej (SSU-rDNA). Ta druga sekwencja
Zdroższych testów
dy są takie jak w identyfikacji drożdży. składa się z bardzo konserwatywnego
pozwala wyeliminować
Do rozróżniania szczepów bakterii mogą rdzenia i dziewięciu domen o bardzo
być wykorzystane enzymy AciI, HinfI zróżnicowanej długości. Została ona
drobnoustroje na wczesnym
i MseI. W metodzie PCR-RFLP używa- wykorzystana do szybkiej identyfikacji
etapie bez większych strat
na jest także sekwencja ITS pomiędzy Penicillium exposum, gatunku często wy-
genami kodującymi podjednostki 16S w procesie produkcji. stępującego na powierzchni winogron.
i 23S rRNA. Użyta metoda to CAPS (Cleaved Ampli-
W molekularnej identyfikacji bak- fied Polymorphic Sequence).
terii wykorzystywana jest również tech- W celu identyfikacji gatunków grzybów
nika RAPD. Podobnie jak w wypadku patogenu winogron Botrytis cinerea, oraz pleśniowych potencjalnie produkujących
drożdży, polega ona na reakcji PCR innych czynników powodujących psucie mikotoksyny używane są różne techniki,
z niespecyficznymi starterami oligonu- się owoców, przede wszystkim grzybów m.in. takie jak AFLP czy SSCP. Ze względu
kleotydowymi. Pozwala ona rozróżniać zdolnych do produkcji mikotoksyn. na ich pracochłonność i długi czas wyko-
poszczególne szczepy bakterii, np. służy Jedną z metod identyfikacji gatunku nania powstała konieczność opracowania
do oznaczania szczepów z gatunku Ace- B. cinerea jest reakcja PCR, wykrywająca łatwiejszych metod. Dobrym obiektem
tobacter pasteurianus. obecność ruchomych fragmentów geno- badań filogenetycznych, a zarazem narzę-
Do rozróżnienia między szczepami mu  transpozonów: Boty (retrotranspo- dziem do identyfikacji nawet na pozio-
bakterii wykorzystywana jest także ana- zon o długości 6 kb) i Flipper (element mie szczepu, jest wspomniany wcześniej
liza całkowitego rozpuszczalnego białka klasy II, 1872 pz). Pozwala to rozróżnić fragment ITS. Reakcja PCR ze starterami
komórkowego metodą SDS-PAGE (ang. odmiany transpoza (w której są obecne) dla rejonu ITS1-5,8S-ITS2 może posłużyć
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide od odmiany vacuma. Obie odmiany do szybkiej identyfikacji głównych produ-
Gel Electrophoresis). Białka poddawane znacznie różnią się odpornością na fun- centów np. ochratoksyny w winogronach:
są działaniu detergentu anionowego gicydy. Innymi narzędziami do badania A. niger i A. carbonarius.
 SDS  który powoduje denaturację zróżnicowania genetycznego u B. cinerea
i nadaje im ładunek ujemny proporcjo- są PCR-RFLP i RAPD. PODSUMOWANIE
nalny do ich masy, a następnie wykonuje Do identyfikacji innych grzybów ple- Wszystkie przedstawione sposoby wykry-
się elektroforezę w żelu poliakrylamido- śniowych mogą być zastosowane opisa- wania drobnoustrojów w produktach spo-
wym. Dodatek SDS eliminuje różnice ne wcześniej metody, takie jak: DGGE, żywczych i napojach zostały opracowane
w ruchliwości elektroforetycznej białek TGGE oraz TTGE (ang. Temporal Tempe- dla mikroorganizmów, które w tych pro-
o tej samej masie, ale różnym ładunku rature Gradient Gel Electophoresis, która jest duktach nie powinny się znajdować lub
elektrycznym. A
ączy się on z białkiem bardzo podobna do TGGE, z tą różnicą, powinny być obecne w ściśle określonej
i nadaje mu jednolity ładunek ujemny, że gradient temperatury jest czasowy, a nie ilości. Normy i umowy międzynarodowe
dzięki czemu rozdział elektroforetyczny przestrzenny). Metody te pozwalają badać regulują ilość oraz jakość drobnoustrojów
następuje jedynie na podstawie masy. populację grzybów strzępkowych i roz- mogących występować w różnych pro-
Po przeprowadzonej elektroforezie po- różniać gatunki na podstawie drobnych duktach żywnościowych lub napojach;
równuje się badane próbki na podstawie różnic w sekwencji nukleotydów. wskazują również te, których obecność
uzyskanych profilów białkowych. Analiza molekularna grzybów strzęp- jest niepożądana. Na podstawie tych wy-
Podobnie jak przy analizie drożdży, kowych często opiera się na badaniu tycznych doskonalone są stare metody
do identyfikacji bakterii może być użyta zmienności genetycznej w rejonie ITS i opracowywane nowe do wykrywania
metoda FISH. Pozwala ona na bezpośred- położonym pomiędzy genami kodują- niepożądanej mikroflory. Zazwyczaj
nie określenie gatunku na poziomie mikro- cymi podjednostki 18S i 28S rRNA. Za- są to powszechnie znane drobnoustro-
skopowym bez wcześniejszego namnażania. wiera on, oprócz elementów zmiennych, je, o których bardzo dużo wiadomo.
Jako cel dla sond może służyć wspomnia- fragment o wysokiej konserwatywności, Niemniej jednak rozwój nowoczesnych
na wcześniej sekwencja 16S rRNA. W ten w którym obecny jest gen 5,8S rRNA. Re- metod klasycznych czy molekularnych
sposób stworzono sondy do identyfikacji gion ten został wybrany do identyfikacji pozwala na skrócenie czasu uzyskania
bakterii kwasu mlekowego. ze względu na to, że występuje w wielu wiarygodnych wyników i opracowanie
kopiach oraz że zmienność sekwencji nowych metod identyfikacji innych
METODY MOLEKULARNE ITS jest na tyle duża, aby umożliwić mikroorganizmów, które do tej pory
DO WYKRYWANIA PLEŚNI rozróżnianie nawet blisko spokrewnio- nie były badane. A wszystko to z myślą
Techniki molekularne znalazły również nych gatunków. Odbywa się to poprzez o bezpieczeństwie produkcji żywności,
zastosowanie w identyfikacji pleśni. amplifikację tej sekwencji z wykorzysta- zdrowiu konsumentów i dobrej opinii
Naukowcy skupili się na opracowaniu niem primerów skierowanych na gen producentów żywności. q�
metod rozpoznawania grzybów strzęp- 5,8S rRNA, a następnie sekwencjonowa-
kowych najważniejszych z technologicz- niu otrzymanych produktów. Do identy- Piśmiennictwo dostępne
nego punktu widzenia, np. głównego fikacji różnych pleśni używana jest także na www.laboratorium.elamed.pl.
21
Piśmiennictwo
1. Albibi A., Chen J., Lamikanra O., Banks D., Jarret R.L. Smith B.J.: RAPD
fingrerprinting Xylella fastidiosa Pierce s disease starins isolated from a vineyard in
North Florida.  FEMS Microbiol. Let. , 1998, 165, 347-352.
2. Baj J., Markiewicz Z. (red.): Biologia molekularna bakterii. Wydawnictwo Naukowe
PWN, Warszawa 2007.
3. Bartowsky E.J., Henschke P.A.: Acetic acid bacteria spoilage of bottled red wine  A
review.  Inter. J. Food Microbiol. , 2008, 125, 60-70.
4. Blasco L., Ferrer S., Pardo I.: Development of specific fluorescent oligonucleotide
probes for in situ identification of wine lactic acid bacteria.  FEMS Microbiol. Let. ,
2003, 225, 115-123.
5. Capece A., Salzano G., Romano P.: Molecular typing techniques as a tool to
differentiate non-Saccharomyces wine species.  Inter. J. Food Microbiol. , 2003, 84,
33-39.
6. Cappa F., Cocconcelli P.S.: Identification of fungi from dairy products by means of
18S rRNA analysis.  Inter. J. Food Microbiol. , 2001, 69, 157-160.
7. Cellon C., Delibes C., Duthoit F., Montel M.-C.: Ampplification of SSCP-PCR
fingerprinting to profile the yeast community in Raw milk Salers cheeses.  System.
Appl. Mikrobiol. , 2006, 29, 172-180.
8. Ciardo D.E., Sch�r G., Altwegg M., B�ttger E.C., Bosshard P.P.: Identification of
moulds in the diagnostic laboratory  an algorithm implementing molecular and
phenotypic methods.  Diag. Microbiol. Infect. Dis. , 2007, 59, 49-60.
9. Claisse O., Renouf V., Lonvaud-Funel A.: Differentiation of wine lactic acid bacteria
species based on RFLP analysis of a partial sequence of rpoB gene.  J. Microbiol.
Meth. , 2007, 69, 387-390.
10.Corsetti A., Lavermicocca P., Morea M., Baruzzi F., Tosti N., Gobbetti M.:
Phenotypic and molecular identification and clustering of lactic acid bacteria and
yeasts from wheat (species Triticum durum and Triticum aestivum) sourdoughs of
Southern Italy.  Inter. J. Food Microbiol. , 2001, 64, 95-104.
11. De�k T.: Methods for the rapid detection and identification of yeasts in food.  Trends
Food Sci. Tech. , 1995, 6, 287-292.
12. De Barros Lopes M., Rainieri S., Henschkel P.A., Langridge P.: AFLP fingerprinting
for analysis of yeast genetic variation.  Inter. J. System. Bacteriol. , 1999, 49, 915-
924.
13.Du Plessis H.W., Dicks L.M.T., Pretoriu I.S., Lambrechtsa M.G., du Toit M.:
Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines.
 Inter. J. Food Microbiol. , 2004, 91, 19-29.
14.FernaŁndez M.T., Ubeda J.F., Briones A.I.: Comparative study of non-Saccharomyces
microflora of musts in fermentation, by physiological and molecular methods.  FEMS
Microbiol. Let. , 1999, 173, 223-229.
15. Gadanho M., Almeida J., Sampaio J.P.: Assessment of yeast diversity in a marine
environment in the south of portugal by microsatellite-primed PCR.  Antonie van
Leeuwenhoek , 2003, 84, 217-227.
16. Garcia C., La Guerche S., Mouhamadou B., F�randon C., LabarŁre J., Blancard D.,
Darriet P., Barroso G.: A CAPS test allowing a rapid distinction of Penicillium
expansum among fungal species collected on grape berries, inferred from the
sequence and secondary structure of the mitochondrial SSU-rRNA.  Inter. J. Food
Microbiol. , 2006, 183-190.
17. Gonz�lez-Salgado A., Patińo B., V�zquez C., Gonz�lez-Ja�n M.T.: Discrimination of
Aspergillus niger and other Aspergillus species belonging to section Nigri by PCR
assays.  FEMS Microbiol. Let. , 2005, 245, 353-361.
18. Hern�n-G�mez S., Espinosa J.C., Ubeda J.F. Characterization of wine yeasts by
temperature gradient gel electrophoresis (TGGE).  FEMS Microbiol. Let. , 2000,
193, 45-50.
19. Herzberg M., Fischer R., Titze A.: Conflicting results obtained by RAPD-PCR and
large-subunit rDNA sequences in determining and comparing yeast strains isolated
from flowers: a comparison of two methods.  Inter. J. System. Evolution. Microbiol. ,
2002, 52, 1423-1433.
20. Malik S., Beer M., Megharaj M., Naidu R.: The use of molecular techniques to
characterize the microbial communities in contaminated soil and water.  Environ.
Inter. , 2008, 34, 265-276.
21. Muńoz G., Hinrichsen P., Brygoo Y., Giraud T.: Genetic characterization of Botrytis
cinerea populations in Chile.  Mycolog. Res. , 2002, 106, 594-601.
22. Nieguitsila A., Deville M., Jamal T., Halos L., Berthelemy M., Chermette R.,
Latouche S., Arn� P., Guillot J.: Evaluation of fungal aerosols using Temporal
Temperature Gradient Electrophoresis (TTGE) and comparison with culture.  J.
Microbiol. Meth. , 2007, 70, 86-95.
23. Patińo B., Gonz�lez-Salgado A., Gonz�lez-Ja�n M.T., V�zqueza C.: PCR detection
assays for the ochratoxin-producing Aspergillus carbonarius and Aspergillus
ochraceus species.  Inter. J. Food Microbiol. , 2005, 104, 207-214.
24. Prakitchaiwattana C.J., Fleet G.H., Heard G.M.: Application and evaluation of
denaturing gradient gel electrophoresis to analyze the yeast ecology of wine grapes.
 FEMS Yeast Res. , 2004, 4, 865-877.
25. Prieto C., Jara C., Mas A., Romero J.: Application of molecular methods for analyzing
the distribution and diversity of acetic acid bacteria in Chilean vineyards.  Inter. J.
Food Microbiol. , 2007, 115, 348 355.
26.Querol A., Ramón D.: The application of molecular techniques in wine microbiology.
 Trends in Food Sci. Tech. , 1996, 7.
27. Renouf V., Claisse O., Miot-Sertier C., Lonvaud-Funel A.: Lactic acid bacteria
evolution during winemaking: Use of rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis.
 Food Microbiol. , 2006, 23, 136-145.
28. Rodas A.M., Ferrer S., Pardo I.: 16S-ARDRA, a Tool for Identification of Lactic Acid
Bacteria Isolated from Grape Must and Wine.  System. Appl. Microbiol. , 2003, 26,
412-422.
29. Spadaro D., Sabetta W., Acquadro A., Portis E., Garibaldi A., Gullino M.L.: Use of
AFLP for differentiation of Metschnikowia pulcherrima strains for postharvest
disease biological control.  Microbiol. Res. , 2008, 163, 523-530.
30. Wang Q.-M., Li J., Wang S.-A., Bai F.-Y.: Rapid differentiation of phenotypically
similar yeast species by single-strand conformation polymorphism analysis of
ribosomal DNA.  Appl. Environ. Microbiol. , 2008, 74, 2604-2611.
31. Xufre A., Albergaria H., In�cio J., Spencer-Martins I., G�rio F.: Application of
fluorescence in situ hybridisation (FISH) to the analysis of yeast population dynamics
in winery and laboratory grape must fermentations.  Inter. J. Food Microbiol. , 2006,
108, 376-384.
32. Materiały z katalogów firm Merck, PLIVA-Lachema Diagnostika oraz BIOMAR
Diagnostyka.