Biotechnologia ogólna kierunku biologia, ochrona środowiska, biotechnologia kosmetologiczna II0
DWICZENIE 1,2 BADANIE ZDOLNOÅšDI UTLENIANIA SIARKI PRZEZ BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS
1. Charakterystyka mikroorganizmów ważnych w biogeochemii
Funkcjonowanie komórek mikroorganizmów warunkują: rodzaj z
ródła węgla, rodzaj z
ródła energii metabolicznej oraz rodzaj
donorów elektronów. W zależności od tych czynników komórki mikroorganizmów można zaliczyd do pięciu grup:
- Chemolitotrofy: czerpią energię z procesów metabolicznych, polegających na utlenieniu nieorganicznych związków i
asymilacji węgla jako CO2, HCO- lub CO2-
3 3
- Fotolitotrofy: czerpią energię z procesów polegających na przekształceniu energii promieniowania słonecznego na energię
chemiczną i asymilacji węgla jako CO2, HCO- lub CO2-
3 3
- Miksotrofy: pozyskują energię jednocześnie z utleniania związków organicznych oraz związków nieorganicznych.
- Fotoheterotrofy: uzyskują energię ze światła słonecznego, węgiel zaś z rozkładu związków organicznych.
- Heterotrofy: uzyskują energię z utleniania związków organicznych, z większośd węgla przez ich rozkład.
Do grupy bakterii chemolitotroficznych zaliczamy:
- bakterie utleniajÄ…ce amoniak:
Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosocystis, Nitrosogloea,
Nitrospira
- bakterie utleniajÄ…ce azotyny:
Nitrobacter, Nitrocystis
- bakterie utleniające jony żelaza lub manganowe:
Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfolobus, Leptothrix
- bakterie utleniające siarkowodór, siarczyny i wolną siarkę:
Thiobacillus, Beggiatoa, Thiotrix, Thioploca
- bakterie utleniające wodór:
Hydrogenomonas
2. Bioutlenianie związków siarki
W środowisku zwierającym zwiększoną ilośd zredukowanych
związków siarki można wyizolowad wiele bakterii zdolnych do ich
utleniania, należą do nich:
- Chromatium  fototroficzne bakterie siarkowe zawierajÄ…ce
chlorofil, koloru purpurowego, o wymiarach komórki
dochodzÄ…cych do 20 µm, beztlenowce,
- Chlorobium  fotoautotrofy, gram-ujemne komórki w kształcie
pałeczek, beztlenowe.
- Siderocapsa  kuliste lub pałeczkowate bakterie, komórki
gram-ujemne pokryte biofilmem o dużej zawartości żelaza i manganu,
- Galionella  bakterie żelaziste, komórki gram-ujemne,
- Beggiatoa  komórki o kształcie nitek, zawierają ziarna elementarnej siarki,
- Thiobacillus  bakterie glebowe, wodne, utleniajÄ…c siarkÄ™.
Th. denitrificans  korzysta z NO3- jako akceptora elektronów, powodując redukcje azotu azotu(V) do gazowego azotu zgodnie z
równaniem reakcji:
2NO3- + S = 4H+ = SO42- + N2 + 2H2O
Th. thioparus  wykorzystuje trio cyjaniny do wzrostu zgodnie z równaniem reakcji:
SCN- + O2 + H2O = SO4- + NH4+ + CO2
At. thiooxidans - gram-ujemne, wyodrÄ™bnione przez Waksmana i Joffa w 1922r. KsztaÅ‚t paÅ‚eczek o rozmiarach 0,5-0,8 mðm x 1-2
mðm z jednÄ… polarnÄ… spiralnÄ… rzÄ™skÄ…. SÄ… typowymi chemoautotrofami. y
ródłem energii, potrzebnej w procesie wiązania i redukcji
CO2, jest dla At. thiooxidans głównie proces utleniania siarki do kwasu siarkowego:
2 S° + 3 O2 + 2 H2O 2 H2SO4
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska
Biotechnologia ogólna kierunku biologia, ochrona środowiska, biotechnologia kosmetologiczna II0
DWICZENIE 1,2 BADANIE ZDOLNOÅšDI UTLENIANIA SIARKI PRZEZ BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS
Schemat utleniania siarki, siarczków i tiosiarczanów przez At. thiooxidans można przedstawid następująco:
Rozwój bakterii At. thiooxidans przebiega w pożywce o pH = 1,5-4,8, przy optymalnym pH = 2,5. Nie giną nawet w 2N roztworze
H2SO4. Giną natychmiast, jeżeli wilgotnośd środowiska spada poniżej 2,8%. Są organizmami silnie aerobowymi.
3. Mechanizm utleniania siarki przez bakterie At. thiooxidans
Proces ten jest stosunkowo mało poznany. Bierze w nim udział układ cytochromowy, a uwalniana energia jest magazynowana w
ATP. Powszechnie uważa się, że utlenianie siarki zachodzi w bezpośrednim kontakcie komórki bakterii z materiałem. Przez
dłuższy czas nie był wyjaśniony fakt, czy proces zachodzi wewnątrz komórki, czy poza nią. Wiadomo, że aby organizm
wykorzystał energię reakcji egzotermicznej, musi ona zachodzid wewnątrzkomórkowo, zaś siarka jest nierozpuszczalna w wodzie
i ektoenzym nie może jej rozpuścid.
Wg Piwowarskiej komórka At. thiooxidans otoczona jest trójwarstwową błoną, przez którą siarka może przenikad. W komórce
stwierdzono obecnośd ziarenek lipidowych, zlokalizowanych bezpośrednio przy błonie cytoplazmatycznej. Bakteria przylega
ściśle do drobiny siarki, która styka się bezpośrednio z ziarnem lipidowym cytoplazmy. Siarka jest rozpuszczalna w tłuszczach,
wnika więc do ziarna lipidowego, po czym utlenianie siarki następuje już wewnątrz komórki.
4. Hodowla bakterii At. thiooxidans.
Hodowlę prowadzi się w pożywce Waksmana o składzie:
(NH4)2SO4 - 0,2 g/dm3
KH2PO4 - 3,0 g/dm3
MgSO4 x 7H2O - 0,5 g/dm3
CaCl2 x 6H2O - 0,25 g/dm3
S0 - 10 g/dm3
PożywkÄ™ (bez siarki) sterylizuje siÄ™ w autoklawie w temp. 120ºC przez 20 min.
SiarkÄ™ sterylizuje siÄ™ alkoholem etylowym.
5. Wykonanie dwiczenia.
5.2. Sporządzid określoną przez prowadzącego ilośd pożywki Waksmana bez dodatku siarki, w kolbie stożkowej o objętości 250-
300 cm3.
5.3. Do dwóch sterylnych kolb o pojemności 100 cmł wlad po około 50 cmł jałowej pożywki Waksmana (otrzymanej od
prowadzącego) i dodad po około 0,5 g wysterylizowanej siarki do każdej z kolb.
(używad cylindrów miarowych !!!).
5.4. Do jednej kolby wprowadzid 1 cmł zawiesiny, aktywnej hodowli bakterii At. thiooxidans (dostarczonej przez prowadzącego).
Do drugiej kolby, zamiast zawiesiny bakterii, dodad niewielką ilośd sproszkowanego tymolu
(do pobierania bakterii używad sterylnych pipet szklanych, lub pipet jednorazowych !!).
5.5. Tak przygotowane układy badawcze zatkad korkami z waty lub ligniny (które należy wykonad).
Opisad kolby wg wzoru:
HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.
5.6. Zmierzyd wartośd pH w obydwu kolbach. Pomiar powtórzyd po około 15 minutach.
Jeżeli zachodzi taka koniecznośd należy przed pomiarem wykalibrowad pH-metr w roztworze buforowym dostarczonym
przez prowadzÄ…cego.
5.7. Po wykonaniu pomiarów, opisane kolby odstawid na miejsce wskazane przez prowadzącego.
5.8. Pomiary powtórzyd po tygodniu. Po zakooczeniu dwiczenia należy umyd używane szkło laboratoryjne.
5.9. Wyniki muszą byd podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylad zawartośd kolb i umyd je.
5.10. Opracowanie wyników (zeszyt laboratoryjny):
Wykreślid zmianę kwasowości (pH) hodowli i układu kontrolnego, metodą słupkową.
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska
Biotechnologia ogólna kierunku biologia, ochrona środowiska, biotechnologia kosmetologiczna II0
DWICZENIE 1,2 BADANIE ZDOLNOÅšDI UTLENIANIA SIARKI PRZEZ BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS
Ze zmiany kwasowości układów obliczyd ilośd wytworzonego kwasu siarkowego i ilośd siarki, która uległa utlenieniu oraz
zmianę zawartości jonów wodorowych w roztworze w czasie trwania badania.
6. Zagadnienia teoretyczne:
- Charakterystyka mikroorganizmów ważnych w biogeotechnologii
- Bakterie chemolitotroficzne
- Bioutlenianie związków siarki
- Chemosynteza i autotrofizm.
- Mechanizm utleniania siarki
- Charakterystyka At. thiooxidans
- Organizmy aerobowe.
- Kwasowośd roztworów.
- Obliczanie pH roztworów.
- Obliczanie stężenia jonów wodorowych, mając dane pH roztworów.
7. Literatura:
- Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
- Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
- Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechniki A
ódzkiej; 2000
- Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedz
 czytelnia (B.W. ul. Oleska).
- Sadowski Z., Biogeochemia  wybrane zagadnienia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005.
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska