Sprawozdanie I laboratorium Biochemia

Temat: Amfoteryczny charakter białek i aminokwasów

Data zajęć: 12.12.2013

Prowadząca: dr inż Beata Greb-Markiewicz

Wykonawcy: Aleksandra Grodek 193200, Michał Izydorczyk, Grupa IV

1.

Wstęp teoretyczny

Aminokwasy posiadają grupy aminowe zdolne do włączania protonu oraz grupy karboksylowe zdolne do oddysocjowania protonu. Dodatkowe łańcuchy boczne mogą ulegać rożniej jonizacji. W zależności od pH jednych form jonowych jest więcej, nich mniej. Punkt izoelektrycznych (pI) to pH dla ktorego aminokwas/białko posiada sumaryczny ładunek elektryczny rowny zero. Wowczas cząsteczka taka cząsteczka nie porusza się w polu elektrycznym. Precyzyjną metodą wyznaczenia pI jest izoelektroogniskowanie. Polega na przyłożeniu napięcia do płytki żelowej z naniesionym białkiem. Żel został tak przygotowany, że posiada liniowy gradient pH. Białko zatrzyma się, gdy będzie nienaładowane, czyli dokładnie w pI. Inna metodą jest wytrącanie osadow. Białko w pI posiada najmniejszą rozpuszczalność. Sporządza się serię roztworow o rożnych pH i rozpuszcza się w nich białko.

Punkt izoelektrycznych białka jest rowny pH roztworu, gdzie wytrącił się największy osad.

Jest to metoda szybsza i łatwiejsza do wykonania, jednak mniej dokłada.

2.

Cel ćwiczenia

- Wykonanie krzywych miareczkowania dwóch aminokwasów (Alaniny i Glutaminianu), określenie ich punktów izoelektrycznych, pK grup funkcyjnych i przedziałów buforowania;

- Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny.

3.

Materiały

Odczynniki:

- 1M NaOH;

- 1M HCl;

- wodne roztwory aminokwasów: 0,1 M alanina, 0,05M kwas glutaminowy;

- 1M kwas octowy;

- 0,1 M CH3COONa zawierający kazeinę w końcowym stężeniu 0,2%;

- bufory wzorcowe do kalibracji pehametru o pH 4,01; 7,01; 9,18.

Szkło i aparatura:

- probówki chemiczne na 20 ml i na 5 ml;

- pipety automatyczne oraz tipsy;

- pipety szklane;

- cylinder miarowy;

- zlewki o pojemności 50 ml;

- mieszadło magnetyczne;

- mieszadełka magnetyczne małe i duże;

- pehametr laboratoryjny z elektrodą.

4. Przebieg ćwiczenia

a)Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny:

- Przygotowano 18 suchych probówek chemicznych (duże i małe). W 9 kolejno ponumerowanych dużych probówkach przygotowano serię rozcieńczeń wg schematu: próbka nr 1: 13,6 ml H2Odest + 6,4 ml 1M CH3COOH

próbka nr 2: 5,0 ml H2Odest + 5,0 ml próbki nr 1 po dokładnym wymieszaniu próbka nr 3: 5,0 ml H2Odest + 5,0 ml próbki nr 2 po dokładnym wymieszaniu (…)

próbka nr 9: 5,0 ml H2Odest + 5,0 ml próbki nr 8 po dokładnym wymieszaniu; W próbce nr 1 i 9 wyrównano objętość do 5 ml;

- Do 9 kolejno ponumerowanych małych probówek odmierzono po około połowie pojemności probówki przygotowanych rozcieńczeń kwasu octowego;

- Zmierzono pH każdego z roztworów, umieszczając elektrodę bezpośrednio w małych probówkach, a odczytane wartości zanotowano w Tabeli 1;

- Przelano roztwory z małych probówek do dużych;

- Do każdej z dużych probówek od 1 do 9 dodano po 1 ml 0,2% roztworu kazeiny i włączono stoper;

- Delikatnie wymieszano mieszaniny, nie dopuszczając do ich spienienia;

- Zbadano wygląd prób białka zaraz po zamieszaniu i zanotowano obserwacje;

- Odstawiono próby kazeiny na 90 minut (inkubowano w temp. pokojowej);

- Po upływie 90 minut wygląd prób ponownie zbadano, a wyniki zanotowano w Tabeli 2.

b) Miareczkowanie roztworów aminokwasów - roztworu kwasu glutaminowego i roztworu alaniny:

- Do czystej zlewki o pojemności 50 ml odmierzono 40 ml roztworu kwasu glutaminowego;

- Postawiono zlewkę na mieszadle magnetycznym, umieszczono w roztworze czyste małe mieszadło magnetyczne, uruchomiono mieszanie, a następnie zanurzono w roztworze aminokwasu elektrodę opłukaną wodą destylowaną;

- Posługując się pipetą automatyczną, ostrożnie dodawano kroplami 1M HCl, pamiętając , że początkowo niewielki dodatek kwasu może spowodować zmiany pH większe niż 0,5

jednostki i niewielkich zmianach pH w zakresie buforowania ( w tych zakresach dodawano większe ilości kwasu);

- Zmiany pH roztworu zapisywano;

- Zakończono dodawanie kwasu solnego po osiągnięciu pH poniżej 2.0;

- Postępowanie powtórzono dla roztworu alaniny;

- Analogicznie przeprowadzono miareczkowania obu roztworów aminokwasów za pomocą 1M NaOH. Miareczkowania zakończono po osiągnięciu przez roztwory pH = 13.

5. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Lp

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

2,69

2,89

3,12

3,37

3,59

3,77

3,94

4,16

4,40

zmętnienie -

-

-

++

++

+++

+

-

-

osad

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Po upływie 45 minut:

Lp

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

2,69

2,89

3,12

3,37

3,59

3,77

3,94

4,16

4,40

zmętnienie -

-

-

+

++

++

-

-

-

osad

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Legenda: w wierszach „osad” i „zmętnienie” użyte symbole oznaczają odpowiednio:

- brak; + mało/słabe; ++ dużo/silne; +++ bardzo dużo/bardzo silne.

Obserwacje:

W probówkach 4,5,6,7 zaobserwowano zmętnienie (największe w probówce numer 6). Nie zaobserwowano wytrącenia się osadu w rzadnej z probówek. Po upływie 45 minut zmniejszyło się zmętnienie w probówce numer 6 i 7.

Wnioski:

Na podstawie danych z powyższych tabelek można stwierdzić, iż punkt izoelektryczny kazeiny znajduje się w przedziale pH dla 3,59-3,77, gdyż wystąpiło tam największe zmętnienie roztworów.

Wyznaczony doświadczalne punkt izoelektryczny jest niestety znacząco różny od wartości literaturowej, która wynosi 4,6. Na rozbieżność wyników mogły mieć wpływ np. niedokładności przygotowania probówek lub działanie bakterii w roztworze kazeiny.

6.

Wykonanie krzywych miareczkowania dla dwóch aminokwasów: alaniny i glutaminianu

Tabela 1. Miareczkowanie kwasu glutaminowego za pomocą HCl

Lp

pH

Vtitranta [ml]

Ntitranta/Na

0

3,57

0

0

1

3,53

0,01

0,05

2

3,50

0,03

0,015

3

3,45

0,06

0,03

4

3,38

0,11

0,04

5

3,26

0,21

0,105

6

3,04

0,41

0,205

7

2,86

0,61

0,305

8

2,72

0,81

0,405

9

2,50

1,21

0,605

10

2,32

1,61

0,805

11

2,17

2,01

1,005

12

2,10

2,21

1,105

13

2,04

2,41

1,205

14

1,99

2,61

0,71

Tabela 2. Miareczkowanie kwasu glutaminowego za pomocą NaOH

Lp

pH

Vtitranta [ml]

Ntitranta/Na

0

3,53

0

0

1

3,54

0,01

0,005

2

3,55

0,02

0,01

3

3,57

0,04

0,02

4

3,61

0,06

0,03

5

3,62

0,08

0,04

6

3,64

0,1

0,05

7

3,67

0,12

0,06

8

3,71

0,16

0,08

9

3,76

0,2

0,1

10

3,80

0,24

0,12

11

3,84

0,28

0,14

12

3,89

0,32

0,16

13

3,93

0,36

0,18

14

3,96

0,4

0,2

15

4,00

0,44

0,22

16

4,04

0,48

0,24

17

4,08

0,52

0,26

18

4,12

0,57

0,285

19

4,16

0,62

0,31

20

4,20

0,67

0,335

21

4,24

0,72

0,36

22

4,28

0,77

0,385

23

4,32

0,82

0,41

24

4,36

0,87

0,435

25

4,41

0,93

0,465

26

4,45

0,99

0,495

27

4,50

1,05

0,525

28

4,56

1,11

0,555

29

4,62

1,19

0,595

30

4,69

1,27

0,635

31

4,74

1,35

0,675

32

4,85

1,43

0,715

33

4,92

1,51

0,755

34

5,02

1,59

0,795

35

5,11

1,65

0,825

36

5,20

1,71

0,855

37

5,32

1,77

0,885

38

5,42

1,82

0,91

39

5,63

1,87

0,935

40

5,98

1,92

0,96

41

6,42

1,96

0,98

42

7,83

2

1

43

7,90

2,005

1,0025

44

8,04

2,015

1,0075

45

8,15

2,025

1,0125

46

8,22

2,035

1,0175

47

8,28

2,045

1,0225

48

8,38

2,065

1,0325

49

8,47

2,085

1,0425

50

8,57

3,005

1,5025

51

8,68

3,045

1,5225

52

8,78

3,085

1,5425

53

8,88

3,135

1,5675

54

8,97

3,185

1,5925

55

9,08

3,255

1,6275

56

9,27

3,355

1,6775

57

9,38

3,455

1,7275

58

9,51

3,605

1,8025

59

9,64

3,805

1,9025

60

9,83

4,005

2,0025

61

10,19

4,405

2,2025

62

10,97

4,805

2,4025

63

11,72

5,305

2,6525

64

11,93

5,805

2,9025

65

12,02

6,305

3,1525

Wykres 1- Kwas glutaminowy

Tabela 3- Miareczkowanie alaniny za pomocą HCl

Lp

pH

Vtitranta [ml]

Ntitranta/Na

0

6,57

0

0

1

6,18

0,01

0,0025

2

5,34

0,01

0,0025

3

5,03

0,02

0,005

4

4,7

0,03

0,0075

5

4,55

0,04

0,01

6

4,42

0,05

0,0125

7

4,33

0,06

0,015

8

4,2

0,08

0,02

9

4,1

0,1

0,025

10

3,92

0,15

0,0375

11

3,79

0,2

0,05

12

3,69

0,25

0,0625

13

3,54

0,35

0,0875

14

3,42

0,45

0,1125

15

3,1

0,85

0,2125

16

2,89

1,25

0,3125

17

2,72

1,65

0,4125

18

2,58

2,05

0,5125

19

2,39

2,65

0,6625

20

2,22

3,25

0,8125

21

2,07

3,85

0,9625

22

1,92

4,45

1,1125

Tabela 4- Miareczkowanie alaniny za pomocą NaOH

Lp

pH

Vtitranta [ml]

Ntitranta/Na

0

6,58

0

0

1

7,29

0,01

0,0025

2

7,51

0,02

0,005

3

7,67

0,02

0,005

4

7,78

0,03

0,0075

5

7,85

0,03

0,0075

6

7,95

0,04

0,01

7

8,04

0,05

0,0125

8

8,17

0,06

0,015

9

8,28

0,08

0,02

10

8,4

0,11

0,0275

11

8,54

0,16

0,04

12

8,66

0,21

0,0525

13

8,79

0,31

0,0775

14

8,91

0,41

0,1025

15

9,19

0,71

0,1775

16

9,41

1,01

0,2525

17

9,58

1,31

0,3275

18

9,81

1,81

0,4525

19

10,03

2,31

0,5775

20

10,28

2,81

0,7025

21

10,93

3,61

0,9025

22

11,84

4,41

1,1025

23

12,05

5,01

1,2525

Wykres 2- Alanina

Tabela 5- Porównanie odczytanych wartości z wartościami literaturowymi Aminokwas

Wartość odczytana

Wartość literaturowa

Alanina

pI

6,0

6,0

pK1

2,6

2,4

pK2

10,0

9,8

Kwas

pI

3,5

3,22

glutaminowy

pK1

2,0

2,2

pK2

10,0

9,7

pK3

4,0

4,3

7.

Przykładowe obliczenia

Vaa/titranta =Vtitranta – VH2O/titranta

Vtitranta- objętość titranta dodanego do roztworu aminokwasu

VH2O/titranta- objętość titranta zużyta na zmiareczkowanie wody Vaa/titranta - objętość titranta zużyta na zmiareczkowanie aminokwasu Przykładowe wyliczenie :

Vaa/titranta =Vtitranta – VH2O/titranta

Vaa/titranta =0,11-0,03=0,08 [ml]

Na wykresach miareczkowania aminokwasów przedstawiona jest zależność pH od stosunku liczności titranta przeznaczonej na zmiareczkowanie aminokwasu do liczności tego aminokwasu.

Przykładowo:

ntitranta/naa = (Vaa/titranta * Ctitranta)/(Vaa*Caa)=(0,00008*1)/(0,04*0,05)=0,02

Wartości pK poszczególnych grup zostały odczytane z wykresu [i zestawione w tabeli 4.], natomiast wartości pI zostały wyliczone za pomocą wzorów:

pI alaniny= (pK1+ pK2)/2 = (2,6 + 10,0)/2 = 6,3

pI kwasu glutaminowego = (pK1 + pK3)/2 = (2,0 + 4,0)/2 = 3,0

Wnioski:

Na podstawie uzyskanych wyników możemy stwierdzić, że cel ćwiczenia został osiągnięty.

Otrzymane wartości pK dla alaniny i kwasu glutaminowego są zbliżone do wartości teoretycznych.

Wyniki potwierdziły właściwości amfoteryczne i buforujące aminokwasów.