Mikrobiologia jamy ustnej – treść ćwiczeń

Ćwiczenie 1. Mikrobiologia ogólna - Budowa komórki bakteryjnej. Meto-

dy barwienia preparatów bakteryjnych. Pożywki bakteryjne. Techniki

posiewów. Uzyskiwanie czystej hodowli.

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – kształty i budowa ko-

mórek bakteryjnych (elementy stałe i dodatkowe), metody barwienia prepara-

tów bakteryjnych (proste i złożone, pozytywne i negatywne, pozytywno-

negatywne), rodzaje mikroskopów używanych w bakteriologii i ich zastoso-

wanie. Fizjologia bakterii, postacie i skład pożywek bakteryjnych (płynne,

półpłynne i stałe, proste i wzbogacone, wybiórcze, diagnostyczne i wybiórczo-

diagnostyczne), techniki wykonywania posiewów, optymalne warunki dla ho-

dowania bakterii in vitro (temperatura, środowisko gazowe, pH, ciśnienie

osmotyczne), fazy wzrostu hodowli bakteryjnej, metoda uzyskiwania czystej

hodowli.

Część praktyczna

1. Demonstracja preparatów bakteryjnych barwionych metodą negatywną

ukazujących kształty komórek bakteryjnych.

a/ Komórki cylindryczne.

b/ Komórki kuliste.

2. Demonstracja preparatów bakteryjnych ukazujących obecność otoczki.

a/ Preparat barwiony metodą pozytywno-negatywną.

b/ Preparat z tkanki zakażonej bakteriami posiadającymi otoczki.

3. Demonstracja preparatów bakteryjnych ukazujących obecność prze-

trwalników.

a/ Preparat barwiony metodą Grama.

b/ Preparat barwiony zielenią malachitową.

4. Demonstracja preparatu bakteryjnego ukazującego rzęski.

5. Barwienie preparatów bakteryjnych metodą Grama.

a/ Omówienie i demonstracja wykonywania preparatów bakteryjnych z

hodowli na pożywce płynnej i stałej.

b/ Omówienie i demonstracja barwienia preparatu bakteryjnego meto-

dą Grama.

c/ Omówienie i demonstracja pracy z mikroskopem świetlnym przy

oglądaniu preparatów bakteryjnych.

6. Demonstracja podstawowych pożywek bakteryjnych.

a/ Proste - woda peptonowa, bulion, agar zwykły.

b/ Wzbogacone - bulion z glukozą, agar z krwią, pożywka Loefflera, po-

żywka Loewensteina-Jensena.

7. Demonstracja wzrostu bakterii na pożywkach.

a/ Wzrost bakterii na pożywkach płynnych (kożuszek, zmętnienie,

osad).

b/ Wzrost bakterii na pożywce stałej (trzy różne rodzaje kolonii).

c/ Wzrost szczepów barwnikotwórczych (zabarwione kolonie, zabar-

wiona pożywka wokół kolonii).

Do wykonania

1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych.

2. Wykonanie preparatu bakteryjnego z wybranej kolonii, zabarwienie go

metodą Grama i przerysowanie.

3. Posiew redukcyjny mieszanej hodowli płynnej na pożywkę agarową.

Ćwiczenie 2. Mikrobiologia ogólna – Występowanie bakterii w środowi-

sku człowieka i w jego organizmie. Wpływ czynników fizycznych i che-

micznych na bakterie.

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Występowanie bakterii

w środowisku człowieka (rezerwuar zarazka, drogi jego rozprzestrzeniania

się, źródło zakażenia). Występowanie bakterii w organizmie człowieka (stała i

przejściowa flora bakteryjna, nosicielstwo bakterii chorobotwórczych). Wpływ

czynników fizycznych i chemicznych na bakterie. Kontrola bakteriologiczna

środowiska człowieka (sanityzacja, antyseptyka, aseptyka, odkażanie, wyja-

ławianie).

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna

1. Bakterie w środowisku i w organizmie człowieka.

a/ Występowanie bakterii w powietrzu – badanie metodą sedymentacji

na agarze z krwią przez 30 minut.

b/ Występowanie bakterii na powierzchni stołu – badanie przy użyciu

płytki kontaktowej (agar z krwią).

c/ Występowanie bakterii na odzieży – badanie metodą odciskową na

agarze z krwią powierzchni fartucha.

d/ Występowanie bakterii na powierzchni skóry – odciśnięcie opuszki

palca na agarze z krwią przed umyciem rąk, po ich normalnym umyciu

oraz po przetarciu preparatem odkażającym, a także pobranie wymazu

z powierzchni dłoni i jego posianie na agar z krwią, Coccosel Agar i po-

żywkę McConkeya.

2. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na bakterie.

a/ Wpływ temperatury – posiew hodowli płynnej gronkowca złocistego i

laseczki siennej na pożywkę agarową przed i po 10 minutach gotowa-

nia.

b/ Wpływ promieniowania UV – naświetlanie przez 10 minut częściowo

osłoniętej papierem hodowli pałeczki okrężnicy na płytce agarowej.

c/ Wpływ preparatu odkażającego – posiew na płytkę agarową hodowli

pałeczki okrężnicy na pożywce płynnej przed i po 10 minutach działa-

nia na nią 5% roztworu fenolu.

d/ Demonstracja preparatu SPORAL stosowanego do sprawdzania

skuteczności wyjaławiania w autoklawie.

Do wykonania

1. Wykonanie i przerysowanie preparatu barwionego metodą Grama z od-

cisku na szkiełku podstawowym własnego języka.

Ćwiczenie 3. Mikrobiologia ogólna – Identyfikowanie bakterii. Antybio-

tyki i chemioterapeutyki.

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Metody identyfikowa-

nia bakterii na podstawie ich cech biochemicznych, budowy antygenowej i

budowy DNA. Charakterystyka, mechanizm i zakres działania na komórkę

bakteryjną antybiotyków i chemioterapeutyków. Mechanizm powstawania i

przenoszenia oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki u bakterii (opor-

ność naturalna i nabyta, przenoszenia oporności pionowe i poziome). Metody

oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki (naj-

mniejsze stężenie hamujące – MIC, najmniejsze stężenia bójcze – MBC).

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna

1. Identyfikowanie bakterii na podstawie ich cech biochemicznych.

a/ Demonstracja pożywek diagnostycznych i zestawów testów bioche-

micznych wykorzystywanych do identyfikowania bakterii (testy API).

b/ Określanie właściwości hemolitycznych bakterii – hemoliza typu al-

fa, beta i gamma.

2. Demonstracja wykonania antybiogramu metodą krążkowo-dyfuzyjną.

3. Demonstracja antybiogramu wykonanego metodą krążkowo-dyfuzyjną.

4. Demonstracja ustalania najmniejszego stężenia hamującego antybio-

tyku (MIC) przy zastosowaniu E-testu.

5. Demonstracja działania na bakterie dwóch antybiotyków – synergizm i

antagonizm.

6. Demonstracja metody wykrywania wytwarzania beta-laktamaz przez

pałeczki Gram-ujemne.

7. Demonstracja metody wykrywanie szczepów gronkowca złocistego

opornych na metycylinę (MRSA).

Do wykonania

1. Odczytanie i opisanie wyników doświadczeń wykonanych na po-

przednim ćwiczeniu.

2. Wykonanie i przerysowanie preparatu barwionego metodą Grama z

wybranej kolonii z posiewów wymazu z jamy ustnej, płytki kontak-

towej, płytki sedymentacyjnej, odcisku opuszki palca lub odcisku

odzieży.

3. Ocena mikrobiologicznej czystości powietrza:

a x 10000

ݔ =

p x t x 0,2

x = liczba bakterii w 1 m3 powietrza

a = liczba kolonii na płytce (średnia arytmetyczna z co najmniej 5 płytek)

p = powierzchnia płytki (πr2, π = 3,14)

t = czas ekspozycji (30)

0,2 = stała

Klasa czystości wg normy MZiOS:

I – do 70 komórek/m3

II – do 300 komórek/m3

III – do 700 komórek/m3

4. Odczytanie, zapisanie i interpretacja demonstracyjnych antybio-

gramów.

Ćwiczenie 4. Seminarium z mikrobiologii ogólnej. Kolokwium z mikro-

biologii ogólnej.

Na kolokwium obowiązuje znajomość materiału dotyczącego mikrobiologii

ogólnej z pierwszych trzech ćwiczeń oraz z wykładów i podręczników.

Ćwiczenie 5. Mikrobiologia jamy ustnej - bakterie wywołujące stany

chorobowe w obrębie jamy ustnej. Ziarenkowce Gram-dodatnie (rodzaj

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus).

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Rodzaj Staphylococ-

cus, Streptococcus i Enterococcus – systematyka, rezerwuar zarazka, źródła i

drogi zakażenia, budowa i układ komórek, mechanizmy chorobotwórczości,

chorobotwórczość, metody identyfikacji.

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna

1. Demonstracja wzrostu Staphylococcus aureus i Staphylococcus epider-

midis w pożywce płynnej i na agarze z krwią.

2. Demonstracja wzrostu Staphylococcus aureus i Staphylococcus epider-

midis na pożywce wybiórczo-diagnostycznej Chapmana.

3. Demonstracja identyfikacji Staphylococcus aureus metodą aglutynacji

lateksowej.

4. Demonstracja identyfikacji szczepu gronkowca koagulazo-ujemnego za

pomocą cech biochemicznych (zestaw API STAPH).

5. Demonstracja preparatu Staphylococcus aureus w ropie.

6. Rodzaj Streptococcus

a/ Demonstracja wzrostu Streptococcus pyogenes w bulionie i na aga-

rze z krwią z krążkiem zawierającym bacytracynę.

b/ Demonstracja wzrostu Streptococcus pneumoniae i Streptococcus mi-

tis na agarze z krwią z krążkami zawierającymi optochinę.

c/ Demonstracja preparatu Streptococcus pyogenes we krwi.

d/ Demonstracja preparatu Streptococcus pneumoniae.

e/ Demonstracja identyfikacji szczepu paciorkowca za pomocą cech

biochemicznych (zestaw API STREP).

7. Rodzaj Enterococcus

a/ Demonstracja wzrostu Enterococcus faecalis na pożywce z żółcią i

eskuliną.

b/ Demonstracja preparatu Enterococcus faecalis.

Do wykonania

1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych.

2. Odczytanie wyników testów biochemicznych w systemie API STAPH i

identyfikacja gatunkowa zarazków.

3. Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama z hodowli płynnej

Streptococcus pyogenes.

Ćwiczenie 6. Mikrobiologia jamy ustnej - bakterie wywołujące stany

chorobowe w obrębie jamy ustnej. Pałeczki Gram-dodatnie (rodzaj Cory-

nebacterium, Mycobacterium, Actinomyces), ziarenkowce Gram-ujemne

(rodzaj Neisseria), krętki (rodzaj Treponema)

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Rodzaj Corynebacte-

rium, Mycobacterium, Actinomyces, Neisseria, Treponema – systematyka, re-

zerwuar zarazka, źródła i drogi zakażenia, budowa i układ komórek, mecha-

nizmy chorobotwórczości, metody identyfikacji, profilaktyka.

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna

1. Rodzaj Corynebacterium

a/ Demonstracja wzrostu Corynebacterium diphtheriae na pożywce Lo-

efflera.

b/ Demonstracja metody określania wytwarzania toksyny błoniczej

przez Corynebacterium diphtheriae (Test Eleka).

c/ Demonstracja preparatów Corynebacterium diphtheriae i Corynebac-

terium pseudodiphtheriticum barwionych metodą Neissera i metodą

Grama.

2. Rodzaj Mycobacterium

a/ Demonstracja wzrostu różnych gatunków prątków na pożywce Lo-

ewensteina-Jensena.

b/ Demonstracja testów biochemicznych stosowanych w identyfikacji

prątków – test Bogena i test niacynowy.

c/ Demonstracja preparatu Mycobacterium tuberculosis w tkance bar-

wionego metodą Ziehla-Neelsena.

3. Rodzaj Actinomyces

a/ Demonstracja preparatu Actinomyces israelii.

4. Rodzaj Neisseria

a/ Demonstracja preparatu Neisseria gonorrhoeae.

c/ Demonstracja wzrostu Neisseria meningitidis na agarze z krwią.

5. Krętki

a/ Demonstracja preparatu Treponema pallidum w zakażonej tkance.

Do wykonania

1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych – Corynebacterium di-

phtheriae barwionego metodą Neissera, Mycobacterium tuberculosis w

tkance, Actinomyces israelii i Neisseria gonorrhoeae.

Ćwiczenie 7. Mikrobiologia jamy ustnej. Fizjologiczna flora bakteryjna jamy ustnej.

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Najważniejsze rodzaje

bakterii występujących w jamie ustnej człowieka i stanowiących jej florę fizjo-

logiczną (Gram-dodatnie i Gram-ujemne, tlenowe, względnie beztlenowe i

beztlenowe). Ochronna rola fizjologicznej flory bakteryjnej.

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna. Do wykonania

1. Posiew 0,1 mL różnych rozcieńczeń śliny na pożywki wybiórcze w celu

oznaczenia liczebności w ślinie paciorkowców (agar z krwią i azyd-

kiem), gronkowców (agar SM), enterokoków (agar Coccosel), pałeczek

kwasu mlekowego (agar Rogosy) oraz bakterii wytwarzających ze-

wnątrzkomórkowe wielocukry (agar z sacharozą).

2. Wykonanie preparatu z własnej śliny barwionego metodą Grama i

przerysowanie.

Ćwiczenie 8. Mikrobiologia jamy ustnej. Bakteriologia próchnicy zębów

i chorób przyzębia.

Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) – Osłonka nabyta i płyt-

ka nazębna; mechanizm powstawania, skład, patologiczne oddziaływanie na

twarde tkanki zęba i tkanki przyzębia. Rodzaje bakterii bytujących w szczeli-

nach dziąsłowych i będących czynnikiem etiologicznym różnych postaci sta-

nów zapalnych dziąseł i przyzębia. Mechanizmy chorobotwórczości bakterii

wywołujących stany zapalne dziąseł i przyzębia.

Sprawdzian wiadomości

Część praktyczna

1. Oznaczenie pH śliny.

2. Uwidocznienie płytki nazębnej.

3. Demonstracja bakterii będących czynnikiem etiologicznym próchnicy

zębów barwionych metodą Grama.

a/ Streptococcus sp.

b/ Lactobacillus sp.

c/ Actinomyces sp.

4. Demonstracja preparatów niektórych bakterii będących czynnikiem

etiologicznym stanów zapalnych dziąseł i przyzębia:

a/ Prevotella sp.

b/ Porphyromonas sp.

c/ Fusobacterium sp. i Treponema vincentii (martwiczo-wrzodziejące

zapalenie dziąseł).

Do wykonania

1. Odczytanie wyników posiewów wykonanych na poprzednim ćwiczeniu i

ustalenie liczebności bakterii w 1 mL śliny wg wzoru:

X = liczba kolonii na płytce x odwrotność rozcieńczenia x 10

2. Po uwidocznieniu płytki nazębnej zdjąć ją z powierzchni zęba, zawiesić

w kropli wody, zabarwić metodą Grama i przerysować.

Ćwiczenie 9. Seminarium z mikrobiologii jamy ustnej. Kolokwium z mi-

krobiologii szczegółowej.

Na kolokwium obowiązuje znajomość materiału z ćwiczeń oraz z wykładów i

podręczników, dotyczącego rodzajów bakterii omawianych na ćwiczeniach, tj.

rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Cory-

nebacterium, Actinomyces, Lactobacillus, Prevotella, Porphyromonas, Fusobac-

terium, Neisseria, Treponema.

Ćwiczenie 10. Seminarium z mikrobiologii jamy ustnej z przeglądem

preparatów. II termin kolokwium z mikrobiologii szczegółowej.

Ćwiczenie 11. Egzamin praktyczny.

Na egzaminie obowiązuje znajomość preparatów i demonstracji ze wszystkich

ćwiczeń tj. z mikrobiologii ogólnej i mikrobiologii jamy ustnej.