Ćwiczenie: Mikrobiologiczne badania ilościowe
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda tamponowa:
Stosowana do oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego dużych powierzchni:
kadzie fermentacyjne,
beczki,
kontenery
oraz powierzchni wewnętrznych:
przewodów, zaworów, uszczelek.
Materiał pobiera się przecierając jałowym tamponem z waty lub gazy
powierzchnię przeznaczoną do badania, tampony do probówki z jałowym płynem, dokładne wytrząsanie, zawiesina z materiałem wysiewana na odpowiednie
podłoże.
Pobieranie materiału z powierzchni płaskich: jałowy szablon np. z drutu lub blachy w postaci kwadratu/ prostokąta o znanej powierzchni (25 lub 100 cm2).
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda wypłukiwania:
Do oceny czystości opakowań szklanych lub metalowych.
Wewnętrzne powierzchnie naczynia opłukuje się przez wytrząsanie określoną
ilością jałowego płynu fizjologicznego lub wody destylowanej. Zawiesina do
dalszych badań.
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda odciskowa:
Stosowana przy ocenie czystości materiałów opakowaniowych, korków, wieczek
lub innych małych powierzchni.
Badany materiał przyciska się do powierzchni zestalonego podłoża agarowego.
Po określonym okresie inkubacji w odpowiedniej temperaturze określa się
obecność kolonii mikroorganizmów.
Kontrola powierzchni może być wykonywana specjalnymi przyrządami:
Płytki kontaktowe z podłożem stałym, np. RODAC, Envirocheck
Plastikowe ramki wypełnione podłożem stałym, np. Hygicult, Envirocheck
Pobieranie próbek żywności do badań
Pobieranie płynów:
Soki, mleko, wodę itp. - jałową pipetą do jałowej butelki, kolbki lub
probówki
w ilości ¾ objętości naczynia
szczelnie zakorkować.
przed posiewem dokładnie wytrząsnąć próbkę
Pobieranie past
Galaretki, przeciery, pasztety itp.- jałową łopatką w ilości 20 – 50 g
do wyjałowionej i wytarowanej kolbki o pojemności 200 cm3
rozcieńczyć przed posiewem określoną ilością rozcieńczalnika
(rozcieńczenie 1 : 10 lub 1 : 100).
Pobieranie produktów o konsystencji stałej
Mięso, wędliny, podroby, sery itp.-jałowym skalpelem i wyjałowioną
pincetą ok. 200 g próbki
osobno z warstw powierzchniowych i z głębszych
wycinki do płytek Petriego lub kolbek z korkiem.
Pobrać próbkę (na ogół o masie 10, 20 lub 25 g) i zhomogenizować
dodać do 90 lub 180 g jałowego rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10), a
następnie przygotować do posiewu
Posiew ilościowy
1. Przygotowanie kolejnych rozcieńczeń.
Odważyć lub odmierzyć określoną ilość produktu (np. 1 g lub 1 cm3; 10 g),
rozdrobnić
umieścić w naczyniu i zalać 9 lub 90 cm3 roztworu rozcieńczalnika.
wymieszać- uzyskuje się rozcieńczenie wyjściowe 10-1 (1:10).
Kolejne rozcieńczenie 10-2 (1:100) sporządza się przenosząc 1 cm3
zawiesiny do kolejnej probówki z 9 cm3 rozcieńczalnika.
2.Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów metodą zalewową:
Na dwie płytki Petriego przenieść po 1 ml z badanego rozcieńczenia (np.
10-1)
Na dwie kolejne płytki przenieść po 1 ml z kolejnego rozcieńczenia, itd., itp.
Płytki zalać upłynnioną, schłodzoną do ok. 45oC pożywką (np. agar
odżywczy).
Wymieszać i pozostawić do zestalenia.
Po zestaleniu inkubować obrócone do góry dnem w temp. 30oC przez 72
godz.
3. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów metodą posiewu
powierzchniowego:
Na gotowe płytki z zastygłym podłożem agarowym przenieść po 0,1 ml z
odpowiedniego rozcieńczenia
Rozprowadzić równomiernie po powierzchni jałową, szklaną bagietką
Wstawić do cieplarki i inkubować j.w.
4. Obliczanie ogólnej liczby drobnoustrojów:
Do liczenia wybrać płytki, na których nie więcej niż 300 kolonii
Z dwóch rozcieńczeń następujących po sobie
Przynajmniej jedna z 4 płytek powinna zawierać nie mniej niż 15 kolonii
Wzór:
ΣC
L = (n + 0,1n ) d
1
2
ΣC- suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia
n1 – liczba płytek brana pod uwagę przy niższym rozcieńczeniu
n2 - liczba płytek brana pod uwagę przy niższym rozcieńczeniu
d- wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (niższemu) rozcieńczeniu Otrzymaną liczbę zaokrąglić do 2 cyfr znaczących.
Wynik powinien być wyrażony jako liczba pomiędzy 1,0 a 9,9 pomnożona przez
10x, gdzie x jest wykładnikiem potęgi.
Jeśli na płytkach wyrosło mniej niż 15 kolonii należy obliczyć średnią
arytmetyczną z liczby kolonii i podać wynik:
- dla liczby bakterii w 1 ml:
L1= m
- dla liczby bakterii w 1 g:
L2=m x 1/d
m= średnia arytmetyczna liczby kolonii
d-stopień rozcieńczenia wyjściowej zawiesiny (10-1)
Jeśli dwie płytki posiane bezpośrednio z wyjściowej zawiesiny nie zawierają w ogóle żadnej kolonii to ynik podać jako:
mniej niż 1 drobnoustrój w 1 ml (dla płynnej próbki)
mniej niż 10 drobnoustrojów w 1 g (dla stałej próbki)
Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL)
Metoda statystyczna
Próba 5 lub 3 probówkowa
Przygotować 3 rzędy po 5 lub po 3 probówki w każdym
Do pierwszego rzędu posiać do każdej probówki po 10 ml z podstawowego
rozcieńczenia, do następnego po 1 ml a do ostatniego po 0,1 ml
Po inkubacji ocenić w ilu probówkach z każdego rzędu jest wzrost
NPL drobnoustrojów w 100 ml/ g próbki odczytuje się ze specjalnych tabel
Sosowane do oznaczania tylko niektórych grup bakterii, które występują w
badanej żywności w niewielkich ilościach lub takich drobnoustrojów,
których hodowla metodą płytkową jest niemożliwa lub utrudniona.
Najczęściej oznaczenie pałeczek grupy coli, E. coli, bakterii beztlenowych, itp
Stosuje się pożywkę selektywną,
Zasada oznaczania:
Posiew próbki i jej kilku (minimum trzech kolejnych) rozcieńczeń do
pożywek selektywnych w próbówkach, w trzech równoległych
powtórzeniach.
Inkubacja.
Po inkubacji dla każdego posianego rozcieńczenia zapisuje się liczbę prób dodatnich (w których stwierdzono objawy wzrostu bakterii);
do odczytu wybiera się 3 kolejne rozcieńczenia;
z zapisanych dla nich sekwencji trzech liczb (próby dodatnie) odczytuje się ze specjalnych tabel wskaźnik NPL, którego wartość mnoży się przez:
współczynnik pierwszego z 3 rozcieńczeń wybranych do odczytu – w ten
sposób uzyskuje się artość NPL w 1 cm3 lub 1 g.
Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą sączenia przez filtr membranowy:
Dla prób o niewielkiej liczbie drobnoustrojów (np. napoje, woda
wodociągowa)
przesączenie badanej próbki (np. objętości 100 cm3) przez sączek
membranowy,
położenie sączka na podłożu stałym
inkubacja
policzenie kolonii wyrosłych na powierzchni sączka.
Oznaczanie miana drobnoustrojów:
Miano jest to najmniejsza objętość badanego materiału, w którym znajduje
się przynajmniej jedna żywa komórka badanej bakterii.
Oznaczenie miana służy do określenia stopnia zanieczyszczenia badanego
materiału.
Miano coli ( miano pałeczek okrężnicy) to najmniejsza objętość badanego
materiału, w której stwierdza się jeszcze obecność E. coli
Określanie miana coli świadczy o zanieczyszczeniu żywności kałem.
Badanie wykorzystuje właściwość fermentacji laktozy z wytworzeniem
kwasu i gazu w temperaturze 44°C.
Pobraną próbkę rozcieńcza się w pożywce zawierającej laktozę (jako
substrat) i zieleń brylantynową (jako wskaźnik kwasowości).
Oznaczenie przeprowadza się w probówkach z rurkami Durhama (małe
probówki służące do łapania wydzielanego gazu).
Po dobowej inkubacji można odczytywać wyniki.
Bioluminescencja- pomiar ATP:
Termin bioluminescencja pochodzi od greckiego słowa „bios” –życie i
łacińskiego słowa „lumen” – światło.
Metoda oparta jest na wykrywaniu ATP (adenozyno-trójfosforan).
ATP występuje we wszystkich żywych komórkach, gdzie pełni funkcję
nośnika energii
Podczas hydrolizy ATP wydzielana jest duża ilość energii swobodnej, która mierzona jako emisja kwantów światła wydzielanych w czasie reakcji.
Zjawisko to chemiluminescencja, której szczególnym przypadkiem jest
bioluminescencja
Bioluminescencja to proces enzymatyczny,
następuje utlenienie lucyferyny przy udziale enzymu lucyferazy w
obecności jonów magnezu.
Reakcji towarzyszy impuls świetlny, którego natężenie jest skorelowane z
ilością ATP.
Zjawisko zostało wykorzystane do kontroli stanu higienicznego linii
produkcyjnych i urządzeń technologicznych -kontrola skuteczności
procesu mycia i dezynfekcji.
pozwala na jednoznaczne stwierdzenie obecności żywych komórek na
badanych powierzchniach
Wysoki poziom ATP wskazuje na niską skuteczność procesu mycia i
dezynfekcji