Enzymologia
Ćwiczenia
Enzymologia
1
Enzymologia
Ćwiczenie I
Oznaczanie aktywności enzymów lipolitycznych
Część teoretyczna
Enzymy lipolityczne
Specyficzność niektórych enzymów polega na tym, że działają w
substracie na określony rodzaj wiązania chemicznego. Do tej grupy należą
enzymy lipolityczne  np. lipaza wydzielana przez trzustkÄ™ hydrolizuje
wiązanie estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi
w obrębie różnorodnej grupy lipidów. Lipaza należy do klasy hydrolaz, do
podgrupy esteraz, przy czym efektywne działanie tego enzymu jest
uzależnione od ściśle określonych warunków przebiegu reakcji.
L i p a z a
Lipazy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie: występują zarówno
w organizmach ludzi i zwierząt ( w trzustce, wątrobie, ścianie żołądka i jelit),
jak również w nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin oraz w
niektórych mikroorganizmach.
Lipazy katalizujÄ… hydrolizÄ™ nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli
(TAG). Reakcja ta (rys.1) zachodzi na granicy międzyfazowej wody, (czyli fazy,
w której rozpuszczone są lipazy) z lipidami, (czyli fazy substratu) i prowadzi
do powstania kwasów tłuszczowych, diacylogliceroli (DAG),
monoacylogliceroli (MAG) oraz glicerolu. Lipazy katalizują również hydrolizę
rozpuszczalnych w wodzie, krótkołańcuchowych estrów kwasów
karboksylowych, która zachodzi jednak bardzo powoli.
O O
H2C O C R1 H2C O C R1
O + H2O O O
HC O C R2 LIPAZA HC O C R2 HO C R3
+
O
- H2O
H2C O C R3 H2C OH
TRIACYLOGLICEROL DIACYLOGLICEROL WOLNY KWAS
(TAG)
(DAG) TA
USZCZOWY
O
O
H2C O C R1
H2C O C R1
O
+ H2O O
HC O C R2
LIPAZA HC OH HO C R2
+
- H2O
H2C OH
H2C OH
WOLNY KWAS
DIACYLOGLICEROL MONOACYLOGLICEROL
TA
USZCZOWY
(DAG) (MAG)
O
H2C OH
H2C O C R1
O
+ H2O
HO C R1
+
HC OH
HC OH LIPAZA
- H2O
H2C OH
H2C OH
WOLNY KWAS
MONOACYLOGLICEROL GLICEROL
TA
USZCZOWY
(MAG)
2
Rys. 1 Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy
Enzymologia
Hydroliza triacylogliceroli jest reakcją odwracalną ze względu na
niewielką różnicę w zmianie energii swobodnej w kierunku hydroliza-synteza.
Kierunek reakcji jest zdeterminowany środowiskiem, przy czym nadmiar H O
2
wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość H O reakcję odwrotną -
2
estryfikację glicerolu. Szybkość hydrolizy triacylogliceroli wzrasta z liczbą
reszt kwasów tłuszczowych, długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia
kwasów tłuszczowych.
Katalizowanie reakcji przez lipazy w środowisku o kontrolowanej zawartości
H O (współczynnik aktywności wodnej) możliwe jest w środowisku
2
rozpuszczalników organicznych, roztworów buforowych.
Lipazy katalizujÄ… trzy typy reakcji:
1. Hydrolizę  w środowisku wodnym, gdzie jest jej nadmiar.
2. Estryfikację  w środowisku o niskiej aktywności wody lub w
rozpuszczalnikach prawie bezwodnych.
3. Transestryfikację  polega na wymianie kwasów tłuszczowych w TAG:
a. Acydoliza  grupy acylowe pochodzą od wolnych kwasów
b. Interestryfikacja  wymiana grup acylowych pomiędzy
estrami
c. Alkoholiza  reakcja między alkoholem a estrem w wyniku
której po wymianie reszt alkoholowych między tymi
zwiÄ…zkami powstaje nowy alkohol i nowy ester.
Optimum pH reakcji dla lipaz pochodzenia zwierzęcego wynosi 7,0  8,0, a
dla lipaz roślinnych w granicach pH 4,7-5,0, natomiast temperatura
efektywnego dziaÅ‚ania mieÅ›ci siÄ™ miÄ™dzy 35 a 37°C.
Aktywność lipaz można badać, określając ilość uwolnionych kwasów
tłuszczowych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach
doświadczalnych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach
badanego substratu tłuszczowego, pobieranych w kolejnych odstępach
czasu, oznacza siÄ™ przez miareczkowanie mianowanym roztworem
wodorotlenku potasowego.
Natomiast proces utleniania lipidów zachodzi w wyniku działania dwóch
enzymów - lipazy i lipooksygenazy, według poniższego schematu
tłuszczowce
“! lipaza
kwasy tłuszczowe + glicerol
“! lipooksygenaza
wodoronadtlenki kwasów tłuszczowych
“!
aldehydy i ketony
(zwiÄ…zki o charakterystycznym, nieprzyjemnym zapachu i smaku)
Proces ten zaczyna się od działania lipazy uwalniającej z cząsteczek
triacylogliceroli kwasy tłuszczowe, z których następnie powstają produkty
utlenienia. Rozkład tłuszczu następuje szybko np. podczas przemiału
pszenicy ( może być rozłożony w tych warunkach nawet w 2/3 całkowitej
3
Enzymologia
ilości), wtedy mąka charakteryzuje się gorzkim smakiem. Wysoką aktywność
lipolityczną mają zarodki pszenne, a znaczna część całkowitej ilości lipazy
zawarta jest w otrębach.
Aktualnie wykorzystywane lipazy głównie są pochodzenia
mikrobiologicznego. Spośród drobnoustrojów znaczne ich ilości
syntetyzowane są przez różne szczepy drożdży, pleśni czy bakterii (Candida
antarctica, Candida rugosa, Candida cylindracea, Rhizomucor miehei,
Aspergillus niger, Pseudomonas pseudomalle, Bacillus fluorescens, Bacillus
piocyaneum). Zastosowanie mają w przemyśle spożywczym do produkcji
wielu komercyjnie ważnych niskocząsteczkowych estrów o określonych
walorach zapachowo-smakowych. NadajÄ… one odpowiedni aromat i smak , a
stosowane są najczęściej do napojów, soków, nektarów oraz wielu różnych
produktów spożywczych jak np. budynie, kisiele, dżemy, ciastka itp..
Niektóre związki posiadają charakterystyczny smak  np. bananowy (octan
izoamylu), ananasowy (maślanian metylu), owocowy (propionian metylu) lub
aromat - miodowy (estry tolilu), różany (octan cytronellylu), owocowy (octan
terpinylu). Wybrane lipazy pochodzenia mikrobiologicznego hydrolizujÄ…c np.
tłuszcz mleka krowiego, uwalniają głównie lotne kwasy tłuszczowe
(krótkołańcuchowe), których zawartość wynosi 8-10% ogólnej ilości
związanych w tłuszczu kwasów; inne odszczepiają przede wszystkim kwasy o
długich łańcuchach. Stosowane szeroko w przemyśle mleczarskim powodują
intensyfikację cech organoleptycznych, w tym przede wszystkim serów
twardych, którym uwolnione kwasy krótkołańcuchowe nadają pikantny
smak.
Ostatnio lipazy wykorzystywane są do syntezy estrów kwasów
tłuszczowych np. z kwasem askorbinowym (wit. C) oraz witaminą A. Te
zwiÄ…zki majÄ… charakter przeciwutleniaczy ale posiadajÄ… zmienione
właściwości hydrofobowo-hydrofilowe (kwas askorbinowy w formie estru
kwasu tłuszczowego rozpuszczalny jest w olejach) i mogą mieć szerokie
zastosowanie w przemyśle tłuszczowym lub kosmetycznym.
W trawieniu lipidów pożywienia w organizmach ludzi i zwierząt największe
znaczenie majÄ… lipazy  trzustkowa (najbardziej efektywna), wÄ…trobowa i
jelitowa. W produktach enzymatycznego rozkładu tłuszczu występują
równocześnie obok uwolnionych kwasów tłuszczowych i glicerolu, także
mono- i diacyloglicerole. Lipaza trzustkowa wykazuje swoistość działania w
stosunku do wiązań estrowych utworzonych w reakcji kwasów
karboksylowych z pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi; odszczepia
więc wyłącznie kwasy tłuszczowe w pozycjach ą i ą w cząsteczce
triacylogliceroli. Natomiast lipaza ze ściany jelita działa również na wiązania
estrowe w poÅ‚ożeniu ², które powstajÄ… w reakcji kwasów tÅ‚uszczowych z
drugorzędową grupą alkoholową glicerolu. W warunkach fizjologicznych
równowaga reakcji jest przesunięta na korzyść produktów rozkładu i
biosynteza estrów pod wpływem lipaz praktycznie nie zachodzi.
4
Enzymologia
Wiele gałęzi przemysłu w tym nie tylko spożywczego, w produkcji swoich
wyrobów stosuje lipazy, zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i
mikrobiologicznego:
" Przemysł mleczarski - serowarstwo  lipazy (pochodzenia zwierzęcego
lub pleśniowego) wykorzystywane są do produkcji serów typu
roquefort, cheddar oraz serów włoskich; enzym hydrolizuje częściowo
tłuszcz, powoduje to poprawę właściwości organoleptycznych serów
(aromatu, smaku), a także skraca czas ich dojrzewania
" Przemysł cukierniczy  stosowanie lipazy do hydrolizy pozostałości
tłuszczu w suchej albuminie jaj, ponieważ obecność tłuszczu obniża
zdolność białka do tworzenia piany; stosuje się traktowanie lipazą
masy jajecznej przed suszeniem przez co wzrasta organoleptyczna
jakość gotowego produktu, przy produkcji czekolady mlecznej  lipaza
powoduje powstawanie kwasów tłuszczowych, które poprawiają jej
smak i aromat
" Przemysł tłuszczowy  przy produkcji tłuszczów roślinnych - w
procesie modyfikowania tłuszczów, natomiast w transporcie i
przechowywaniu nasion roślin oleistych mogą oddziaływać
niekorzystnie. Przy zbyt wysokiej zawartości wody znacznie wzrasta
kwasowość nasion, która jest nie korzystna z uwagi na zachodzącą
pod wpływem lipazy hydrolizę acylogliceroli i uwalnianie kwasów
tłuszczowych
" Przemysł skórzany  działanie lipazy na pozostałości tłuszczu w
surowcach i półproduktach skórzanych - odtłuszczanie skór, wełny,
szczeciny
" Przemysł tekstylny - produkcja jedwabiu  w skład głównego włókna
jedwabiu wchodzi ok. 0,7% tłuszczu, natomiast we włóknach
surowych zanieczyszczonych poczwarkami jedwabnika zawartość
tłuszczu wynosi 3-4%, dlatego stosuje się preparaty lipolityczne w celu
ich odtłuszczenia
" Przemysł chemiczny  jako składnik detergentów, bioemulgatorów
(zawierających enzymy lipolityczne) do produkcji środków piorących,
preparatów usuwających w szczególności tłuste plamy z odzieży, obić
meblowych, dywanów
" Przemysł farmaceutyczny - otrzymywanie preparatów leczniczych,
określonych leków np. wspomagających działanie trzustki i wątroby
5
Enzymologia
L i p o o k s y g e n a z a
Lipooksygenaza jest enzymem z klasy oksydoreduktaz, występujących
powszechnie we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych.
Lipooksygenazy należą do podklasy dioksygenaz zawierających żelazo,
katalizujÄ… reakcjÄ™ utleniania wolnych lub zestryfikowanych polienowych
kwasów tłuszczowych do wodoronadtlenków. Lipooksygenaza katalizuje
utlenianie kwasów tłuszczowych, w których wiązania podwójne przedzielone
są grupami metylenowymi. Również niezbędnym elementem strukturalnym
jest konfiguracja cis-cis. Białka lipooksygenaz roślinnych składają się z
pojedynczego łańcucha o masie molekularnej około 75-100 kDa.
Proces katalizowany przez lipooksygenazy przebiega w trzech zasadniczych
etapach:
1. stereospecyficzne oderwanie wodoru od grupy metylenowej
położonej pomiędzy podwójnymi wiązaniami i utworzenie
rodnika kwasu tłuszczowego,
2. rekombinacja wiązań podwójnych w cząsteczce kwasów
tłuszczowych w skoniugowane dieny,
3. stereospecyficzne przyłączenie cząsteczki tlenu i utworzenie
rodników nadtlenkowych.
H H
COOH
H
" H
"
COOH
COOH
OOH
OOH
COOH
COOH
13-HPODE 9-HPODE
Rys. 2. Utlenianie kwasu linolowego do 9- i 13-wodoronadtlenków po wpływem
katalitycznego oddziaływania lipooksygenazy.
Generowane przez lipooksygenazÄ™ wodoronadtlenki stanowiÄ… substraty
działania kolejnych enzymów, takich jak: liazy, izomerazy
wodoronadtlenkowe, peroksydazy, tlenowe syntetazy allenylowe. PoczÄ…tkowe
produkty działania lipooksygenazy mogą być degradowane do różnych
związków, włączając aldehydy, ketony (charakterystyczne związki zapachowe)
i alkohole.
Pośrednie produkty powstałe w wyniku działania lipooksygenazy mogą
ulegać cyklizacji w wyniku działania cyklooksygenazy allenylowej i ten szlak
6
Enzymologia
przemian prowadzi do powstania w roślinach kwasu jasmonowego i jego
pochodnych, pełniących funkcję hormonów roślinnych.
Lipooksygenazy biorą udział w utlenianiu przeciwutleniaczy takich jak
witamina C i E, natomiast adrenalina, noradrenalina czy N-acetylodopamina
przekształcane są przy współudziale tych enzymów w odpowiednie barwniki
melaninowe. Powstawanie wolnych rodników w wyniku działania
lipooksygenaz na polienowe kwasy tłuszczowe są jednym z istotnych
powodów zainteresowania tymi enzymami ze strony technologów żywności z
uwagi na fakt, że reagują one z innymi składnikami żywności  witaminami,
pigmentami, białkami czy polifenolami, obniżając jakość artykułów
spożywczych. Z drugiej strony wywierają korzystne działanie ze względu na
rolę, jaką odgrywają w procesie powstawania lotnych związków o
charakterystycznym zapachu i smaku w żywności, zarówno świeżej, jak i
przetworzonej, włączając grzyby, pomidory, ogórki, melony, banany, świeże i
mrożone warzywa oraz produkty otrzymywane z nasion roślin strączkowych.
Lipooksygenaza podobnie jak lipaza wywiera ujemny wpływ w trakcie
przechowywania wielu produktów zbożowych. Podczas utleniania
polienowych kwasów tłuszczowych acylogliceroli zawartych np. w mące lub
kaszach powstają wodoronadtlenki, które następnie utleniają inne
składniki, w tym głównie tłuszcze, nadając tym produktom nieprzyjemny
zapach i smak.
Reakcja katalizowana przez lipooksygenazÄ™:
R& & CH  CH=CH-CH
2 2-CH=CH-CH & & COOH
2
“! O
2
R& & CH  CH=CH-CH=CH-CH-& & COOH
2
|
OOH
Proces ten powoduje jełczenie mąki i innych wyrobów zbożowych. W
początkowym okresie przechowywania mąki pszennej działanie
lipooksygenazy jest korzystne dla jakości, dopiero długotrwałe
magazynowanie doprowadza do jełczenia mąki pod wpływem tego enzymu.
Korzystne działanie lipoksygenazy na wartość wypiekową mąki przejawia się
tym, że niewielkie ilości wodoronadtlenków kwasów tłuszczowych
 umacniają gluten mąki, poprawiają jego właściwości fizyczne. Do mąki
pszennej dodaje się niewielkie ilości mąki sojowej jako szczególnie bogatej w
lipooksygenazę i niewielką ilości oleju roślinnego. Obserwuje się znaczne
zwiększenie objętości chleba - nawet do 50% (polepszenie właściwości
reologicznych ciasta chlebowego w trakcie pieczenia, prawdopodobnie
poprzez możliwość utleniania grup tiolowych białek pszenicy), a także
znaczne wybielenie miękiszu chleba. Działanie lipooksygenazy ma także duże
znaczenie przy produkcji makaronu. Aktywność lipooksygenazy w mące
makaronowej (produkowanej z pszenicy twardej Triticum durum) wywiera
duży wpływ na barwę gotowych makaronów. Pożądana żółta barwa
makaronu związana jest z obecnością karotenoidów, zwłaszcza luteiny - w
semolinie pszenicy twardej, ale pod wpływem działania endogennych
oksydaz, w tym lipooksygenaz, następują straty tego barwnika w trakcie
procesu technologicznego.
7
Enzymologia
Część doświadczalna
1. HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOC
LIPAZY TRZUSTKOWEJ
Zasada metody
Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów
tłuszczowych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach w
substracie zawierającym tłuszcz. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w
próbkach badanego substratu, pobieranych w kolejnych odstępach czasu,
oznacza siÄ™ przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku
potasowego wobec fenoloftaleiny jako wskaz
nika.
Część analityczna
Materiały i odczynniki:
Kolba (250-500cm3)  1szt 0,05 M roztwór KOH
Kolba stożkowa (100cm3)  7szt 1% roztwór fenoloftaleiny
Kolba stożkowa (300-400 cm3)  2szt Metanol
Cylinder (100cm3) Badany produkt
Pipety (5cm3; 2x10cm3; 25cm3) Trzustka wieprzowa
Lejek Uniwersalne papierki wskaz
nikowe
SÄ…czki
A
az
nia wodna (38°C)
Gaza
Zestaw do miareczkowania
Homogenizator
Postępowanie
Otrzymanie wyciÄ…gu lipazy z trzustki
Zhomogenizować 200 g świeżej, pokrojonej trzustki wieprzowej z 300
cm3 wody destylowanej. Zawiesinę przesączyć przez gazę. Otrzymany
przesącz, stanowiący roztwór enzymu, zobojętnić do pH 7 przy użyciu 0,1 M
roztworu KOH wobec papierka wskaz
nikowego.
Oznaczenie
Do kolby stożkowej o pojemności 250 cm3 odmierzyć 100 cm3 mleka
lub śmietanki, a następnie kolbę umieścić w łaz
ni wodnej w temperaturze
38°C. Przygotować sześć ponumerowanych kolb stożkowych o pojemnoÅ›ci
100 cm3 i do każdej z nich odmierzyć po 25 cm3 metanolu. Po upływie 10
minut od momentu wstawienia kolby z mlekiem do Å‚az
ni, dodać do mleka 30
cm3 przygotowanego wstępnie wyciągu enzymatycznego z trzustki i dokładnie
wymieszać. Kolbę pozostawić w łaz
ni wodnej i co kilka minut powtarzać
mieszanie. Po upływie 15 minut od dodania wyciągu enzymatycznego pobrać
z mieszaniny reakcyjnej 10 cm3 roztworu do kolby stożkowej o pojemności
100 cm3 (próba nr 1). W analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 90
min., w odstępach 15-minutowych (łącznie sześć prób). Poszczególne próbki
miareczkować 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do pojawienia się
lekko różowego zabarwienia.
Próba zerowa
Przenieść 50 cm3 uzyskanego na wstępie wyciągu enzymatycznego do kolby
stożkowej o pojemności 100 cm3 i ogrzewać do wrzenia w celu inaktywacji
8
Enzymologia
enzymu. Po oziębieniu gotowanego roztworu ewentualny wytrącony osad
odsączyć. Następnie do kolby stożkowej o pojemności 100 cm3 (nr 0)
odpipetować 10 cm3 mleka lub smietanki, 3 cm3 przesączu z ogrzewanego
wyciągu enzymatycznego oraz 25 cm3 metanolu. Próbę miareczkować
analogicznie jak próby badane 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny.
Wyniki zebrać i przedstawić w postaci tabel i wykresów w protokóle z ćwiczeń
(na końcu opracowania)
" Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w tabeli.
Nr Czas Ilość cm3 0,05 M KOH zużytego do
próby (min.) miareczkowania próby:
0 0
1 15
2 30
3 45
4 60
5 75
6 90
" Obliczyć mikroekwiwalenty uwolnionych kwasów tłuszczowych z
równania:
A
( - B x C x 1000
)
mikroekw. =
D
Gdzie: A  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej
B  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej
C  molowość użytego do miareczkowania KOH
D  ilość cm3 wyciągu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu
" Na wykresie przedstawić zależność mikroekwiwalentów uwolnionych
kwasów tłuszczowych w czasie doświadczenia (90min.).
9
Enzymologia
2. OZNACZENIE ILOÅšCI POWSTAA
YCH WODORONADTLENKÓW KWASU
LINOLOWEGO POD WPA
YWEM LIPOOKSYGENAZY SOJOWEJ
Zasada metody
PodstawÄ… metody jest pomiar wzrostu absorbancji przy =234 nm
towarzyszącej utlenianiu tłuszczowego substratu (kwas linolowy). Proces
utleniania przebiega w buforze boranowym (pH 9,0). KorzystajÄ…c ze
współczynnika ekstynkcji dla powstałych wodoronadtlenków kwasu
linolowego i prawa Lamberta-Beera, można obliczyć ilość powstałych
nadtlenków.
Część analityczna
Materiały i odczynniki:
Probówki  5szt Etanol 98%
Kwas linolowy
Pipeta automatyczna (10-100µl)
Bufor boranowy (pH 9)
Pipeta automatyczna (5 ml)
Mąka sojowa (odtłuszczona)
Spektrofotometr
Bufor octanowy (pH 4,5)
Vortex
Moz
dzierz
Lejek
SÄ…czki
Wirówka
Postępowanie
Otrzymanie wyciÄ…gu lipooksygenazy
1g odtłuszczonej mąki sojowej ucierać w moz
dzierzu z niewielką ilością
buforu octanowego o pH 4,5 przez 15 min. Następnie po dokładnym
wymieszaniu przenieść do naczyniek wirówkowych i odwirować przez 15 min
przy 3000 obr/min. Supernatant przesączyć przez sączki bibułowe. Klarowny
wyciąg lipooksygenazy używać do doświadczeń.
(Bufor octanowy sporządzić przez zmieszanie 430 cm3 0,2 M CH COONa z
3
570 cm3 0,2 M CH COOH)
3
Przygotowanie substratu
Odważyć 30 mg kwasu linolowego i rozpuścić go w 5 cm3 etanolu
absolutnego (98%)
Oznaczenie
Do 2-3 probówek pobrać 2,9 cm3 buforu boranowego (pH 9), dodać 50 µl
substratu (kwasu linolowego) i 50 µl wyciÄ…gu lipooksygenazy sojowej (do
próby zerowej dodać 50 µl buforu boranowego). Wymieszać na vortexie,
przenieść do kiuwet i dokonać pomiaru absorbancji przy =234 nm w czasie
5-10 min. w odstępach 60 sekundowych.
Wyniki zebrać i przedstawić w postaci tabel i wykresów w protokóle z ćwiczeń
(na końcu opracowania)
10
Enzymologia
" Wartości absorbancji i obliczoną ilość wodoronadtlenków zestawić w tabeli.
Wartość absorbancji przy
Nr próby Czas Obliczona zawartość
=234 nm
(powtórzenia) (min.) wodoronadtlenków
pomiar średnia
1
2 0
3
1
2 1
3
1
2 2
3
1
2 3
3
1
2 4
3
1
2 5
3
" Obliczyć ilość powstałych wodoronadtlenków kwasu linolowego,
korzystając z prawa Lamberta-Beera, wiedząc że molowy współczynnik
absorbcji dla badanego produktu wynosi µ=23000 M-1cm-1
A = µlc
Gdzie: A  absorbancja
µ  współczynnik absorbcji (absorbancja molowa)
l  droga jaką pokonuje światło w kuwecie (cm)
c  stężenie molowe substancji absorbującej w roztworze
" Na wykresie przedstawić zależność ilości powstałych wodoronadtlenków
w czasie
11
Enzymologia
3. ANALIZA WODORONADTLENKÓW PRZY ZASTOSOWANIU HPLC
Zasada metody
Wykorzystując chromatograf cieczowy z detektorem UV-Vis można
oznaczyć ilościowo poszczególne izomery wodoronadtlenków kwasów
tłuszczowych.
Postępowanie
Do analizy wykorzystać otrzymane w poprzednim doświadczeniu
wodoronadtlenki kwasu linolowego.
W czasie analizy do rozdziału i oznaczeń ilościowych
wodoronadtlenków wykorzystujemy HPLC (Waters) z pompą perystaltyczną
(typ 600). Stosujemy kolumnę do rozdziału z odwróconymi fazami RP-18
LiChrosorb (250 x 4,6 mm; 5µm) (Merck, Darmstadt, Niemcy). Faza ruchomÄ…
jest mieszanina acetonitrylu, wody i kwasu octowego (600:400:1,2 v/v/v) o
prędkość przepływu 1,5 ml/min. Detekcji dokonujemy przy  = 234 nm
(Spektrofotometr UV-Vis typ 2487 Waters).
Ilościowo zawartość nadtlenków kwasów tłuszczowych w próbach
oznaczamy na podstawie krzywych kalibracji przygotowanych dla 13-HPODE
(wodoronadtlenek 13-oktadekadienowego kwasu) i 13-HPOTE
(wodornadtlenek 13- oktadekatrienowego kwasu), a uzyskanych na drodze
enzymatycznego utleniania kwasu linolowego i linolenowego.
4500000
4000000
y = 8E+06x
3500000 R2 = 0,9997
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
zawartość HPODE [ug]
Krzywa standardowa dla wodoronadtlenków kwasu linolowego (13-HPODE)
0.045
13-HPODE
0.040
trans-trans
9-HPODE
0.035
cis-trans
0.030
0.025
13-HPODE 9-HPODE
0.020
cis-trans trans-trans
0.015
0.010
0.005
0.000
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.00
Minutes
Przykładowy rozdział wodoronadtlenków kwasu linolowego
12
powierzchnia piku
9.312
AU
10.711
10.167
8.423
Enzymologia
Protokół z ćwiczenia  enzymy lipolityczne
Poznań, dnia................2007r.
Imię i nazwisko.................................................... Prowadzący ćwiczenie...........................................
.................................................................................
Rok, grupa............................................................ Liczba punktów...............
Ćwiczenie 1
HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOC
LIPAZY TRZUSTKOWEJ
HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOC
LIPAZY TRZUSTKOWEJ
1. Opis i cel ćwiczenia
1. Opis i cel ćwiczenia
1
Enzymologia
2. Wyniki pomiarowe
2. Wyniki pomiarowe
Nr Czas Ilość cm3 0,05 M KOH zużytego do
próby (min.) miareczkowania próby:
0 0
1 15
2 30
3 45
4 60
5 75
6 90
Obliczyć ilość mikroekwiwalentów uwolnionych kwasów tłuszczowych z
Obliczyć ilość mikroekwiwalentów uwolnionych kwasów tłuszczowych z
triacylogliceroli w badanych próbach w czasie doświadczenia, korzystając z równania:
triacylogliceroli w badanych próbach w czasie doświadczenia, korzystając z równania:
A
( - B x C x 1000
)
mikroekw. =
D
Gdzie: A  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej
Gdzie: A  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej
B  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej
B  ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej
C  molowość użytego do miareczkowania KOH
C  molowość użytego do miareczkowania KOH
D  ilość cm3 preparatu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu
D  ilość cm3 preparatu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu
2
Enzymologia
Mikroekwiwalenty
Nr Czas
kwasów
próby (min.)
tłuszczowych
0 0
1 15
2 30
3 45
4 60
5 75
6 90
Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych
Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych
(mikroekwiwalenty) w czasie (min.)
(mikroekwiwalenty) w czasie (min.)
0 15 30 45 60 75 90
Czas [min.]
3
Mikroekwiwalenty kwasów tłuszczowych
Enzymologia
3. Wnioski
3. Wnioski
4
Enzymologia
Ćwiczenie 2
OZNACZENIE ILOÅšCI POWSTAA
YCH WODORONADTLENKÓW POD WPA
YWEM
OZNACZENIE ILOÅšCI POWSTAA
YCH WODORONADTLENKÓW POD WPA
YWEM
LIPOOKSYGENAZY
LIPOOKSYGENAZY
1. Opis i cel ćwiczenia
1. Opis i cel ćwiczenia
2. Wyniki pomiarowe
2. Wyniki pomiarowe
Wartość absorbancji przy
Nr próby Czas Obliczona zawartość
=234 nm
(powtórzenia) (min.) wodoronadtlenków
pomiar średnia
1
2 0
3
1
2 1
3
1
2 2
3
5
Enzymologia
1
2 3
3
1
2 4
3
1
2 5
3
Obliczyć ilość powstałych wodoronadtlenków kwasu linolowego, korzystając z prawa
Obliczyć ilość powstałych wodoronadtlenków kwasu linolowego, korzystając z prawa
Lamberta-Beera, wiedząc że współczynnik ekstynkcji dla badanego produktu wynosi
Lamberta-Beera, wiedząc że współczynnik ekstynkcji dla badanego produktu wynosi
µ=23000 M-1cm-1
µ=23000 M-1cm-1
A = µlc
Gdzie: A  absorbancja
µ  współczynnik absorbcji (absorbancja molowa)
l  droga jaką pokonuje światło w kuwecie (cm)
c  stężenie molowe substancji absorbującej w roztworze
6
Enzymologia
Sporządzić wykres zależności ilości powstałych wodoronadtlenków w czasie (min.)
Sporządzić wykres zależności ilości powstałych wodoronadtlenków w czasie (min.)
0 1 2 3 4 5
Czas [min.]
3. Wnioski
3. Wnioski
7
Wodoronadtlenki