MEDYCYNA S
DOWA, ĆWICZENIE 3, P. 2, 16.12.2013 dr n. med. Maciej Jędrzejczyk
Wprowadzenie do genetyki sÄ…dowej
1. Materiały biologiczne  testy wstępne
2. Prawidłowe zabezpieczenie śladów biologicznych / błędy
3. DNA w komórce  z
ródła, podział
4. Markery stosowane w genetyce sądowej  podział, charakterystyka
5. Sekwencje tandemowo powtórzone w genomie człowieka  charakterystyka, zastosowanie
6. Proces badawczy w laboratorium genetycznym
7. Reakcja PCR / multiplex PCR  charakterystyka, zastosowanie
8. Markery nierekombinacyjne  charakterystyka, zastosowanie
9. Homozygota / heterozygota
10. Marker płci
11. Szansa ojcostwa / prawdopodobieństwo ojcostwa
12. Potwierdzenie / wykluczenie ojcostwa
13. Częstość genotypu / prawdopodobieństwo zgodności profilu genetycznego
Genetyka sÄ…dowa - zastosowanie
´ð Ustalenie pokrewieÅ„stwa
o ojcostwo / macierzyństwo
o brak rodziców  badanie krewnych
´ð Identyfikacje osobnicza
o identyfikacja NN denatów / osób zaginionych / ofiar katastrof masowych
´ð Kryminalistyka
o analiza zabezpieczonego materiału dowodowego w postaci śladów biologicznych
o szukanie profilu sprawcy / ofiary na dowodach
o identyfikacja sprawców przestępstw  śladów biologicznych  bazy profili DNA
´ð Analizy historyczne
Materiały biologiczne
·ð wymazy np. z pochwy
·ð krew
·ð wycinki mięśni
·ð koÅ›ci  dÅ‚ugie; zÄ™by
·ð odzież (plamy nasienia), poÅ›ciel, meble, papierosy (pety)
·ð wÅ‚osy (przydatne tylko z cebulkami)
·ð paznokcie
Możliwa degradacja  tkanki zatopione, utrwalone w formalinie / parafinie
31 | S t r o n a
Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów
Warunki:
´ð materiaÅ‚y suche: temperatura pokojowa, dostÄ™p powietrza
´ð ciecze, tkanki miÄ™kkie: -20oC do -80oC (koÅ›ci)
Metody
´ð Krew na antykoagulant (-20oC) lub bibuÅ‚a / płótno/ FTA (+20oC)
´ð Wymazy (-20oC lub +20oC po wysuszeniu)
´ð Wysuszenie / zapakowanie w papierowÄ… kopertÄ™: temperatura pokojowa  niedopaÅ‚ki, znaczki,
odzież (pobranie fragmentów lub w całości), włosy z cebulkami, paznokcie wraz z materiałem
znajdujÄ…cym siÄ™ pod nimi
Powierzchnie wchłaniające:
´ð wyciÄ™cie fragmentu (dywan)
´ð zabezpieczenie w caÅ‚oÅ›ci (odzież)
Powierzchnie niewchłaniające:
´ð zabezpieczenie na jaÅ‚owÄ… wymazówkÄ™ (dz
wignia zmiany biegów)
´ð zabezpieczenie fragmentu przedmiotu wraz z zaplamieniem (kawaÅ‚ek stÅ‚uczonej szyby)
´ð zabezpieczenie w caÅ‚oÅ›ci, jeÅ›li gabaryty niezbyt duże
Materiały biologiczne: nieprawidłowe zabezpieczanie śladów
´ð praca w niesterylnych warunkach  brak rÄ™kawiczek, masek; używanie niejaÅ‚owej wody
destylowanej  kontaminacja przy zabezpieczaniu
´ð zabezpieczanie krwi na heparynÄ™ (inhibicja PCR)
´ð niedosuszenie wymazów / zabezpieczonych Å›ladów / przechowywanie w szczelnie
zamkniętych foliowych workach  rozwój mikroorganizmów i póz
niejsze zgnicie
´ð zabrudzenie materiałów glebÄ… (kwasy humusowe), rdzÄ…, detergentami, chemikaliami (kwasy /
zasady)  degradacja DNA / inhibicja PCR
´ð pozostawienie w nasÅ‚onecznionym miejscu  degradacja (UV)
Materiały biologiczne  testy jakościowe
A. Åšlina
´ð test niespecyficzny  test pÅ‚ytkowy (agar + skrobia)  aktywność Ä…-amylazy
´ð testy specyficzny:
o test immunochromatograficzny  obecność ą-amylazy
o test odciskowy Phadebas  aktywność ą-amylazy
B. Krew
´ð testy niespecyficzne (luminol  Dexter używa, H2O2)
´ð test specyficzny  immunochromatograficzny (hemoglobina ludzka)
32 | S t r o n a
C. Sperma
´ð test niespecyficzny  UV / test bardziej specyficzny  Bluemaxx  ma wyższe widmo (też
ślina i mocz)
´ð test specyficzny  immunochromatograficzny (obecność PSA)
DNA
´ð kwas deoksyrybonukleinowy
´ð podwójna helisa
´ð 3 miliardy par zasad (A  G  C  T)
´ð A = T, G = C
´ð ok. 30000 genów
´ð ponad 99% identycznoÅ›ci w populacji
´ð 1% różnica wykorzystywanych w genetyce sÄ…dowej
´ð rejony kodujÄ…ce (ok. 5%) i niekodujÄ…ce (ok. 95%)
´ð transkrypt z DNA na RNA
´ð trójkÄ…t nt  informacja o AA budujÄ…cych biaÅ‚ka
DNA: jÄ…drowy i mitochondrialny
Zróżnicowanie sekwencji tandemowych
´ð Sekwencje minisatelitarne  VNTR
´ð Jednostka powtórzeniowa: od 9 do 100 bp / caÅ‚a sekwencja kilka tysiÄ™cy bp
´ð Bardzo wysoki stopieÅ„ polimorfizmu
´ð Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR
´ð Sekwencje mikrosatelitarne  STR (krótkie powtórzenia tandemowe)
´ð Motyw repetytywny: 2  6 bp
´ð Duży polimorfizmu
´ð Główna metoda analizy  PCR
33 | S t r o n a
Techniki i markery używane w genetyce sądowej:
1. Analiza sekwencji tandemowo powtórzonych
´ð Sekwencje mikrosatelitarne  STR
´ð Sekwencje minisatelitarne  VNTR (znaczenie historyczne)
2. Sekwencjonowanie DNA mitochondrialnego
3. Analiza polimorfizmów typu SNP
DNA typu minisatelitarnego: VNTR
´ð VNTR (variable number of tandem repeats)  wystÄ™pujÄ…ce w genomie sekwencje DNA o
zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń w locus
´ð Jednostka powtórzeniowa: od 10 do 100 bp
´ð CaÅ‚a sekwencja  dÅ‚ugość nawet do kilkudziesiÄ™ciu tysiÄ™cy bp
´ð Dziedziczenie i segregacja sech wg zasad Mendla
´ð Bardzo wysoki polimorfizm
´ð Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR
´ð PrzykÅ‚ad loci VNTR: D7S21, D12S11, D1S7
DNA typu mikrosatalitarnego: STR
´ð STR  krótkie powtórzenia tandemowe
´ð Jednostka: 2  6 bp
´ð Ilość powtórzeÅ„ w rejonie może różnić siÄ™ pomiÄ™dzy osobami
´ð Duży polimorfizm; metoda analizy  PCR
´ð Szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie gÅ‚. w rejonach niekodujÄ…cych (brak informacji
m.in. o rasie, predyspozycjach do chorób, cechach fenotypowych np.: wzrost, kolor oczu /
włosów)
34 | S t r o n a
Praca w laboratorium genetycznym  etapy:
1. Otrzymanie / pobranie materiału
2. Izolacja:
o Metoda fenolowo  chloroformowa
o Sherlock AX
3. Pomiar stężenia DNA
4. Amplifikacja DNA metodÄ… PCR
5. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR
o analiza ręczna  barwienie żeli
o analiza automatyczna  detekcja optyczna z wykorzystaniem promieni lasera
produktów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi (analizator genetyczny)
5. Genotypowanie
PCR  zasada reakcji
94oC
Denaturacja nici  pękanie wiązań wodorowych
59oC
Przyłączenie primerów do nici
5' TCATAAGT 3'
3' AGTATTCATT 5'
72oC
Wydłużenie przez polimerazę nici komplementarnej
do nici matrycy
Podwojenie ilości amplifikowanego fragmentu DNA w każdym cyklu:
1, 2, 4, 8, 16 ... [1 cykl = 2 czÄ…steczki (nowe fragmenty DNA)]
Multipex PCR
´ð Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji PCR.
´ð Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej  unikniÄ™cie parowania siÄ™ miÄ™dzy sobÄ….
´ð Primery wyznakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi  odseparowanie od siebie loci o
podobnym zakresie masy (bp).
´ð RozdziaÅ‚ produktów PCR w zależnoÅ›ci od wielkoÅ›ci.
´ð OszczÄ™dność czasu i materiałów (degradacja DNA).
´ð Potrzeba niewielkiej iloÅ›ci DNA (2,5 ul).
´ð Duża siÅ‚a dyskryminacji zestawu np. 15 loci.
´ð Amelogenina  marker pÅ‚ci (- 6 par zasad na X).
35 | S t r o n a
Markery Y-STR
·ð dziedziczenie w linii mÄ™skiej
·ð ustalenie pochodzenia geograficznego (brak materiaÅ‚u referencyjnego)
SNPs  Single Nucleotide Polymorphisms
·ð cytozyna na tyminÄ™
·ð najczÄ™stsza zmiana zachodzÄ…ca w sekwencji DNA
·ð wystÄ™puje w genomie Å›rednio co 100  300 bp
·ð różnica polega na ramieniu pojedynczego nukleotydu w sekwencji DNA pomiÄ™dzy osobnikami
mtDNA
·ð przydatność przy analizie zdegradowanego jÄ…drowego DNA
·ð dziedziczenie w linii odmatczynej
·ð dwuniciowa, kolista zamkniÄ™ta czÄ…steczka
·ð dziedziczenie wyÅ‚Ä…cznie od matki
·ð wystÄ™powanie w mitochondriach
Zasady wyłączania ojcostwa
u dziecka pojawia siÄ™ nowa cecha
nieobecna u pozwanego o ojcostwo
mężczyzny ani u matki
I / LUB
dziecko nie dziedziczy cechy po
pozwanym o ojcostwo mężczyz
nie
·ð muszÄ… być 4 niezgodnoÅ›ci, aby wykluczyć ojcostwo mężczyzny wobec dziecka
Wartość dowodowa analizy
Szansa ojcostwa  PI
Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest ojcostwo badanego pozwanego w porównaniu do
ojcostwa losowo wybranego mężczyzny dla konkretnego wyniku ekspertyzy 
PRAWDOPODOBIEC
STWO OJCOSTWA
P = PI / PI + 1
Np. locus D12 S11:
ojciec 11  11
PI = 1 / częstość (15)
matka 15  15
dziecko 11  15
36 | S t r o n a
Wartość dowodowa analizy
A
Ä…czna szansa ojcostwa  PI c
Å»ð
Zasada iloczynu -  PRODUCT RULE
PI c = PI 1 lokus x PI 2 lokus x PI 3 lokus x & ...
(mnożymy prawdopodobieństwo różnych loci)
Opiniowanie w analizie ojcostwa
EKSPERTYZA DNA
potwierdzenie z
wyłączenie minimum 4 niezgodności
prawdopodobieństwem
> 99,9999% (PI > 1 000 000)
PI / PI + 1 = P
Wartość dowodowa analizy
Analiza porównawcza uzyskanego
profilu DNA
niezgodność
zgodność
analiza statystyczna  CZ
STOÅšCI
POPULACYJNE
OPINIA
P r a w d o p o d o b i e Å„ s t w o
przypadkowej zgodności
Wartość dowodowa analizy
prawo Hardy'ego i Weinberga
STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI
STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI
´ð odpowiednio liczna
Częstość występowania różnych
´ð kojarzenie losowe genotypów w populacji jest staÅ‚a
i zależna jedynie od częstości
´ð brak doboru naturalnego
występowania alleli w populacji
´ð brak selekcji, mutacji i migracji
37 | S t r o n a
Wartość dowodowa analizy
Jeżeli allel  a w lokus A ma częstość a, a allel  b w lokus B ma częstość b
HWE w populacji
AA = a2
CZ
STOŚCI GENOTYPÓW BB = b2
AB = 2ab
Wartość dowodowa analizy
ILOCZYN CZ
STOŚCI GENOTYPÓW = CZ
STOŚĆ PROFILU
1 / CZ
STOŚĆ PROFILU = 1 PROFIL NA & .. OSÓB
PRAWDOPODOBIEC
STWO PRZYPADKOWEJ ZGODNOÅšCI
PE  SIA
A WYA

CZENIA tzw. przydatność do badań ojcostwa
Jest to odsetek niesłusznie pozwanych o ojcostwo mężczyzn, którzy zostaną wykluczeni w toku analizy.
PD  SIA
A DYSKRYMINACJI tzw. szansa zróżnicowania osób
Jest to prawdopodobieństwo, że dwie losowo wybrane osoby z populacji nie będą miały takiego
samego zestawu cech.
38 | S t r o n a