10.03.2015 dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka­laboratoryjna­2/protokoly­badan­diagn/labowe­ know­how ­elisa/?print=print
Labowe  know­how : ELISA
Test immunoenzy matyczny ELISA (Enzyme­Linked ImmunoSorbent Assay) jest jednÄ… z najpowszechniejszych metod stosowanych w badaniach diagnostycznych i naukowych.
Jej zadaniem jest wykrycie i oszacowanie stężenia badanego białka poprzez użycie odpowiednich przeciwciał  monoklonalnych lub poliklonalnych. Podstawą metody jest
tworzenie kompleksów antygen­przeciwciaÅ‚o, których wykrycie umożliwia sprzężona reakcja enzymatyczna. Technika zostaÅ‚a po raz pierwszy opisana przez Petera Perlmana i
Eve Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie w roku 1971 i doczekała się licznych modyfikacji.
Mechanizm działania  krok po kroku
1. Do badania używa się płytek, najczęściej polistyrenowych lub
pleksiglasowych (szkło akrylowe). Każda płyta składa się ze studzienek
(dołków), do których nakładane są próbki antygenu (w testach pośrednich
i bezpośrednich) bądz
przeciwciała (w teście kanapkowym i bardziej
złożonych wariantach ELISy). Proces ten nazywany jest opłaszczaniem
fazy stałej i jest niezbędny na początkowym etapie reakcji.
2. Po opłaszczaniu musimy zablokować miejsca niezwiązane z opłaczającym antygenem/przeciwciałem, a niespecyficznie wiążące białka. W tym celu stosujemy czynniki blokujące takie
jak na przykład roztwór owoalbuminy, kazeina (odtłuszczone mleko w proszku), albumina (najczęściej BSA) lub żelatyna.
3. Kolejnym etapem jest dodanie specyficznego dla antygenu przeciwciała lub antygenu (w teście kanapkowym). W tym momencie tworzy się kompleks immunologiczny.
4. By uniknąć niespecyficznego tła reakcji odpłukujemy pozostałe niezwiązane przeciwciała/antygeny.
5. W testach wymagających dodania przeciwciał drugorzędowych wykonujemy kolejną inkubację i odpłukiwanie.
6. Po dodaniu do każdej studzienki odpowiedniego substratu chromogennego dla enzymu, dochodzi do reakcji enzymatycznej, co charakteryzuje się powstaniem barwnego produktu.
Intensywność koloru jest sczytywana spektrofotometrycznie przy odpowiedniej długości fali (obecnie stosuje się automatyczne czytniki) i porównywana z krzywą wzorcową, sporządzaną
dla znanych stężeń antygenu.
elisa 2
ELISA to najpopularniejsza technika immunoenzymatyczna stosowana w diagnostyce i badaniach
naukowych
Znakowanie przeciwciał: do znakowania przeciwciał używa się najczęściej peroksydazy chrzanowej, rzadziej fosfatazy
alkalicznej, oksydazy glukozowej czy beta­galaktozydazy. Każdy z tych enzymów katalizuje in vitro przeksztaÅ‚cenie
substratu w barwny produkt. Enzymy są koniugowane z przeciwciałem i w tej formie sprzedawane przez producentów.
SprzÄ™ganie może być kowalencyjne (mostki disiarczkowe), poprzez Å‚Ä…czniki dekstranowe lub wiÄ…zanie streptawidyna­
biotyna.
Rodzaje testów
" Bezpośredni test ELISA
­ jest to bardzo szybka metoda wykrycia obecnoÅ›ci antygenu, aczkolwiek droga i dziÅ› prawie już nie stosowana. Z fazÄ… staÅ‚Ä… wiÄ…zany jest antygen, natomiast specyficzne przeciwciaÅ‚o,
skoniugowane z enzymem znajduje się w roztworze. Konieczność koniugowania z enzymem każdego przeciwciała z osobna spowodowała, że metoda została wyparta przez techniki
pośrednie.
" Pośredni test ELISA
­antygen opÅ‚aszczajÄ…cy pÅ‚ytkÄ™ wykrywany jest przez swoiste, nieznakowane
przeciwciało i tworzy z nim kompleks immunologiczny. W kolejnym etapie
do studzienek dodawane są skoniugowane z enzymem przeciwciała
drugorzędowe, nacelowane na część stałą łańcucha przeciwciała
pierwszorzędowego. Jest to genialne posunięcie, pozwala bowiem na dowolny
dobór przeciwciał drugorzędowych, które są uniwersalne dla organizmu, z
którego pochodzÄ… przeciwciaÅ‚a pierwszorzÄ™dowe. Tak wiÄ™c przeciwciaÅ‚o anty­
królicze wykryje każde przeciwciaÅ‚o królicze, a anty­mysie, każde przeciwciaÅ‚o
mysie. Jest to typowy test ELISA używany w badaniach naukowych oraz w
badaniach jakościowych. Metoda nie grzeszy jednak czułością, dlatego została
udoskonalona w postaci testu typu Sandwich.
" Test kanapkowy (sandwich ELISA)
­sÅ‚uży przede wszystkim do wykrywania i iloÅ›ciowego oznaczania interesujÄ…cego nas antygenu w diagnostyce medycznej. Tym razem w fazie staÅ‚ej znajduje siÄ™ przeciwciaÅ‚o monoklonalne
 zerowego rzędu . Z nim łączy się antygen, a następnie po jego odpłukaniu używa się przeciwciała pierwszorzędowego  także monoklonalnego,ale nakierowanego na inny epitop badanego
białka. Pozwala to na maksymalne zwiększenie specyficzności reakcji. Zwiększenie czułości zapewnia przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem.
Zalety metody
ELISA jest z pewnością jedną z najważniejszych technik immunoenzymatycznych. Jej zalety to wysoka czułość, duża przepustowość, możliwość półautomatyzacji, a przede wszystkim
wynik ilościowy. ELISA w rutynowej diagnostyce znalazła zastosowanie głównie w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej (wykrywanie i monitoring leczenia patogenów),
http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka­laboratoryjna­2/protokoly­badan­diagn/labowe­%E2%80%9Eknow­how%E2%80%9D­elisa/?print=print 1/2
10.03.2015 dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka­laboratoryjna­2/protokoly­badan­diagn/labowe­ know­how ­elisa/?print=print
immunologii i serologii (wykrywanie przeciwciał i autoprzeciwciał),
toksykologii, onkologii, a także w przemyśle (typowanie szczepów,
wykrywanie zanieczyszczeń grzybowych produktów spożywczych) i rolnictwie.
Literatura
1. Lequin R (2005), Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme­linked
immunosorbent assay (ELISA), Clin. Chem. 51 (12): 2415 8.
doi:10.1373/clinchem.2005.051532
2. S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel
(October 2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in
Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879
84. PMC 2562869. PMID 18772478.
Paulina KÅ‚os­Wojtczak, Marzena Pieronkiewicz
http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka­laboratoryjna­2/protokoly­badan­diagn/labowe­%E2%80%9Eknow­how%E2%80%9D­elisa/?print=print 2/2