TECHNIKA NORTHERN http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab2.html
TECHNIKA NORTHERN
(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji
określonego fragmentu RNA.
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie RNA z komórek i tkanek.
Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10-5 mg RNA. 80-85% stanowią
rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozostałe 10-15% to różne rodzaje
małocząsteczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczególne klasy RNA mają
określoną wielkość i można je izolować w stosunkowo czystej formie za pomocą
technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gęstości czy chromatografia
jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% całkowitej ilości RNA w komórce.
Komórki wszystkich organizmów zawierają rybonukleazy - enzymy biorące udział w
różnych procesach związanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymać
niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywujÄ…cy RNazy np. DEPC
(dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i
sprzęt , który ma bezpośredni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w
odpowiedni sposób ponieważ RNazy wytrzymują gotowanie i autoklawowanie. Jest to
ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubacjÄ™ preparatu z proteinazÄ… K ,
traktowanie tiocyjanianem guanidyny , który denaturuje białka czy
merkaptoetanolem , który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się preparat przed
RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest dość podobna do
izolacji DNA.
Bardzo często interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty
oddziela siÄ™ go metodÄ… chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo
mRNA ma 3` końcu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarność
A=T. Wewnątrz kolumny znajduje się złoże (celuloza , sefaroza) z przyłączonymi na
powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnę przepuszczany jest roztwór
całkowitego RNA. Adsorbcji ulegną tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przepłyną przez
kolumnę. Następnie po przeprowadzeniu przez kolumnę specjalnego buforu
powodującego odłączenie mRNA od złoża , otrzymujemy u wylotu spływający
roztwór oczyszczonego mRNA.
1 z 3 2010-04-04 13:28
TECHNIKA NORTHERN http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab2.html
2. Elektroforeza RNA w żelach.
Z uwagi na silnÄ… tendencjÄ™ RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i
trzeciorzędowych , które w znaczący sposób mogą wpływać na migrację cząsteczek
w żelu , powodując tym samym rozdział uzależniony nie tylko od wielkości (czego
chemy uniknąć) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturujących.
Najczęściej do tego celu stosuje się mocznik , formaldehyd , formamid lub środki ,
które powodują odwracalną chemicznie modyfikację znoszącą odziaływania
2 z 3 2010-04-04 13:28
TECHNIKA NORTHERN http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab2.html
prowadzące do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztwór glioksalu.
Elektroforeza może być przeprowadzana w żelach agarozowych lub akrylamidowych.
3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).
Technika nie różni się zasadniczo od Southern blot.
4. Hybrydyzacja z sondą i odpłukiwanie.
Aby nie narażać RNA na wysokie temperatury stosuje się w roztworze
prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukować
temperaturÄ™ do 42°C. Warunki te sÄ… odpowiednie dla hybrydyzacji kwasów o peÅ‚nej
homologii. W samej procedurze nie ma znaczących różnic w porównaniu z
poprzedniÄ… technikÄ….
5. Autoradiografia. Możliwa jest ilościowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie
np. przy porównywaniu ilości poszczególnych mRNA w komórce w różnych
warunkach.
TECHNIKA SOUTHERN
TECHNIKA WESTERN BLOT
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster
3 z 3 2010-04-04 13:28