Oczyszczanie i badanie
funkcji białek
Sekwencjonowanie białek  metoda Edman a
1. Wiązanie N-końcowej grupy aminowej białka
z odczynnikiem Edmana (fenyloizotiocjanian-PITC); powstaje
fenylotiokarbamylowa pochodna peptydu
Oderwanie N-końcowego aminokwasu jako pochodnej
" Przeprowadzenie niestabilnej pochodnej w bardziej stabilnÄ…
fenylotiohydantoinÄ™
1. Rozdział metodą chromatografii HPLC
i identyfikacja w oparciu o wzorce
Sekwencjonowanie białek
Sekwencjonowanie białek
Izolacja białek
Metody rozdzielania białek
Selektywna precypitacja
Chromatografia
jonowymienna
filtracja na żelu
chromatografia powinowactwa
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
SDS-PAGE
z ogniskowaniem izoelektrycznym
dwuwymiarowa
Selektywna precypitacja
Opiera się na różnicach w rozpuszczalności białek. Rozpuszczalność
zależy od względnej równowagi między oddziaływaniami białko-
rozpuszczalnik, które utrzymują białko w stanie rozpuszczonym i
oddziaływaniami białko-białko, które powodują agregację i strącanie
białek. Siła jonowa roztworu decyduje o tym, który typ oddziaływań
dominuje.
Precypitacja siarczanem amonu
Niska siła jonowa (niskie stężenie siarczanu amonu)  sprzyja
oddziaływaniom białko-rozpuszczalnik; białka pozostają w roztworze
Wysoka siła jonowa (duże stężenie siarczanu amonu)  sprzyja
oddziaływaniom białko-białko, białka agregują i wytrącają się
Stopniowe dodawanie siarczanu amonu do ekstraktu białkowego prowadzi do
selektywnej precypitacji różnych typów białek. Białka niepożądane są odrzucane
Proces jest powtarzany dopóki nie wytrącimy frakcji białek, która nas interesuje.
Wytrącone białka mogą zostać ponownie rozpuszczone.
Chromatografia; zasady ogólne:
Mieszanina białek jest frakcjonowana w trakcie ruchu przez porowate
podłoże. Białka oddziałują z dwoma fazami: mobilną 
rozpuszczalnikiem i stałą  podłożem. Podłoże zawiera miejsca wiązania
białek. Wiązanie pojedynczych białek do podłoża opóz
nia ich ruch. Im
większe powinowactwo białka do podłoża tym wolniej wędruje przez
złoże podczas chromatografii.
Chromatografia kolumnowa
Złoże upakowane w kolumnie. Rozpuszczalnik przechodząc przez
kolumnę porywa cząsteczki białka (ruch w dół kolumny)
Chromatografia cienkowarstwowa
Cienka warstwa złoża naniesiona na płytkę szklaną lub celuloidową
Rozpuszczalnik wędruje ze zbiornika do góry płytki
Białka o najmniejszym powinowactwie do złoża wędrują z czołem
rozpuszczalnika
Chromatografia jonowymienna
Podstawą rozdziału są różnice w ładunku elektrycznym. Całkowity ładunek białka
zależy od sumy ładunków poszczególnych aminokwasów i zależy od pH. Punktem
izoelektrycznym białka nazywamy pH w którym białko jest neutralne
Filtracja na żelu
Rozdział względem masy molekularnej
Chromatografia powinowactwa
Wykorzystuje zdolność białek do swoistych oddziaływań:
Enzymów z ich substratami
Receptorów z ligandami
Przeciwciał z antygenami
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
(Polyacrylamide gel electrophoresis - PAGE)
Szybkość wędrówki białka w trakcie elektroforezy zależy od jej zdolności do ruchu w polu
elektrycznym. Jest najpowszechniej stosowaną metodą charakteryzowania preparatów
białkowych.
Czynniki wpływające na ruch cząsteczek białkowych:
Wielkość cząsteczki (większe wędrują wolniej)
Kształt cząsteczki (globularne wędrują szybciej niż wydłużone, fibrylarne)
Gęstość ładunku elektrycznego
Stężenie akrylamidu (większe stężenie - rozdział małych cząsteczek)
Elektroforeza w obecności SDS
(Sodium dodecyl sulfate PAGE)
Rozdział na podstawie masy molekularnej. Negatywnie naładowane cząsteczki SDS wiążą się z
białkami powodując rozwinięcie ich struktury drugo i trzeciorzędowej (denaturację) i przybranie
podobnego pałeczkowatego kształtu.
Elektroforeza białek
w warunkach denaturujÄ…cych:
próby oraz bufor zawierają odczynnik
denaturujący białko (np. SDS lub mocznik)
Nanoszenie próby
Przykład wyniku elektroforezy białek w
obecności SDS; zdjęcie zabarwionego
żelu
M. Marker białkowy
1. Ekstrakt z hodowli
2. Oczyszczone białko
Elektroforeza z ogniskowaniem w punkcie
izoelektrycznym
(Isoelectric focusing)
Rozdział oparty o ładunek elektryczny cząsteczek.
Przygotowywany w rurkach żel zawiera mieszaninę amfolitów 
polimerów o różnej zawartości dodatnio naładowanych grup aminowych
i ujemnie naładowanych grup karboksylowych.
W polu elektrycznym amfolity przemieszczają się (dodatnio naładowane
w stronÄ™ katody, ujemnie w stronÄ™ anody) i wytwarzajÄ… gradient pH.
W trakcie ruchu w żelu białka oddziałują z amfolitami (oddziaływania
elektrostatyczne). Białka przestają migrować kiedy w żelu napotykają
miejsce, w którym pH jest równe ich punktowi izoelektrycznemu.
Gradient pH  wytworzony przez amfolity
Białka zatrzymują się podczas elektroforezy w miejscu żelu
gdzie pH =punktowi izoelektrycznemu
Elektroforeza dwukierunkowa
Kombinacja elektroforezy z ogniskowanie izoelektrycznym i elektroforezy klasycznej
W pierwszym kierunku białka
rozdzielane sÄ… w rurkach 
elektroforeza z ogniskowaniem w
punkcie izoelektrycznym
Żel wyjęty z rurki układany jest na
starcie żelu dwuwymiarowego
W drugim kierunku SDS-PAGE
rozdział względem masy
molekularnej
Identyfikacja białek
Białka są identyfikowane przy użyciu przeciwciał
Przeciwciała:
poliklonalne
monoklonalne
Badanie funkcji biologicznej makromolekuł
Systemy ekspresyjne
Białka fuzyjne (rekombinacyjne)
Badanie oddziaływań białko-DNA
Białka reporterowe  badanie funkcji sekwencji regulatorowych DNA
Oddziaływania białko-białko
Systemy ekspresyjne
prowadzą do namnożenia
białka w oparciu o
sklonowanÄ… sekwencjÄ™
Biblioteki i systemy
ekspresyjne
" Biblioteki ekspresyjne sÄ… podobne do tradycyjnych bibliotek genomowych za
wyjątkiem tego, że dzięki zastosowaniu wektorów umożliwiających transkrypcję i
ekspresję białka w bakteriach szuka się kolonii w których zachodzi ekspresja
interesującego nas białka.
" KonstruujÄ…c bibliotekÄ™ ekspresyjnÄ… cDNA umieszcza siÄ™ w wektorach
ekspresyjnych.
" Do detekcji używa się przeciwciał, które służą wykryciu kolonii produkującej
interesujące nas białko.
" Podstawowa trudność polega na uzyskaniu bibliotek w których wszystkie cDNA
ulegajÄ… ekspresji.
" Jedną z metod pozwalających na pokonanie problemu jest zbudowanie genów
kodujących białka fuzyjne
Systemy ekspresyjne
W bakteriach E.coli
W bakteriach Bacillus subtilis
W drożdżach Sacharomyces cerevisiae
W komórkach insektów (system
bakulowirusowy)
W komórkach ssaków
Czynniki wpływające na wybór
systemu ekspresyjnego
Wielkość białka, które chcemy otrzymać
białka <100 reszt aminokwasowych najłatwiej produkować w
E.coli w postaci rozpuszczalnych białek fuzyjnych
większe białka są zwykle nierozpuszczalne i tworzą tzw. ciałka
inkluzyjne
Ilość białka, której potrzebujemy
dla otrzymania niewielkiej ilości białka np. dla sprawdzenia
wpływu mutacji na aktywność system standardowy E.coli
przy potrzebnych większych ilościach nie ma reguł i dobór
wektorów i system trzeba sprawdzać doświadczalnie
Aktywność białka
Jeśli nie potrzebujemy aktywnego białka (np. do otrzymania
przeciwciał) to możemy je izolować z ciałek inkluzyjnych w
systemie bakteryjnym E.coli
białka do badań biochemicznych i komórkowych często
wymagają eukariotycznych systemów ekspresyjnych
Wektory ekspresyjne dla systemów
bakteryjnych
" Wektory z promotorami indukowanymi IPTG (oparte na
operonie lac)
" Wektory zawierajÄ…ce promotor bakteriofaga T7
" Wektory zawierajÄ…ce promotor pL bakteriofaga 
Wektory zawierajÄ… polilinker (miejsca restrykcyjne do
klonowania) początek replikacji, gen odporności na antybiotyk.
Polilinker jest często usytuowany w obrębie genu reporterowego
dając możliwość stworzenia genu fuzyjnego.
Białka fuzyjne (rekombinowane/hybrydowe)
" Powstają z połączenia w klonowaniu dwóch lub więcej
otwartych ramek odczytu (gen fuzyjny)
" Ekspresja genu fuzyjnego daje białko hybrydowe w którym
interesujące nas białko jest połączone wiązaniem
peptydowym z innym białkiem nośnikowym
" Dodanie białka nośnikowego może poprawiać
rozpuszczalność, chronić przed degradacją w systemie
bakteryjnym, ułatwiać oczyszczanie i detekcję, kierować do
określonych kompartmentów w komórce eukariotycznej
Wektory do konstrukcji białek fuzyjnych
pUC, pBluescript, ²- galaktozydaza
pSK
Seria pGEX Transferaza
glutationu
Seria pMAL Białko wiążące
maltozÄ™
pTrx, pTrxFus Tioredoksyna
Seria pET Poli-histydyna
pTA1529 Fosfataza alkaliczna
Oczyszczanie białek fuzyjnych
Oddziaływania
wykorzystywane przy
oczyszczaniu białek
fuzyjnych:
enzymy z ich substratami
receptory z ligandami
przeciwciała z antygenami
Warunki oczyszczania białek fuzyjnych
Białko Ligand używany w Bufor elucyjny
nośnikowe(fuzyjne) izolacji
²- galaktozydaza APTG (p -aminofenylo Boran sodowy
²-D- tiogalaktozyd)
Transferaza glutationu glutation Zredukowany glutation
Białko wiążące maltozę Amyloza Maltoza
Poli-histydyna Immobilizowany Zn2+ Bufor o rosnÄ…cej
lub Ni2+ kwasowości
Acetylotransferaza Sefaroza ze chloramfenikol
chloramfenikolu zwiÄ…zanym
chloramfenikolem
Domena wiÄ…zania celuloza woda
celulozy
Białko zawierające His-tag: izolowanie
Metody cięcia białek fuzyjnych
Metody Przecinana sekwencja
aminokwasowa
Chemiczne:
bromek cjanogenu i kwas -Met
mrówkowy
Kwas mrówkowy i
-Asp Pro-
temperatura
Hydroksylamina, pH 9 i
-Trp
temperatura
Enzymatyczne:
Klostripaina -Arg i -Lys-Arg
Kolagenaza -Pro-Val Gly-Pro
Enterokinaza -Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
Renina -Pro-Phe-His-Leu Leu
Trypsyna -Arg lub -Lys
Ekspresja w komórkach eukariotycznych
Cele:
Namnożenie aktywnego białka
Badanie funkcji białka
Badanie funkcji regulatorowych sekwencji DNA
Podejścia:
Transfekcja przejściowa
Transfekcja stabilna
Metody transfekcji komórek eukariotycznych
Metoda Toksycznoś Zasada działania
ć
Lipidy Zróżnicowana Użycie lipidów kationowych (liposomoów), które
wiążą DNA i jako stabilne kompleksy wbudowują się
w błonę komórkową
Fosforan Nie Nierozpuszczalne ko-precypitaty DNA z fosforanem
wapnia wiążą się z błoną komórkową i są absorbowane
przez endocytozÄ™
DEAE-dextran Toksyczna DNA tworzy agregaty z dodatnio naładowanym
DEAE dextranem i sÄ… absorbowane prawdopodobnie
przez endocytozÄ™
Elektroporacja Nie Tworzenie porów w błonach komórkowych przez
działanie pusowe pola elektrycznego
Biolistyka Nie DNA jest wiązany do małych cząsteczek tungstenu
lub złota i wprowadzany do komórek razem z nimi
przy użyciu akceleratora
Polibren Zróżnicowana Użycie polikationu do wprowadzania małych
cząsteczek DNA do komórek opornych na inne
metody
Metody badania funkcji białek i sekwencji DNA
" Identyfikacja białek tworzących swoiste kompleksy z DNA;
metoda  opóz
nienia w żelu (gel retardation)
" Identyfikacja sekwencji DNA, które tworzą w komórkach
swoiste kompleksy z białkami; metoda  footprinting
" Badanie funkcji regulatorowych sekwencji DNA przy użyciu
genów  reporterowych
Metoda  zmiany ruchliwości elektroforetycznej
(EMSA)
Do tej metody można też zastosować przeciwciała, które identyfikują białko obecne w
kompleksie z DNA i powodują dalszą zmianę ruchliwości elektroforetycznej
kompleksu (supershift)
przeciwciało
super
shift