Rola tlenku azotu w reakcji immunologicznej ustroju Dr n.med. Barbara Lewko ZakÅ‚ad Immunopatologii AMG Co to jest tlenek azotu? Co to jest tlenek azotu? 1772- odkryty przez Josepha Priestly a, badajÄ…cego skÅ‚ad powietrza Do koÅ„ca lat siedemdziesiÄ…tych znany głównie jako nieorganiczny, szkodliwy dla Å›rodowiska produkt cywilizacji: SkÅ‚adnik spalin samochodowych, dymu tytoniowego, smogu truje Å›rodowisko Katalizuje przemianÄ™ ozonu do tlenu-zmniejsza warstwÄ™ ozonowÄ… 1980- publikacja (R. Furchgott i J Zawadzki ): NO jest produkowany przez komórki ssaków 1998-Nagroda Nobla : Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad, Potrójny rekordzista: najmniejsza , najprostsza czÄ…steczka biol. aktywna i jedyny znany gaz- przekaznik sygnałów miÄ™dzykomórkowych Różnorodne funkcje, zależnie od komórek docelowych: np. rozszerzenie naczyÅ„, neurotransmisja, niszczenie patogenów Syntetyzowany przez mikroorganizmy, pasożyty, grzyby, roÅ›liny WywoÅ‚uje Å›wiecenie Å›wietlików, hamuje kwitnienie roÅ›lin, itd., itd.. Struktura i wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci NO Struktura i wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci NO 115 pm " Dwuatomowy wolny rodnik, gaz " Stosunkowo trwaÅ‚y (t1/2 ok.3-6s, inne rodniki-nanosekundy) Aatwo przenika przez bÅ‚ony komórkowe, bo jest: rozpuszczalny w H2O i w lipidach bardzo maÅ‚y elektrycznie obojÄ™tny Z jakimi czÄ…steczkami w ustroju reaguje NO? Z jakimi czÄ…steczkami w ustroju reaguje NO? Tlen NO2, NO3 Tiole, głównie cysteina: R-SH + NO. R-S NO (S-nitrozylacja) Metale grup przejÅ›ciowych, np. Fe, Zn Zn np. palce cynkowe w DNA, dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) Fe np. biaÅ‚ka zawierajÄ…ce hem (np. hemoglobina, cytochromy, peroksydazy, cyklaza guanylanowa ), PKG-kinaza biaÅ‚kowaG GTP cGMP PDE-fosfodiesterazy NO KanaÅ‚y jonowe Z anionem ponadtlenkowym (np.eksplozja tlenowa granulocytów) nadtlenoazotyn O=N-O-O- O=N-O-O- jest bardzo reaktywnym , cytotoksycznym metabolitem jest bardzo reaktywnym , cytotoksycznym metabolitem tlenku azotu tlenku azotu t1/2 =1.9s , pH 7.4 Aatwo przenika przez bÅ‚ony fosfolipidowe Silny utleniacz: reaguje z lipidami, biaÅ‚kami, rozrywa wiÄ…zania miÄ™dzy nićmi DNA Główne reakcje z biaÅ‚kami: ONOO- Utlenianie tioli R-SH R-S-OH R-S-S-R Nitracja tyrozyny Receptory! Enzymy! Czynniki transkrypcyjne! NO2 “! Produkcji PGI2 Ä™! Wolnych “! Odpowiedzi na rodników glukokortykoidy tlenowych NO. Nitracja biaÅ‚ek-zmiany funkcji enzymów, kanałów jonowych itp Ä™! produkcji prosta- glandyn Peroksydacja lipidów Przerwanie nici DNA-apoptoza “! Syntezy Nekroza noradrenaliny “!podaży NO “! ZdolnoÅ›ci do rozkurczu naczyÅ„ Bodzce mechaniczne, hipoksja, trombina, acetylocholina i in. Czynniki prozapalne e,nNOS Ca2+ Gen iNOS NO Leki uwalniajÄ…ce NO , NO np. nitrogliceryna ONOO SH cGMP NO dziaÅ‚a w sposób parakrynny (najczęściej) ALE w komórkach ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego (MÅš, DC, NK) obserwuje siÄ™ też dziaÅ‚anie autokrynne: autostymulacja i autodestrukcja Synteza tlenku azotu Synteza tlenku azotu " NO jest syntetyzowany z L-argininy " Reakcja jest katalizowana przez enzym syntazÄ™ tlenku azotu (NO Synthase, NOS) " W reakcji niezbÄ™dna jest obecność kofaktorów: NADPH, FAD, BH4 BH4, FAD, FMN COO- COO- COO- + O2 +H3 C H +H3 C H NADPH NAD+ +H3 C H + NO N N N (CH2)3 (CH2)3 (CH2)3 NOS NOS NH NH NH + C NH2+ C N OH C H H2N H2N O NH2 L-Arg N-É-Hydroxyarginina Cytrulina Syntazy tlenku azotu Syntazy tlenku azotu (NO Synthases, NOS) (NO Synthases, NOS) Konstytutywne Å›ródbÅ‚onkowa, eNOS=NOS1 neuronalna nNOS=NOS3 Indukowana iNOS=NOS2 Konstytutywne Indukowana eNOS nNOS iNOS Ekspresja de novo indukowana przez StaÅ‚a ekspresja w komórkach LPS, cytokiny, glikolipidy prÄ…tków, RNA o podwójnej nici (wirusy) Ca2+/kalmodulina niezależna od Ca2+ krótkotrwaÅ‚a aktywnoÅ›c AktywnoÅ›c wielogodzinna pM (10-12 mol/l) nM (10-9 mol/l) glukokortykoidy nie wpÅ‚ywajÄ… aktywacja hamowana przez glukokortykoidy* regulacja procesów fizjologicznych Stany zapalne, obrona przed patogenami * hamowanie iNOS możliwe tylko na zasadzie zapobiegania indukcji. Aktywowana iNOS produkuje w sposób ciÄ…gÅ‚y duże iloÅ›ci NO Efekty NO zależą od lokalnego stężenia Efekty NO zależą od lokalnego stężenia eNOS, nNOS iNOS Niskie stężenie NO wysokie stężenie NO Czynniki Deaminacja transkrypcyjne DNA “! proliferacji, Zmiana ekspresji biaÅ‚ek, np. cytokin apoptoza, nekroza hemoproteiny Nitracja (Tyr-NO2) “!podaży O2, blok. Å‚aÅ„cucha oddech.hipoksja, apoptoza Zmiany aktywn. enzymów, Rozpuszczalna receptorów i in. Nitrozylacja cyklaza (Cys-NO) guanylanowa rozszerz. Zmiany mięśni wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci biaÅ‚ek gÅ‚adkich, enzymy, biaÅ‚ka “!agregacji transkrypcyjne, pÅ‚ytek, podaż glutationu. “!adhezji leukocytów JakÄ… rolÄ™ peÅ‚ni NO w ustroju? JakÄ… rolÄ™ peÅ‚ni NO w ustroju? " Tlenek azotu ma wiele różnych funkcji, które można podzielić na główne kategorie: NO w ukÅ‚adzie nerwowym (neuroprzekaznik, pamięć dÅ‚ugotrwaÅ‚a) NO w ukÅ‚adzie krążenia (agregacja pÅ‚ytek, ciÅ›nienie krwi kurczliwość mięśnia sercowego) NO w ukÅ‚adzie mięśniowym (mięśnie gÅ‚adkie: filtracja nerkowa, perystaltyka, ukÅ‚ad oddechowy, erekcja, poród) NO w ukÅ‚adzie hormonalnym (Ä™!sekrecji amylazy, “! Ä™! syntezy i dziaÅ‚ania AngII, “! Ä™! syntezy i dziaÅ‚ania katecholamin ) NO w ukÅ‚adzie odpornoÅ›ciowym (immunostymulacja: aktywacja i róznicowanie limfocytów T, Ä™!cytokin, “!proliferacji patogenów, apoptoza i nekroza i immunosupresja: Ä™!proliferacji wirusów, “! cytokin stymulowanych przez patogeny, “!proliferacji limfocytów, apoptoza i nekroza komórek ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego, Dr Jekyll i Mr Hyde? Dr Jekyll i Mr Hyde? Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Np. alergie, nowotwory, infekcje wirusowe i Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS bakteryjne [posocznica, Cytokiny, LPS, RNA Np. alergie, nowotwory, infekcje wirusowe i bakteryjne [posocznica, drogi apoptoza drogi oddechowe], wirusów, ²-amyloid oddechowe], reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Parkinsona, odrzuty nekroza reumatoidalne zapalenie stawów, choroba ekspresja przeszczepów i wiele innych& Alzheimera, stwardnienie biaÅ‚ek rozsiane, odrzuty proliferacja przeszczepów i wiele innych& NO NF-ºB NF-ºB Komórka ukÅ‚ odpornoÅ›ciowego Komórka docelowa Gen iNOS iNOS iNOS iNOS L-Arg L-Cytr L-Arg L-Cytr Prostaglandyny NO Stan zapalny Cytokiny Stan zapalny NK IL-4 IFNÅ‚ INÅ‚ MÅš Ä™!receptor IL12 NO NO DC IL-12 RÓŻNICOWANIE Tp NO IL-2 TNFÄ… IFNÅ‚ Aktywowane komórki ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego Tp-prekursorowy limf T produkujÄ… NO i jednoczeÅ›nie uruchamiajÄ… DC-kom. dendrytyczna mechanizmy wzmacniajÄ…ce ten proces MÅš-makrofag DC NO jest broniÄ… NO jest broniÄ… MÅš NK obosiecznÄ… obosiecznÄ… NO NO NO NO O2-. granulocyt ONOO- NO powoduje destrukcjÄ™ patogenów ALE te same mechanizmy mogÄ… hamować proliferacjÄ™ limfocytów i sekrecjÄ™ cytokin, a także indukować apoptozÄ™ komórek ukÅ‚adu patogen odpornoÅ›ciowego Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Np. alergie, nowotwory, infekcje wirusowe i Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS Odpowiedz immunologiczna : NO syntetyzowany przez iNOS bakteryjne [posocznica, Cytokiny, LPS, RNA Np. alergie, nowotwory, infekcje wirusowe i bakteryjne [posocznica, drogi apoptoza drogi oddechowe], wirusów, ²-amyloid oddechowe], reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Parkinsona, odrzuty reumatoidalne zapalenie nekroza stawów, choroba przeszczepów i wiele innych& ekspresja Alzheimera, stwardnienie biaÅ‚ek rozsiane, odrzuty przeszczepów i wiele proliferacja innych& NO NF-ºB NF-ºB Komórka ukÅ‚ odpornoÅ›ciowego Komórka docelowa Gen iNOS iNOS iNOS iNOS L-Arg L-Cytr L-Arg L-Cytr Prostaglandyny NO Stan zapalny Cytokiny Stan zapalny Peroksydacja Rozerwanie nici lipidów DNA Uszkodzenie Uszkodzenie bÅ‚on kom. DNA Zniszczenie Utlenienie R-SH Mutacje zasad Pro-miażdżycowy Apoptoza, nekroza OpornoÅ›cna Cytostatyczne apoptozÄ™ cytoliza Regresja nowotw Proliferacja i migracja kom Å›ródbÅ‚onka i nowotw. Progresja Angiogeneza, przerzuty nowotw Rozszerzenie ukrwienie naczyÅ„ “!agreg pÅ‚ytek “!adhezji leukocytów Przeciwmiażdżycowy Funkcje NO w ukÅ‚adzie odpornoÅ›ciowym DziaÅ‚anie zródÅ‚oNO (przykÅ‚ady) Efekty Mechanizmy (przykÅ‚ady) Przeciwbakteryjne Makrofagi, mikroglej, zabijanie lub hamowanie " bezpoÅ›rednio reaguje ze neutrofile, eozynofile, proliferacji patogenów strukturami patogenu fibroblasty, Å›ródbÅ‚onek, (bakterie, wirusy, grzyby, " poÅ›rednio-reakcje z innymi nabÅ‚onek, astrocyty pierwotniaki) czÄ…steczkami sygnalizacji kom. Przeciwnowotworowe makrofagi, eozynofile niszczenie lub hamowanie " hamowanie enzymów (np Å‚aÅ„cuch wzrostu komórek oddechowy, cis-akonitaza, RNaza) nowotworowych " zużycie Arg potrzebnej do wzrostu kom. apoptoza Niszczenie tkanki Makrofagi, mikroglej, nekroza lub zwłóknienie " apoptoza komórek (immunopatologia) astrocyty, keratynocyty, parenchymy " degradacja macierzy mezangiocyty pozakomórkowej " nagromadzanie siÄ™ macierzy Immunosupresyjne/ Makrofagi Hamowanie proliferacji limf. " Apoptoza Limf. T lub komórek przeciwzapalne T i B prezentujÄ…cych Ag Hamowanie syntezy p-ciaÅ‚ " Zahamowanie aktywnoÅ›ci ukÅ‚adu przez limfocyty B CD5+ zgodnoÅ›ci tkank. MHC klasy II Hamowanie aktywacji " Przerwanie szlaków sygnalizacji i leukocytów (adhezji, transkrypcji chemotaksji) " Hamowanie syntezy DNA " Hamowanie ekspresji chemokin Modulacja syntezy i Makrofagi, limf. T, Stymulacja lub hamowanie " Modulowanie szlaków sygnalizacji funkcji cytokin, Å›rodbÅ‚onek, fibroblasty syntezy interleukin, IFNÅ‚, wewnÄ…trzkomórk. chemokin i czynników TGF², TNF, VEGF, MCP-1 " Modulowanie czynników wzrostu: dziaÅ‚anie pro- transkrypcyjnych (NF-ºB. Ap-1) lub przeciwzapalne " Modulowanie prekursorów cytokin Zmiany w limfocytach Makrofagi Indukcja i różnicowanie Th1 " Modulowanie produkcji i Th Hamowanie odpowiedzi sygnalizacji IL-12 komorkowej Th1 i Th2 Znajomość mechanizmu syntezy i dziaÅ‚ania NO Cyklaza jest podstawÄ… projektowania leków Guanylanowa GTP cGMP Fosfodiesteraza cGMP 5 GMP Inhibitory fosfodiesteraz Analogi L-Arg “!podaży L-Arg Modulacja transkrypcji i translacji genu NOS Wychwyt NO Inhibitory cyklazy guanylanowej Inhibitory kofaktorów na podstawie Lori L. Schoonover , 2000 Glukokortykoidy Glukokortykoidy WpÅ‚yw Dex na produkcjÄ™ NO w LPS+ IFNÅ‚ +LPS stymulowanych makrofagach Korhonen R, Mol Pharmacol 2002 GLUK BÅ‚ona komórkowa GRE-sekwencje regulowane przez GLUK “! iNOS (+) stymulujÄ… (n) hamuja ekspresjÄ™ Geny regulowane przez sterydy jÄ…dro Farmakologiczne modulowanie podaży i dziaÅ‚ania NO indukowanego przez czynniki zapalne-c.d. Mechanizm Stosowane Å›rodki (przykÅ‚ady) Efekt Uwagi Inhibitory iNOS NAME, NMMA, N-É-Nitro-Arg Bad. kliniczne ( gÅ‚.posocznica) “!NO Analogi L-Arg aminoguanidyna Skutki uboczne-nadciÅ›nienie, inne cytotoksycznoÅ›c , skuteczne tylko przy wysokich stężeniach Bad. laborat. : schorzenia CUN ,nowotwory Inhibitory Metotrexat Skuteczne, kiedy stosowane PRZED “!NO kofaktorów iNOS N-acetylo-serotonina (NAS) indukcjÄ… iNOS , a to czÄ™sto trudno głównie ihib. BH4 przewidziec Cytotoksyczne Zmiatacze NO BÅ‚Ä™kit metylenowy Bad. kliniczne. Ä™! ciÅ›nienia tÄ™tn. Ä™!oporu “!NO nacz, efekty przemijajÄ… po 1-3 godz “!ekspresji iNOS siRNA (hamowanie translacji Bad. laboratoryjne: “!NO Terapia genowa genów iNOS) Ä™!funkcji wysp trzustki (cukrzyca typu1) “! komplikacji i odrzutów po przeszczepach Inhibitory Rolipram fosfodiesteraz Klinicznie: przeciwdepresyjny Bad.lab:-hamowanie ekspresji iNOS w modelach endotoksemii, uszkodzenia CUN Glukokortykoidy Deksametazon Posocznica-niejednoznaczne efekty Ä™!ekspresji NOS Interferon alfa, gamma Stosowane klinicznie: HBV, HCV, Ä™! NO Stymulacja NK i Interleukiny, TNFÄ… nowotwory makrofagów Badania klin.-nowotwory. Problem: dziaÅ‚anie hipotensyjne