PROCESY MEMBRANOWE
W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM
OPRACOWANIE: P. KRÓLICZAK, T. JANKOWSKI
 Współczesna technologia zna wiele metod oczyszczania produktów, jak np. chromatografię wielko-
składnikową, wytrącanie, krystalizację, wirowanie, destylację, sedymentację i inne. Membranowe techniki
rozdzielania mieszanin przez długi okres czasu traktowane były jako pomocnicze metody separacyjne w skali
laboratoryjnej. Ostatnie lata sprawiły, \
e mo\
liwym stało się stosowanie technik membranowych na du\
Ä… skalÄ™.
Związane to jest z rozwojem chemii tworzyw sztucznych, szczególnie polimerów syntetycznych, z których
zbudowana jest większość wysoce przepuszczalnych i selektywnych membran.
W technologii \
ywności stosuje się z powodzeniem takie odmiany technik membranowych, jak:
mikrofiltracja, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, elektrodializa, nanofiltracja. Korzyści wynikające ze
stosowania wy\
ej wymienionych metod to przede wszystkim:
- mo\
liwość jednoczesnego zagęszczania, frakcjonowania i oczyszczania roztworów
- redukcja do minimum termicznej degradacji składników \
ywności i mikroorganizmów
- niskie zu\
ycie energii
- eliminacja przemian fazowych rozdzielanych składników (jak np. przy destylacji)
- prosta, modułowa budowa urządzeń.
PODSTAWOWE POJ
CIA I PARAMETRY OPISUJ
CE TECHNIKI MEMBRANOWE
Permeat  filtrat; roztwór przenikający przez membranę filtracyjną, zawierający rozpuszczalnik wraz
z cząstkami, które nie zostały zatrzymane na filtrze.
Retentat  roztwór zawierający zatrzymane na filtrze cząstki.
Polaryzacja stÄ™\
eniowa membrany  zjawisko adsorpcji drobin na powierzchni membrany, powodujÄ…ce
zalepianie się por. pod wpływem adsorpcji na powierzchni membrany, powodujące zlepianie się por. pod
wpływem działającego na membranę ciśnienia, zatrzymane na niej cząstki akumulują się tworząc warstwę
\
elową lub tzw. Wtórną membranę. Powoduje to spadek szybkości filtrowania.
Strumień objętości (flux rate)
Wyra\
a objętość otrzymanego permeatu na jednostkę powierzchni filtra. W początkowym etapie
filtracji, gdy filtr nie jest jeszcze zapchany, przyjmuje wartość:
" "
gdzie:
"P  transmembranowa ró\
nica ciśnień
"  - ró\
nica ciśnień osmotycznych filtrowanego roztworu i permeatu
Rg  opór hydraulityczny warstwy \
elu
Rm  opór hydraulityczny membrany.
Poniewa\
ciśnienie osmotyczne dla makromolekuł w roztworze jest bardzo niskie i rośnie dopiero w przypadku
wysokiej koncentracji warstwy \
elowej na membranie, to wzór ma postać:
"
Gdy membrana ulega polaryzacji, tworzy siÄ™ na niej warstwa \
elu, wówczas strumień objętości wyra\
amy jako:
gdzie:
K  współczynnik przenikania masy
Cg  koncentracja warstwy \
elu
Cs  koncentracja filtrowanego roztworu.
Współczynnik odrzucenia R  wyra\
a ilość materiału, który przechodzi przez membranę lub jest przez nią
odrzucany. Gdy R ma wartość równą 1, to 100 % materiału jest odrzucane, gdy wartość ta wynosi 0, to
membrana jest całkowicie przepuszczalna. Wyra\
a to wzór:
2
 /
/
gdzie:
Cf  końcowa koncentracja roztworu w retentacie
C0  poczÄ…tkowa koncentracja roztworu
V0  początkowa objętość roztworu
Vf  końcowa objętość retentatu.
Równanie to jest prawidłowe przy zało\
eniu, \
e retentat jest całkowicie homogenny, co jest jednak warunkiem
do osiągnięcia z powodu tworzącej się na membranie warstwy \
elowej. Wartość współczynnika R jest funkcją
molekularnej wielkości i kształtu rozdzielonych cząstek.
Punkt odcięcia (cut-off)  masa molekularna, przy której co najmniej 90 % cząstek globularnych o tej właśnie
masie jest na danym filtrze zatrzymywane. W wielu przypadkach punkt odcięcia jest właśnie tą wielkością, którą
producent podaje na opakowaniu, jako ró\
nicującą poszczególne filtry.
MODYFIKACJE PROCESÓW MEMBRANOWYCH
Przeciwdziałanie zjawiskom powodującym zanieczyszczenia membran spowodowało du\
y postęp
w dziedzinie konfiguracji modułów membranowych, materiałów membran i optymalizacji dynamiki cieczy
w sąsiedztwie membrany. Wydajność procesów membranowych znacznie się zwiększyła po opracowaniu
systemu wykorzystujÄ…cego przegrody (cross-flow). ZasadÄ™ filtracji stycznej opisuje rysunek:
Jednym z parametrów charakterystycznych dla filtracji stycznej jest ciśnienie transmembranowe, które
przyjmuje tu wartość:
"
2
gdzie:
Pi  ciśnienie na wejściu
P0  ciśnienie na wyjściu
Pf  ciśnienie filtratu
Zaletą tego układu jest stosunkowo wolniejsze ni\
w typowej filtracji zapychanie siÄ™ membrany, a to
dzięki temu, i\
styczny ruch cieczy nieustannie zmywa tworzÄ…cÄ… siÄ™ na powierzchni filtra warstwÄ™
zanieczyszczeń. Wydajność i efektywność procesów membranowych jest dodatkowo polepszana poprzez
niewielkie wymiary przekrojów przepływu zawiesin i roztworów. Zapewnia to burzliwy ruch cieczy i du\
e siły
ścinające na powierzchni membrany. Znane są te\
rozwiązania konstrukcyjne mikrofiltrów z wirującymi
3
powierzchniami filtrujÄ…cymi, a tak\
e układy, w których zachodzi przepływ pulsacyjny lub te\
kierunek
przepływu zawiesiny jest co pewien czas odwracalny tak, aby zakłócić ustalony profil polaryzacji stę\
eniowej
i usunąć cząstki z powierzchni membrany.
RODZAJE FILTRÓW STOSOWANYCH W PROCESACH MEMBRANOWYCH
Filtry stosowane w procesach membranowych są zwykle wykonane z materiałów ceramicznych lub
syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani
te\
w \
aden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór.
Ściany membran filtrów charakteryzują się
anizotropową strukturą, tzn. kanały por rozszerzają się
od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki
temu cząsteczki, które są zatrzymywane przez daną
membranÄ™, zatrzymujÄ… siÄ™ na jej powierzchni i nie
zapychają światła kapilar w jej wnętrzu.
Stosowane są 3 podstawowe typy filtrów:
- płaskie
- spiralne
- kapilarne.
-
Filtry płaskie (flat disc) stosuje się często w konfiguracji z innymi rodzajami separatorów, np. wirowaniem
komórek.
Filtry kapilarne zbudowane sÄ… z wiÄ…zki cienkich rurek umieszczonych w cylindrycznym pojemniku. Ciecz
zawierająca oddzielane cząstki przepływa przez kapilary, gdzie ulega rozdzieleniu: cząsteczki małe przenikają
przez ściany membrany na zewnątrz do przestrzeni między-kapilarnej, zaś cząsteczki du\
e opuszczajÄ… kapilary.
Filtry spiralne zbudowane są z membran nawiniętych spiralnie na cylindryczny przewód odbierający filtrat.
Wybór stosowanej membrany zale\
y od wielu czynników, np. strumienia objętości przepływu, masy
molekularnej odcinanych cząstek, lepkości roztworu, stopnia adsorpcji białek, itp.
PODZIAA
I CHARAKTERYSTYKA PROCESÓW MEMBRANOWYCH
Podział procesów membranowych przedstawiony poni\
ej opiera się na wielkości rozdzielanych w danej
metodzie czÄ…stek za pomocÄ… tradycyjnych metod separacji mo\
na rozdzielić cząstki o wielkości nie mniejszej
ni\
2 µm. Wszystkie mniejsze czÄ…stki mogÄ… być wydzielane z roztworów za pomocÄ… technik membranowych.
Wielkość rozdzielanych cząstek jest podstawą przedstawionego poni\
ej podziału.
Mikrofiltracja (MF)
W mikrofiltracji u\
ywa siÄ™ membran o porach rzÄ™du 0,1-5 µm. Za pomocÄ… mikrofiltracji usuwa siÄ™
z roztworu drobne zawiesiny, komórki bakteryjne, niektóre wirusy, drobiny surowców roślinnych, cząstki
tłuszczu w emulsjach (np. mleka). Wizualnym efektem tego procesu mo\
e być zmiana barwy filtratu, obni\
enie
się mętności, spadek intensywności rozpraszania światła. Głównym zastosowaniem mikrofiltracji jest więc
klasyfikacja roztworów, wydzielanie biomas komórkowych, a tak\
e sterylizacja po\
ywek (tzw. Sterylizacja  na
zimno ).
Siła napędową procesu mikrofiltracji jest ró\
nica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody,
rzędu 0,05-0,5 MPa. Mikrofiltrację prowadzi się często w układzie stycznym (filtracja styczna, ang.  cross-
flow ,  tangential flow , co w większej mierze zapobiega odkładaniu się osadu na powierzchni membrany.
Ultrafiltracja (UF)
Membrany stosowane w ultrafiltracji majÄ… pory rzÄ™du 0,005-0,1 µm (5-100 nm), a ró\
nica ciśnień na
membranie w tym procesie wynosi 0,2-1,0 MPa.
4
Proces UF umo\
liwia jednoczesne frakcjonowanie i zagęszczanie wybranych składników cieczy.
Permeat po UF nie zawiera ju\
białek, polisacharydów, wirusów, niektórych barwników, enzymów i witamin,
natomiast pozostają w nim proste cukry, kwasy organiczne, zdysocjowane jony nieorganiczne i większość
produktów degradacji cieplnej. Mętność ultrafiltratu całkowicie zanika i nie obserwuje się ju\
zjawiska
rozpraszania światła.
Nanofiltracja (NF)
Nanofiltracja to proces, który obejmuje zakres separacji o wymiarach w granicach 0,001-0,005 µm (1-
5 nm). Zatrzymywane są tu aminokwasy, proste cukry, enzymy i niektóre jony. Frakcja ta zawiera więc
większość substancji pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe (cukry i produkty ich rozpadu), substancje
odpowiedzialne za smak i zapach, substancje zabarwiajÄ…ce. Permeat jest jasno zabarwiony, klarowny, zawiera
tylko niektóre sole i cząstki o małej masie cząsteczkowej (np. alkohole).
Sposób separacji składników w procesie NF jest połączeniem przepływu kapilarnego, typowego dla MF
i UF, z mechanizmem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, charakterystycznym dla odwróconej osmozy (RO).
Membrany nanofiltracyjne posiadają ró\
ne zakresy selektywności, począwszy od przegród o wysokiej
nieprzepuszczalności dla NaCl, poprzez membrany wybiórczo zatrzymujące niektóre jony, do takich, które
zatrzymują cząsteczki kwasów.
Odwrócona osmoza (RO)
Proces ten przebiega na membranach o Å›rednicy por 0,0001-0,001 µm (0,1-1,0 nm). Przez takÄ…
przegródkę przenika wyłącznie rozpuszczalnik, tak więc RO mo\
e być uwa\
ana bardziej za proces zagęszczania
ni\
separacji. Przepływ rozpuszczalnika następuje przeciwnie do ciśnienia osmotycznego, tote\
, aby proces RO
mógł zajść musi być wytworzona du\
a ró\
nica ciśnień po obu stronach membrany, rzędu 1-10 MPa. Mechanizm
selektywnego działania membran RO tłumaczy się modelem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, gdzie znaczenie ma
powinowactwo membrany i składników roztworu oraz szybkość ich transportu w membranie. Składniki
o większym powinowactwie do materiału membrany, rozpuszczają się w niej łatwiej od innych składników,
a membrana spełnia funkcję fazy ekstrakcyjnej. W dalszym etapie procesu zachodzi transport składników
w membranie na zasadzie dyfuzji molekularnej, zaś ró\
nice w dyfuzyjności danego składnika decydują
o przepuszczalności membrany. Selektywność membran RO jest więc połączonym efektem rozpuszczalności
i dyfuzyjności składników zagęszczonego roztworu.
Membrany stosowane w RO majÄ… strukturÄ™ niesymetrycznÄ…, z warstewkÄ… selektywnÄ… o submikronowej
grubości, wykonaną najczęściej z octanu i innych estrów celulozy oraz z poliamidów, naniesioną na 2-gą,
grubszą warstwę podporową o większej porowatości.
Proces RO stosuje siÄ™ od wielu lat na du\
ą skalę do otrzymywania wody pitnej z wód morskich i wód
zasolonych oraz do uzdatniania wody w przemyśle farmaceutycznym i elektronicznym.
Perwaporacja (PV)
Perwaporacja pozwala na rozdzielenie ciekłej mieszaniny z częściowym jej odparowaniem  permeat
występuje w postaci pary.
Membrany stosowane w PV mają porowatość podobną jak w RO, a transport masy zachodzi na zasadzie
mechanizmu sorpcyjno-dyfuzyjnego. Tak więc, po 1 stronie membrany następuje adsorpcja i rozpuszczanie się
składników danego roztworu; następnie rozpuszczone cząsteczki dyfundują w membranie i z jej strony ulegają
desorpcji ( odparowaniu ).
Efekt rozdzielania składników roztworu wynika, podobnie jak w RO, z ró\
nic sorpcji i rozpuszczalności
w membranie. Ró\
nice te są natomiast efektem specyficzności oddziaływań układu membrana-ciecz lub te\

wynikiem uprzywilejowanej sorpcji czÄ…stek o mniejszym rozmiarze.
Praktyczne zastosowanie procesu perwaporacji zmierza do zastÄ…pienia tym procesem konwencjonalnej
destylacji.
Elektrodializa (ED)
Elektrodializa to proces membranowego rozdzielania roztworów ciekłych, których składniki jonowe
(sole, kwasy, zasady) przenikają przez membrany pod wpływem ró\
nicy potencjałów zewnętrznego pola
elektrycznego. W procesie tym membrany sÄ… jonowymienne, majÄ… albo Å‚adunek dodatni (przepuszczalne dla
anionów  anionity), albo ładunek ujemny (przepuszczalne dla kationów - kationity). Kationity wytwarzane są
poprzez fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w cienkich foliach wykonanych z polimerów, grup
sulfonowych o właściwościach silnie kwaśnych lub grup karboksylowych o właściwościach słabo kwaśnych.
5
Anionity natomiast mają unieruchomione grupy amoniowe, silnie zasadowe lub słabo zasadowe grupy aminowe
czy te\
fenolowe. W ostatnich opracowano ju\
membranÄ™ dwupolarnÄ…, umo\
liwiajÄ…cÄ… elektrodializÄ™
w pojedynczej membranie.
Proces ED ma zastosowanie do odsalania morskiej oraz uzdatniania wody technologicznej, a tak\
e
do innych procesów demineralizacji.
Omówione wy\
ej procesy membranowe przedstawiono na schemacie, uwzględniając wymiarowe
spektrum ró\
nych substancji występujących w ciekłych artykułach \
ywnościowych.
ZASTOSOWANIE PROCESÓW SEPARACJI MEMBRANOWEJ W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM
Procesy membranowe sÄ… w technologii \
ywności atrakcyjną alternatywą do tradycyjnie stosowanych
metod separacyjnych, a to ze względu na niedestrukcyjne oddziaływanie na produkt i niskie zu\
ycie energii.
W tabeli zestawiono przykłady zastosowania procesów membranowych w ró\
nych działaniach
towarzyszÄ…cych produkcji \
ywności.
Zastosowanie Produkt Proces membranowy
Piwo, wino, mleko, moszcze,
 Zimna sterylizacja MF
po\
ywki fermentacyjne
Klarowanie Piwo, wino, soki owocowe MF, UF
Białka, soki owocowe, kawa,
Zagęszczanie UF, RO
barwniki, enzymy
Usuwanie alkoholu Piwo, wino RO, PV
Białka, węglowodany, produkty
Frakcjonowanie UF, RO
biotechnologii
Kwas mlekowy, kwas cytrynowy,
Odzysk produktu UF, ED, PV
ocet, alkohol etylenowy
Poprawa jakości produktu Substancje smakowo-zapachowe RO, PV
Odsalanie, demineralizacja Woda, serwatka RO, NF, ED
Przemysł mleczarski
Pierwsze zastosowania procesów ultrafiltracji w mleczarstwie dotyczyły utylizacji serwatki. Serwatkę
najpierw poddawano procesowi UF, w którym oddzielano frakcję białkową, a następnie RO, otrzymując
zagęszczony roztwór laktozy oraz permeat o niskim BZT. Korzyści wynikające zatem ze stosowania procesów
membranowych, w tym przypadku polegajÄ… na mo\
liwości otrzymywania 30-80 % koncentratów białkowych
pozbawionych laktozy, zagęszczonego do ok. 25 % roztworu laktozy, a przy tym powstający ściek ma niskie
BZT.
Stosując dalej odpowiednio dobrane membrany, białka mo\
na jeszcze rozdzielić na Ä…-laktoalbuminÄ™ i ²-
laktoglobulinÄ™, laktoferynÄ™, laktoperoksydazÄ™ i glikomakropeptyd.
6
Frakcjonowanie białek serwatkowych w procesie UF
W serowarstwie powszechną praktyką jest wstępne zagęszczanie mleka przy u\
yciu UF, poprzedzajÄ…ce
koagulację. Poprzez to wartość od\
ywcza sera jest wy\
sza dzięki wzbogaceniu go w białka, witaminy i niektóre
substancje mineralne, tracone w serwatce w tradycyjnym procesie.
Wa\
nÄ… zaletÄ… technik membranowych jest mo\
liwość  zimnej sterylizacji. Mleko poddawane
procesowi MF jest nikrobiologicznie czyste i nie jest wówczas wymagana typowa pasteryzacja. Pojawiają się
jednak doniesienia mówiące o tym, \
e przy stosowaniu membran, które pozwalają na zachowanie przez mleko
wszystkich jego białkowych składników, w permeacie zostaje część drobnoustrojów.
Przemysł owocowo-warzywny
W przemyśle tym procesy membranowe stosuje się do klarowania i zagęszczania soków, moszczów
oraz wina, do wydzielania substancji aromatycznych z ekstraktów owocowych, do zagęszczania barwników
roślinnych oraz do usuwania alkoholu z wina.
Dzięki technologiom membranowym mo\
na wyeliminować tak ucią\
liwe procesy jak filtracja przy
u\
yciu ziemi okrzemkowej, bentonitu, zolu krzemionkowego i \
elatyny. Jednocześnie, stosując instalacje
membranowe, mniejsza jest powierzchnia produkcyjna, mniejsze jest zu\
ycie energii czy te\
preparatów
enzymatycznych.
Połączone systemy UF i RO stosowane do odzyskiwania substancji aromatycznych zawartych
w skórkach owoców cytrusowych, w du\
ej mierze wpływają na lepszą jakość produktu i wydajność procesu.
UltrafiltracjÄ™ stosuje siÄ™ te\
do pozyskiwania i zagęszczania naturalnych barwników tj. antocyjany i betanina.
Zawartość tych składników w roztworach wodnych jest bardzo niska (ok. 0,1 %), a w przewadze występują
pektyny, białka i cukry. W tradycyjnym procesie sok lub ekstrakt jest filtrowany, zagęszczany na wyparkach i
suszony rozpyłowo. Natomiast ju\
jednokrotna UF pozwala 2-krotnie zwiększyć zawartość barwników a suchej
masie.
W produkcji winiarskiej zastosowanie MF i UF moszczów lub gotowego wina zapewnia z jednej strony
usunięcie niepo\
ądanej mikroflory, zaś z 2 pozbawienie wina związków powodujących jego mętność. W ten
sposób eliminuje się z procesu produkcyjnego ucią\
liwe etapy filtracji z u\
yciem środków klarujących oraz
siarkowanie, jako czynnik niszczÄ…cy mikroflorÄ™. Z kolei u\
ycie membran RO umo\
liwia częściowe lub
całkowite usunięcie alkoholu z wina lub te\
jego zagęszczenie. Otrzymuje się produkt o bardziej intensywnej
barwie i zwiększonej zawartości alkoholu.
Biotechnologia
Biotechnologia, jako szeroka dziedzina, stwarza te\
bardzo szerokie mo\
liwości stosowania technik
membranowych. PoczÄ…wszy od  zimnej sterylizacji po\
ywek przy u\
yciu MF, moduły membranowe są
zastosowane w reaktorach z recyrkulacją komórek i ciągłym odbieraniem produktów oraz do separacji
i zagęszczania produktów fermentacji.
Na rysunku przedstawiono schemat tradycyjnego bioreaktora z dołączonym modułem membranowym
i mo\
liwością recyrkulacji komórek.
7
Fermentor z recyrkulacją komórek.
Taki układ umo\
liwia ciągłość pracy fermentatora,
gdy\
produkty procesu są w kontrolowany sposób
odprowadzane i ich wzrastajÄ…ca koncentracja nie
inhibuje przebiegu prowadzonej reakcji. Dodatkowo
te\
następuje ciągłe zawracanie komórek do reaktora,
co zwiększa ich stę\
enie i powoduje tym samym
wzrost wydajności procesu.
Według podanego obok schematu przeprowadza się
produkcję etanolu z surowców skrobiowych i serwatki,
a tak\
e kwasu mlekowego, octowego i propionowego.
Selektywne przegrody o ró\
nych konfiguracjach,
Z unieruchomionymi komórkami lub enzymami, słu\
ą do budowy fermentorów nazywanych reaktorami
membranowymi. Reaktory takie mogą być stosowane do prowadzenia fermentacji alkoholowej, mlekowej,
octowej oraz do enzymatycznej hydrolizy sacharozy. W fermentacji alkoholowej aplikacjÄ… zyskuje proces
perwaporacji. Etanol odprowadzany w ten sposób z cieczy fermentacyjnej ma stę\
enie ok. 40 %, a koszt
produkcji jest o 29 % ni\
szy od produkowanego tradycyjnie.
Fermentacja alkoholowa z ciągłym usuwaniem etanolu za pomocą perwaporacji i recyrkulacją komórek.
Przy u\
yciu PV mo\
na te\
odprowadzać z cieczy
fermentacyjnej substancje zapachowe.
Opracowana w ostatnich latach membrana 2-polarna,
stosowana w elektrodializie, pozwala na otrzymywanie
kwasu mlekowego bez konieczności jego oczyszczania,
co jest wymagane w tradycyjnych metodach.
Inne zastosowania procesów membranowych.
Techniki membranowe, przede wszystkim UF, stosuje się do zagęszczania białka jaja kurzego. Proces
ten stosuje siÄ™ te\
do odsalania białka jaja. Pozyskane w ten sposób czyste białko nie ró\
ni siÄ™ wskaz
nikami
jakościowymi od białka negatywnego.
UF stosuje siÄ™ te\
w produkcji koncentratów białkowych z roślin oleistych. Dzięki technice
membranowej, mo\
na usunąć z ekstraktu białkowego niepo\
ądane niskocząsteczkowe składniki (przede
wszystkim fenole), odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach.
Przemysł spo\
ywczy stosuje te\
w niektórych przypadkach techniki membranowe na rzecz OŚ. Znane
są przykłady poddawania procesowi MF solanek peklujących, w celu ich wielokrotnego u\
ycia, a tak\
e
przykłady membranowego oczyszczania wód odpadowych.
8
Tlenowe hodowle mikroorganizmów na przykładzie tlenowej hodowli dro\
d\
y
Celem ćwiczenia jest:
" zapoznanie siÄ™ z przebiegiem tlenowej hodowli dro\
d\
y
" ocena wykorzystania składników po\
ywki podczas hodowli dro\
d\
y
" obliczanie bilansu masowego hodowli
WARUNKI HODOWLI DROśDśY
Do osiągnięcia właściwego przyrostu biomasy w odpowiednim czasie konieczna jest obecność
podstawowych składników po\
ywki we właściwych proporcjach. Niezbędne są: woda, z
ródła węgla i azotu,
magnezu, mikroelementów, witamin i innych substancji wzrostowych. Dro\
d\
e najlepiej rozwijajÄ… siÄ™ na
po\
ywkach zawierajÄ…cych cukry proste. Podstawowymi monosacharydami wykorzystywanymi przez dro\
d\
e sÄ…
D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza. Disacharydem powszechnie metabolizowanym w warunkach tlenowych
i beztlenowych jest sacharoza. Niektóre gatunki dro\
d\
y mają zdolność wykorzystywania laktozy, rafinozy,
L-sorbozy, D-ksylozy, L-arabinozy czy celobiozy. y
ródłem węgla mogą być tak\
e: skrobia rozpuszczalna,
pektyna, etanol, metanol, etanodiol, glicerol, niektóre kwasy organiczne i in. Do prawidłowego wzrostu
wymagają obecności substancji stymulujących m.in.: biotyny, kwasu pantenowego, mezoinozytu. Bazę podło\
a
do hodowli dro\
d\
y stanowi melasa buraczana lub trzcinowa oraz brzeczka słodowa. Optymalne pH po\
ywki
wynosi 4-5, zawartość wody 30 % min.
Większość gatunków dro\
d\
y najszybciej rozmna\
a siÄ™ w temperaturach 25-32 °C, chocia\
występują
gatunki, dla których optymalna temperatura wzrostu wynosi 37 (gat. termofilne) lub 20 °C (gat. psychrofilne).
Najni\
sza temperatura, w której zaobserwowano rozmna\
anie siÄ™ dro\
d\
y wynosi 2 °C a najni\
sza 46 °C
i wartości te przyjmuje się, jako punkty krytyczne.
Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów
Wzrost mikroorganizmów mo\
na przedstawić na wykresie zale\
ności logarytmu liczby komórek do
czasu hodowli. Powstanie krzywa wzrostu, na której mo\
na wyró\
nić 6 podstawowych faz wzrostu: faza
wzrostu utajonego, faza poczÄ…tku rozmna\
ania, faza logarytmiczna (wykładnicza), faza wzrostu zwolnionego,
faza stacjonarna i faza zamierania.
Faza wzrostu utajonego  okres adaptacji komórek do nowego środowiska. Następuje w niej
energetyczna adaptacja do środowiska i uruchomienie mechanizmów umo\
liwiajÄ…cych transportowanie
składników po\
ywki do wnętrza komórek. Następują syntezy enzymów, białek budujących odpowiednie kanały
transportowe itp. Istnieje zasada oszczędności energetycznej, tzn., \
e komórka adaptuje swój metabolizm do
asymilacji najłatwiej dostępnego z
ródła węgla. Ilość komórek nie zmienia się tzn. x = x0 = const.
Efektywność procesów tlenowych zale\
y od:
- szybkości mieszanie po\
ywki
- ilość doprowadzenia gazu
- temperatura hodowli
- stÄ™\
enie substancji rozpuszczalnych
- obecność substancji zmniejsza lub zwiększa napięcie powierzchniowe.
Faza poczÄ…tku rozmna\
ania się komórek (x > x0)  opanowanie środowiska jest tym szybsze im
większe było inokulum komórkowe. Ilość i szybkość podziałów zale\
y od warunków hodowli (pH, temperatury,
potencjału red-ox, siły jonowej i koncentracji O2). W sprzyjających warunkach hodowla przechodzi do fazy
3 faza wzrostu utajonego i faza poczÄ…tku rozmna\
ania sÄ… czasami ujmowane w 1 fazÄ™, tzw. lagfazÄ™.
Faza logarytmiczna (wykładnicza)  charakteryzuje się stałym minimalnym czasem generacji a tym
samym maksymalną szybkością wzrostu mikroorganicznego. Często wielkość komórek i zawartość w nich
białek w tej fazie jest stała, co umo\
liwia stosowanie pośrednich metod pomiaru biomasy. O takiej hodowli
mówi się, \
e zawiera ona  komórki standardowe .
· 2 2
gdzie:
xk  końcowa masa komórek
n  ilość podziałów
W tej fazie szybkość wzrostu populacji (µ) jest staÅ‚a i jest funkcjÄ… logarytmicznÄ…:
9
 1
·
t - czas
Faza logarytmiczna trwa tak długo, dopóki nie nastąpi wyczerpanie jakiegoś składnika po\
ywki lub dopóki nie
wzrośnie stę\
enie toksycznych metabolitów do wartości krytycznej (do pojawienia się czynnika limitującego
wzrost). Określa to zale\
ność Monoda:
·
gdzie:
µmax  maksymalna wÅ‚aÅ›ciwa szybkość wzrostu
Ks  stała półnasycenia (stała hamowania), czyli stę\
enie substratu, przy którym:
0,5 ·
S  stÄ™\
enie substratu ograniczajÄ…cego:
·
gdzie:
µmax  maksymalna wÅ‚aÅ›ciwa szybkość wzrostu
Kp  stÄ™\
enie produktu toksycznego, przy którym µ = 0,5 Å" µmax
P - stÄ™\
enie produktu toksycznego.
W momencie pojawienia siÄ™ czynnika ograniczajÄ…cego nastÄ™puje zmniejszenie µ i przejÅ›cie do fazy wzrostu
zwolnionego.
Faza wzrostu zwolnionego (właściwa szybkość wzrostu maleje a\
do momentu, kiedy ilość komórek
jest stała) i faza stacjonarna  rozpoczyna się w momencie, gdy komórki nie mogą się ju\
rozmna\
ać.
Poniewa\
szybkość wzrostu zale\
y m.in. od stÄ™\
enia substratów, (które maleje podczas hodowli), szybkość
wzrostu hodowli zaczyna się zmniejszać jeszcze przed całkowitym wyczerpaniem substratu. Dlatego przejście
od fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest zazwyczaj stopniowe. Poza ograniczeniem ilości substratu. Tak\
e
inne czynniki, tj. du\
a gęstość populacji, niskie ciśnienie parcjalne tlenu czy nagromadzenie toksycznych
produktów metabolizmu (np. etanol dla dro\
d\
y), mogą prowadzić do spowolnienia szybkości wzrostu
i zainicjowania fazy stacjonarnej.
W wielu produkcyjnych procesach biotechnologicznych nastawionych na wytwarzanie wtórnych
metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii
rozró\
nia siÄ™ trofofazÄ™, czyli fazÄ™ wzrostu i idiofazÄ™  fazÄ™ produkcji. Mimo, \
e w idiofazie komórki ju\
nie
rosną, potrafią one wykorzystywać podawany substrat oraz włączać związki prekursorowe do produktu
końcowego.
Faza zamierania  po pewnym czasie hodowli komórki zaczynają zamierać. Często przyczyną jest
nagromadzenie w po\
ywce hodowlanej toksycznych metabolitów. W niektórych wypadkach następuje liza
(autoliza) komórek wskutek działania wydzielanych przez mikroorganizmy do podło\
a enzymów.
PARAMETRY CHARAKTERYZUJ
CE WZROST KOMÓREK
*właściwa szybkość wzrostu:
Xk  końcowe stę\
enie komórek
X0  poczÄ…tkowe stÄ™\
enie komórek
*czas generacji:
10
Dla bakterii czas generacji wynosi ok. 30 min., dla dro\
d\
y 2-3 h
*czas podziałów komórkowych: h
TLENOWA HODOWLA DROśDśY
Bardzo wa\
ny jest odpowiedni poziom natleniania i stÄ™\
enia cukru w po\
ywce. Ludwik Pasteur
wykazał, \
e w obecności tlenu wydajność biomasy ze zu\
ytej glukozy jest znacznie wy\
sza oraz, \
e tlen silnie
hamuje fermentację alkoholową. Dotyczy to mikroorganizmów, które mogą rozwijać się zarówno w warunkach
tlenowych jak i beztlenowych (np. E. coli, S. cerevisiae). Od nazwiska odkrywcy zjawisko to nosi nazwÄ™ efektu
Pasteura. Jego mechanizm polega na represji i hamowaniu enzymów szlaku EMP (Embden-Meyrhofa-Parnasa)
w obecności tlenu. W warunkach tlenowych następuje represja, a w warunkach beztlenowych indukcja, m.in.
fosfofruktokinazy, aldolazy i kinazy pirogronianowej. Przy mniejszej poda\
y tlenu zachodzi fermentacja
etanolowa.
W tlenowych hodowlach drobnoustrojów obserwuje się tak\
e częściowe hamowanie oddychania
komórek w warunkach stę\
enia glukozy ponad 1-2 [g/dm3]. Jest to tzw. Efekt Crabtree. Wysokie stÄ™\
enie
glukozy wzmaga glikolizę, przy równoczesnym ograniczeniu szlaków metabolicznych związanych
z oddychaniem tlenowym (np. cykl Krebsa czy cykl pentozofosforanowy  PP), zwłaszcza podczas hodowli
drobnoustrojów w podło\
u kompleksowym. Represji i hamowaniu mogą podlegać u ró\
nych drobnoustrojów
m.in. dehydrogenaza NADH i elementy pierwszej fosforylacji w łańcuchu oddechowym oraz dehydrogenazy
funkcjonujÄ…ce w cyklu Krebsa, np. izocytrynianowa, bursztynianowa i inne. Indukowana jest natomiast synteza
enzymów szlaku EMP (fermentacja alkoholowa).
Wykazano, \
e nie tylko wysokie stÄ™\
enie glukozy, ale du\
a szybkość wzrostu dro\
d\
y sprzyja
procesowi fermentacji alkoholowej. PrzykÅ‚adowo  przy wÅ‚aÅ›ciwej szybkoÅ›ci wzrostu µ = 0,1 h-1 fermentacja
tlenowa zachodzi powy\
ej 2 g glukozy w litrze, przy µ = 0,2 h-1 ten sam efekt fizjologiczny uzyskuje siÄ™ przy
stÄ™\
eniu glukozy 1g w litrze. Uwa\
a siÄ™, \
e nie sama glukoza, jako związek chemiczny, lecz szybkość przemian
katabolicznych decyduje o kierunku jej metabolizmu. Wynika z tego, \
e warunki natlenienia, stÄ™\
enie glukozy
i szybkość jej metabolizmu wpływają na wydajność masy komórkowej. Przy wysokim stę\
eniu glukozy i du\
ej
szybkości wzrostu dro\
d\
y, wydajność biomasy w warunkach tlenowych ulega redukcji, gdy\
przy
dostatecznym poziomie ATP, zabezpieczającym potrzeby energetyczne komórki, nadmiar substratu
oddechowego NADH powoduje hamowanie procesów związanych z pozyskiwaniem energii metabolicznej.
Nadmiar NADH sprzyja te\
redukcji metabolitów powstających w procesie glikolizy. W wyniku takiej
gospodarki równowa\
nikami redukujÄ…cymi, w warunkach dobrego natlenienia i du\
ego stÄ™\
enia glukozy,
powstajÄ… normalne produkty fermentacji, np. etanol, czy kwas mlekowy, analogicznie jak w procesie
beztlenowym. Zjawisko to jest wykorzystywane w poczÄ…tkowych etapach propagacji dro\
d\
y. Produkcja
niewielkich ilości etanolu daje dodatkowy efekt sterylizujący i zabezpiecza przed rozwojem niepo\
Ä…danej
mikroflory.
Natlenienie po\
ywek
Efektywność procesów tlenowych zale\
y w du\
ym stopniu od szybkości tranferu tlenu z fazy gazowej
do ciekłej. Parametr ten jest determinowany przez następujące czynniki:
- stopień dyspersji pęcherzyków powietrza w fazie wodnej, co wpływa na powierzchnię wymiany
międzyfazowej
- szybkość mieszania cieczy, co wpływa na rozdrobnienie pęcherzyków oraz czas ich przebywania
w cieczy
- temperatura cieczy; zgodnie z prawem Henry ego, rozpuszczalność gazów w cieczy maleje w miarę
wzrostu temperatury; woda o temp. 25 °C mo\
e przyjąć max 20 mg tlenu na litr; po\
ywki
mikrobiologiczne ciekłe są zdolne do rozpuszczenie ok. 5-7 mg tlenu na litr
- obecność w cieczy substancji rozpuszczonych (sole, cukry, białka); im większe ich stę\
enie tym ni\
sza
rozpuszczalność tlenu w cieczy
- obecność substancji obni\
ających napięcie powierzchniowe cieczy (niekorzystnie oddziałują na transfer
tlenu do cieczy)
- stopień nasycenia tlenem danej cieczy; im większa jest ró\
nica między stanem nasycenia tlenem
a stanem faktycznym, tym szybszy jest transfer tlenu do cieczy.
Zwiększenie transferu tlenu do cieczy mo\
na technicznie osiągnąć przez:
- zwiększenie szybkości mieszania (zwiększenie powierzchni kontaktu gaz-ciecz)
- zwiększenie napowietrzania (tzn. dostarczenie większej ilości tlenu)
11
METODY HODOWLI MIKROORGANIZMÓW
Hodowle okresowe (batch culture)  są najczęściej stosowaną metodą hodowli mikroorganizmów. Metoda
okresowa ma wady, z których najwa\
niejszymi są: zmienność środowiska w czasie hodowli wynikająca ze
zmiany stÄ™\
enia składników pokarmowych i nagromadzenia toksycznych metabolitów oraz stosunkowo niską
gęstość kultury komórkowej i tym samym niewielka produktywność objętościowa bioreaktora. W procesach
okresowych nie wykorzystuje się w pełni potencjału metabolicznego komórek, gdy\
optymalne warunki dla ich
rozwoju utrzymywane są tylko przez krótki czas hodowli. Jednym ze sposobów redukcji tego problemu jest
zastosowanie okresowo-dolewowej, półciągłej lub ciągłej metody hodowli.
Hodowle ciągłe  polegają na stałym zasilaniu kultury świe\
Ä… po\
ywkÄ… z jednoczesnym usuwaniem zu\
ytego
medium wraz z komórkami lub bez komórek. Metoda ta jest dostosowana głównie do produkcji biomasy
komórkowej lub jej pierwszorzędowych metabolitów. Wzrost komórek odbywa się cały czas w logarytmicznej
fazie wzrostu, przy całkowitym braku ograniczających ich rozwój.
Najprostszą technologią procesów ciągłych jest zastosowanie reaktora przepływowego ze stałym dostarczaniem
świe\
ej po\
ywki i odbieraniem zu\
ytej wraz z komórkami przy zachowaniu stałej objętości roboczej
bioreaktora. Warunkiem utrzymania hodowli ciągłej jest zachowanie równowagi pomiędzy ilością komórek
wymywanych i ponownie namno\
onych w wyniku podziałów komórkowych. Szybkość po\
ywki powinna być
tak dobrana, by zapewnić stałą, wysoką koncentrację komórek w bioreaktorze i utrzymanie hodowli w stanie
chemostatu. W tym przypadku gęstość komórek i stę\
enie substratu mają wartości stałe, a więc miernikiem
właściwej szybkości wzrostu komórek jest szybkość rozcieńczania po\
ywki.
Hodowle okresowo-dolewowe (fed-batch culture) polega na wprowadzeniu do hodowli pod koniec fazy
logarytmicznego wzrostu świe\
ej po\
ywki lub mieszaniny najwa\
niejszych jej składników. W tym przypadku
początkowe wypełnienie bioreaktora wynosi 30-50 % a kolejne porcje po\
ywki są dostarczane ze stałą lub
zmienną szybkością. W metodzie FBC występują tylko 2 fazy cyklu komórkowego: fazy logarytmiczne
oddzielone krótkotrwałymi fazami adaptacyjnymi, zapoczątkowanymi przez wprowadzenie świe\
ej po\
ywki.
Dlatego, hodowle okresowo-dolewowe, w porównaniu z hodowlami okresowymi, pozwalają na uzyskanie
kilkukrotnie większych gęstości komórek i produktywności bioreaktora.
Innym sposobem prowadzenia hodowli okresowo-dolewowej jest metoda półciągła, która realizowana jest przez
okresowe odbieranie części hodowli i zastępowanie jej porcją świe\
ej po\
ywki.
Proces ciągły wyró\
nia się wieloma zaletami, do których nale\
Ä…:
- wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek
- mo\
liwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach
- mo\
liwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podło\
a
zasilajÄ…cego hodowlÄ™
- stosunkowo du\
a jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli
- mo\
liwość automatyzacji procesów
- mo\
liwość maksymalnego wykorzystania aparatury przy jednoczesnym równomiernym jej obcią\
eniu
przez cały czas trwania procesu.
W hodowlach ciągłych mogą pojawiać się problemy związane z niestałością czynnika biologicznego, np.:
- degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje
komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych
- trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłu\
szy czas
- niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych droboustrojów, tworzących układy
wielkokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek a tak\
e układy wielkokomórkowe, skupiska
w postaci kłaczków i kuleczek a tak\
e tendencja do obrastania przewodów i innych elementów
bioreaktora
- niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów
metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące
- niedostateczna znajomość dynamicznych właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej.
A = x0 = x
A/B xf>x0
B  xf = x0 Å" 2n
logxf = logx0 + nlog2
µ = µmax = const
wielkość komórek i zawartość białka = const
µ = µmax Å" S/(Ks + S)
12
właściwa szybkość wzrostu: (stan końcowy/stan początkowy komórki); h
czas generacji (by komórki podwoiły się)
częstość podziałów komórkowych 1
13
WYKONANIE ĆWICZENIA
Zadanie 1: badanie przyrostu biomasy dro\
d\
y.
" zwa\
yć naczynia wirówkowe
" do naczyń nale\
y odmierzyć po 25 ml brzeczki z hodowli początkowej i końcowej
" dla oddzielenia biomasy naczynia z zawartością wirować przy szybkości 5500 [obr./min] 10 min
" po wirowaniu supernatanty zlać do zlewek (do zad. 2) a pozostałość zwa\
yć (znad osadu, określić ilość
glukozy i azotu, mokrÄ… biomasÄ™ nale\
y wysuszyć)
" obliczenia:
- obliczyć suchą masę komórek w 100 ml brzeczki wiedząc, \
e \
ywa komórka zawiera 25 % s.m. (75 %
to woda);
25 % - 100 ml
x  25 ml
x = 6,25 %
- obliczyć masę i przyrost komórek dro\
d\
y w pobranych próbach
- obliczyć masę i przyrost komórek dro\
d\
y w 1000 ml brzeczki (D25)
Zadanie 2: badanie stopnia odfermentowania glukozy.
" próby rozcieńczyć
- hodowla koÅ„cowa  5 i 10 Å" (1 ml + 4 ml wody; 1 ml próby + 9 ml wody; po 2 próby)
- hodowla poczÄ…tkowa  100 i 150x
" z rozcieńczeń pobrać 0,5 ml próby i dodać 0,5 ml DNS-u. Oznaczenia wykonać w 2 powtórzeniach
" przygotować próbę  0 o składzie: 0,5 ml wody destylowanej i 0,5 ml DNS
" próby ogrzewać 10 min we wrzącej łaz
ni wodnej a następnie ostudzić w strumieniu zimnej wody
" dodać 5 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać
" zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali  = 530 nm stosując próbę  0 do
kalibracji spektrofotometru
" stÄ™\
enie glukozy odczytać z krzywej wzorcowej.
Zadanie 3: badanie stopnia wykorzystania azotu z po\
ywki.
" doświadczenie przeprowadzić z zastosowaniem aparatu Parnasa
" w rozgrzanym aparacie Parnasa nale\
y umieścić 10 ml badanej próby
" dodać ok. 20 ml 40 % NaOH (w obecności fenoloftaleiny  kolor ró\
owy)
" destylować amoniak do 20 ml kwasu bornego z odczynnikiem Tashiro do zmiany barwy + 5 min
" zmiareczkować azot amonowy za pomocą 0,1 N H2SO4 do zmiany barwy z zielonej na fioletową
" obliczenia:
- stopień odfermentowania cukru:
GLCpobrana = GLCpoczątkowa  GLCkońcowa
SOglc = (GLCpobrana/GLCpoczÄ…tkowa) x 100 %
- wydajność przyrostu biomasy:
dB (przyrost biomasy) = masa biomasy z końca hodowli  masa biomasy z początku hodowli
WdB = (dB/GLCpobrana) Å" 100 %
- azot NH4+ pobrany z 1000 ml po\
ywki:
Va = (V0  Vk) Å" 100, gdzie:
V0  objętość 0,1N H2SO4 zu\
yta do zmiareczkowania próby początkowej
Vk  objętość 0,1N H2SO4 zu\
yta do zmiareczkowania próby końcowej
NH4+pobrany = (Va Å" 0,0014 g Å" 18 g)/14 g
(1ml 0,1N H2SO4 odpowiada 0,0014 g N; 1M NH4+ = 18g; 1MN = 14 g)
- przyrost biomasy na podstawie ubytku N z po\
ywki:
ilość powstaÅ‚ego biaÅ‚ka (P) = NH4+ pobrany Å" 6,25
przyrost biomasy (dB) = B Å" 2
mno\
nik białka = 6,25
Białko zawiera stałą ilość azotu = 16 % co stanowi 6,25 części wszystkich pierwiastków występujących w białku
(100:16 = 6,25), mno\
Ä…c ilość azotu Å" 6,25 otrzymujemy ilość powstaÅ‚ego biaÅ‚ka.
Biomasa dro\
d\
owa zawiera du\
e ilości białka, ok. 50 %, dlatego, by je obliczyć mno\
ymy ilość biaÅ‚ka Å" 2.
14
Indukcja syntezy enzymów produkowanych przez Aspergillus niger
1. Cel ćwiczenia  wykazanie mo\
liwości indukowania produkcji po\
ądanych enzymów przez
drobnoustroje.
2. Wprowadzenie.
2.1. Indukcja syntezy enzymów przez drobnoustroje.
Większość enzymów wykorzystywanych w procesach biosyntezy i biotransformacji produkowanych
jest przez drobnoustroje. W przemyśle wykorzystuje się proteazy, ą-amylazy, amyloglukozydazę, aminoacytazę,
dekstranazÄ™, katalazÄ™. W celach leczniczych pozyskuje siÄ™ enzymy trawienne, heparynÄ™, streptolizynÄ™.
W mniejszych ilościach produkuje się te\
enzymy słu\
ące do celów analitycznych w biologii molekularnej czy
w inzynierii genetycznej (np. restryktazy).
Część enzymów jest syntetyzowana wewnątrz organizmu konstruktywnie, niezale\
nie od warunków
środowiskowych. Dotyczy to głównie enzymów katalizujących reakcje przemian centralnych i podstawowych
syntez komórkowych.
Większość wa\
nych biotechnologicznie enzymów nale\
y do grupy induktywnych, tzn. takich, których
synteza wymaga obecności induktora w środowisku zewnętrznym. Induktorami są substraty, rzadziej produkty
reakcji enzymatycznych albo te\
ich analogi.
Najlepiej poznanym przykÅ‚adem enzymu jest produkcja ²-galaktozydazy przez bakterie Escherichia
coli. Komórki tego organizmu mogÄ… rozwijać siÄ™ na wielu substratach nie produkujÄ…c prawie w ogóle ²-
galaktozydazy. Je\
eli jednak w podło\
u hodowlanym znajdzie siÄ™ laktoza  substrat dla ²-galaktozydazy  to
aktywność tego enzymu mo\
e wzrosnąć tysiąckrotnie.
Synteza indukowanego enzymu ulega najczęściej represji w obecności końcowych produktów degradacji
substratu. Represorami mogą więc być aminokwasy przy produkcji proteaz czy te\
np. glukoza przy produkcji
aminoglukozydazy czy izomerazy glukozowej.
Mechanizmy regulujące powstawanie enzymów konstytutywnych jak i induktywnych działają na
poziomie molekularnym, przede wszystkim na etapie transkrypcji DNA i w mniejszym stopniu na etapie
translacji. W pierwszym przypadku regulacja dotyczy oddziaływań białek regulatorowych (indukujących lub
represorowych) na geny promotora i operatora, które umo\
liwiają przyłączenie się polimerazy RNA do nici
DNA i tym samym na rozpoczęcie transkrypcji mRNA.
Regulacja na etapie translacji polega na ró\
nej częstości syntezy białek enzymatycznych lub te\

związana jest z translacyjnym modyfikowaniem białek, ułatwiającym ich przejście przez błony
wewnątrzkomórkowe (przez aparat Golgiego) i tym samym wyjście poza teren komórki.
2.2 Separacja enzymów.
Wyprodukowane przez drobnoustroje enzymy znajdujÄ… siÄ™ bÄ…dz
to wewnątrz komórek, lub te\

w podło\
u hodowlanym. Enzymy wewnątrzkomórkowe są zazwyczaj mniej stabilne i charakteryzują się większą
masÄ… czÄ…steczkowÄ…. Proces ich separacji nale\
y rozpocząć od rozbicia komórek, co wią\
e siÄ™ z tym, \
e do
roztworu przechodzą równie\
wszystkie inne białka obecne w cytoplazmie, a tak\
e cały kompleks kwasów
nukleinowych.
Dalsze postępowanie zarówno z enzymami wewnątrzkomórkowymi jak i zewnątrzkomórkowymi jest
podobne. Jedną z metod pozyskiwania enzymów jest ich wydzielanie z roztworów na zasadzie ró\
nicy
rozpuszczalności białek. Dodając do roztworu sole nieorganiczne (np. siarczan amonowy, magnezowy lub
sodowy), rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton) czy te\
rozpuszczalne polimery niejonowe (np. glikol
polietylenowy, dekstran) w odpowiednim stÄ™\
eniu powoduje się wypadanie białka z tego\
roztworu. Tak
uzyskanÄ… zawiesinÄ™ odwirowuje siÄ™, a z otrzymanego precypitatu usuwa siÄ™ czynnik denaturujÄ…cy, przez co
enzym odzyskuje swą aktywność.
StosujÄ…c wy\
ej wymienione sposoby mo\
na pozyskać 80-90 % po\
Ä…danego enzymu.
Oczyszczanie enzymów mo\
na prowadzić równie\
poprzez denaturacjÄ™ termicznÄ…; ogrzewanie
roztworu oczyszczanego enzymu w temperaturze nieco ni\
szej od temperatury, w której traci on aktywność,
prowadzi najczęściej do wytrącania się wieku białek towarzyszących. Temperaturę ogrzewania mo\
na
podwy\
szyć nie powodując inaktywacji enzymu, gdy do roztworu zostanie dodany związek swoiście się z tym
enzymem Å‚Ä…czÄ…cy.
Zmiana pH roztworu lub te\
obni\
enie jego siły jonowej do bardzo niskich wartości mo\
e równie\

doprowadzić do usunięcia wielu białek towarzyszących.
Bardzo szeroko stosowanymi metodami rozdziału białek są metody chromatograficzne. Obejmują one
następujące sposoby frakcjonowania:
15
" sączenie molekularne  technika wykorzystująca ró\
nice w wielkości rozdzielanych cząstek;
mieszanina substancji o ró\
nej masie cząsteczkowej przepływa przez kolumnę wypełnioną porowatym
hydrofilnym \
elem o określonej wielkości porów, zrównowa\
onym odpowiednim buforem; czÄ…steczki
zbyt du\
e, aby wniknąć do ziaren \
elu, przepływają między nimi i pojawiają się w eluacie lako
pierwsze, substancje o ni\
szej masie czÄ…steczkowej wnikajÄ… do ziaren \
elu, są więc opóz
niane na
kolumnie; pojawiają się w eluację w porządku od najmniejszych do największych
" chromatografia jonowymienna  kolumna chromatograficzna wypełniona jest celulozowym
wypełniaczem jonowym, do którego wią\
ą się białka obdarzone przeciwnym ni\
wymieniacz
ładunkiem, białka obdarzone tym samym ładunkiem przepływają swobodnie przez kolumnę. Białka
połączone z wypełniaczem uwalnia się poprzez wprowadzenie do układu czynników konkurujących
z białkami o miejsce na wypełniaczu
" chromatografia adsorpcyjna  kolumna wypełniona jest nieorganicznym materiałem
(np. hydroksyapatyt), który adsorbuje białko na zasadzie oddziaływań Van der Waals a
" chromatografia powinowactwa  rzadko stosowana na większą skalę ze wzgl. na wysokie koszty
i niestabilność wypełniacza kolumny, który powinien być specyficzny dla danego enzymu, gdy\

ligandem, do którego wią\
e siÄ™ pozyskiwany enzym jest w tym przypadku substrat danego enzymu,
jego analog bÄ…dz
te\
inhibitor enzymu.
W ostatnich latach rozdział enzymów na skalę przemysłową prowadzony jest przy u\
yciu technik
membranowych, do których nale\
y ultrafiltracja. Przepuszczając oczyszczany roztwór przez membranę
o zdefiniowanej porowatości mo\
na uzyskać zagęszczony enzym, nieposiadający zanieczyszczeń w postaci soli
czy niskocząsteczkowych związków. Frakcjonowanie odbywa się tu na zasadzie ró\
nicy w rozmiarach
czÄ…steczek, co ma odniesienie do ich masy czÄ…steczkowej.
Wykonanie ćwiczenia
" indukcja syntezy amylazy i pektynazy przez Aspergillus niger
Przygotować podło\
e hodowlane o następującym składzie:
MgSO4 Å" 7H2O 0,5 [g/l]
KH2PO4 1,0 [g/l]
KCl 0,5 [g/l]
NaNO3 3,0 [g/l]
0,01 [g/l]
FeSO4 Å" 7H2O
0,24 [g/l]
MgSO4
0,15 [g/l]
CaCl2
Jako substraty indukujące wytwarzanie enzymów do części podło\
a dodać:
- 10 g/l skrobi rozpuszczalnej (indukcja syntezy amylazy)
- 0,01 g/l kwasu poligalakturonowego (indukcja syntezy pektynazy).
Ustalić pH = 5,6 i sterylizować 117 °C pod ciÅ›nieniem 0,8 atm. przez 0,5 h.
Tak przygotowane podło\
e zaszczepić grzybnią Aspergillus niger, hodowlę prowadzić w kolbach Erlenmayer a
250 ml w temperaturze 30 °C na wytrzÄ…sarce przy 150 [obr./min] przez 70 h.
" oznaczanie aktywności pektynolitycznej i emylolitycznej w płynach pohodowlanych
Po 70 h hodowli zawartość kolbek odsączyć na lejku w celu oddzielenia komórek grzybowych od roztworu
zawierającego enzymy. W otrzymanym przesączu sprawdzić aktywność obu badanych enzymów. W celu
sprawdzenia aktywności pektynolitycznej do probówki zawierającej 0,5 ml 0,5 % kw. poligalakturonowego
dodać 0,5 ml badanego roztworu. CaÅ‚ość inkubować 30 min w 50°C, w Å‚az
ni wodnej. Następnie dodać 1 ml
DNS, gotować przez 10 min., próbki ochłodzić pod bie\
ącą wodą, dodać 10 ml wody destylowanej, dokładnie
wymieszać i prowadzić odczyt na spektrofotometrze przy długości fali A = 530 nm. Z krzywej wzorcowej dla
kwasu galakturonowego odczytać jego zawartość i na tej podstawie obliczyć aktywność badanego enzymu,
wyra\
ajÄ…c jÄ… poprzez szybkość powstawania produktu (np. µg/ml/min.).
W analogiczny sposób przeprowadzić oznaczenia aktywności amylolitycznej.
Uwaga: aktywności obu enzymów sprawdzić we wszystkich płynach pohodowlanych) pochodzących z hodowli
be\
\
adnej indukcji, w przypadku indukcji syntezy amylazy oraz w przypadku indukcji syntezy pektynazy).
Hodowla A. niger na podło\
u:
1. bez induktora  hodowla kontrolowa
2. ze skrobiÄ…  indukcja syntezy amylazy
3. z kw. poligalakturonowym  induktorem syntezy pektynazy
16
Przygotowanie prób do analizy:
Próby właściwe:
2 Å" 0,5 ml skrobi + 0,5 ml (podÅ‚o\
a) enzymu
2 Å" 0,5 ml kw. poligalakturonowego + 0,5 ml enzymu
próby zerowe substratowe:
1 Å" 0,5 ml skrobi + 0,5 ml H2O
1 Å" 0,5 ml kw. + 0,5 ml H2O
próba zerowa enymatyczna:
1 Å" 0,5 ml enzymu + 0,5 ml H2O
Indukcja ze wzgl. na miejsce grom.:
- konstytutywna  syntetyzowane niezale\
nie od środowiska gromadzenie wewnątrz komórki; katalizują
reakcje przemian centralnych i podstawowych syntez komórkowych
- induktywna  synteza jest uzale\
niona od obecności induktora w środowisku zewnętrznym (mogą być
substraty, produkty reakcji lub ich analogi).
17
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.
INHIBICJA. TERMOSTABILNOŚĆ.
Celem badań kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji o ich przebiegu w czasie,
a więc zaniku substratów i powstawania produktów, liczby i kolejności przyłączania cząsteczek substratów do
enzymu i odłączania cząsteczek produktów z kompleksu aktywnego, liczby kompleksów pośrednich oraz
o efektach czynników modyfikujących przebieg reakcji  inhibitorów i aktywatorów. Badania te prowadzą do
stworzenia modelu kinetycznego reakcji uwzględniającego wszystkie etapy reakcji. Ka\
dy etap charakteryzujÄ…
2 wielkości, noszące nazwę stałych szybkości reakcji, które pozwalają sprawdzić, czy przyjęty model kinetyczny
dobrze opisuje badany układ. Doświadczenie stałych szybkości reakcji jest bardzo ucią\
liwe.
Przy pomocy modelu kinetycznego mo\
na przewidywać szybkość i kierunek przebiegu danej reakcji
w łańcuchu lub cyklu metabolicznym, czyli mo\
e on być podstawą do określenia katalitycznej sprawności
enzymu w organizmie.
Aktywność enzymu określa nam ilość enzymu niezbędną do wytworzenia określonej ilości produktu
reakcji w określonej jednostce czasu przy zachowaniu standardowych warunków oznaczenia, zwykle
optymalnych dla działania enzymu.
Oznaczanie aktywności enzymów prowadzi się ró\
nymi metodami, opierającymi się na pomiarze ilości
wytworzonego produktu, ilości zu\
ytego substratu, względnie zmian fizykochemicznych w środowisku
reakcyjnym (np. zmiany lepkości, zmiany pH, zu\
ycia tlenu).
Szybkość przebiegu reakcji enzymatycznej zale\
y od wielu czynników środowiskowych, tj. stę\
enie
enzymu, stÄ™\
enie substratu. Temperatura, pH, siła jonowa, potencjał oksyredukcyjny, obecność inhibitorów
i aktywatorów.
O kierunku przebiegu reakcji decydujÄ… przede wszystkim stÄ™\
enie substratu i produktów reakcji.
Przy wysokim stÄ™\
eniu substratu, a tak jest zwykle na poczÄ…tku reakcji, reakcja przebiega w kierunku tworzenia
się produktów. Ilość reagującego substratu jest tym większa, im większa jest koncentracja enzymu na początku
rekcji, co gwarantuje natychmiastowy kontakt wszystkich cząsteczek enzymu z substratem. Zaznaczyć jednak
nale\
y, \
e w sytuacji, gdy cała ilość substratu jest związana z enzymem, nadmiar enzymu jest praktycznie
bezu\
yteczny.
Na początkową szybkość reakcji decydujący wpływ ma stę\
enie substratu. Wraz ze wzrostem stÄ™\
enia
krzywa V-S przybiera formę hiperboliczną, co oznacza, ze tempo wzrostu szybkości reakcji maleje w miarę
wzrostu stÄ™\
enia substratu, dochodząc do wartości maksymalnej. Przy dalszym dodatku substratu wartość Vmax
nie ulega zmianie, co związane jest z pełnym wysyceniem cząsteczek enzymu przez substrat. Wzrost Vmax mo\
e
mieć miejsce wówczas, gdy w mieszaninie reakcyjnej zostanie zwiększone stę\
enie enzymu. Powy\
szy opis
obrazuje następujący rysunek:
" Kinetyka hiperboliczna reakcji z 1 substratem.
Nieodwracalna reakcja enzymatyczna przebiega wg schematu:
A + E "! EA E + P
W schemacie tym A, E, P, i EA oznaczają kolejno substrat, enzym, produkt i kompleks przejściowy lub
aktywny. Substraty, produkty, inhibitory i inne czynniki biorące udział w reakcji nazywamy reaktantami.
Enzym, po rozpadzie kompleksu aktywnego wchodzi powtórnie w reakcję, katalizując przemianę następnej
czÄ…steczki substratu.
Zmiany stÄ™\
enia poszczególnych składników reakcji enzymatycznej przedstawiono na rysunku:
18
Na powy\
szym wykresie literami a, b i c oznaczono stany przebiegu reakcji. Litera  a to stan prestacjonalny, tj.
okres początkowy reakcji, poprzedzający ustalenie stanu stacjonarnego.  b to stan stacjonarny, w którym
stÄ™\
enie kompleksu aktywnego EA jest wartością stałą. Póz
niej następuje stan poststacjonarny  c , który posiada
małe znaczenie w badaniach kinetyki reakcji enzymatycznych.
Interpretacja kinetyki hipernolicznej w ujęciu Michaelis a-Menten
Interpretacja kinetyki hipernolicznej opiera się na zało\
eniu, \
e podczas przebiegu reakcji enzymatycznej istnieje
taki stan, w którym stę\
enie kompleksu EA jest wielkością stałą.
SCHEMAT NIEODWRACALNEJ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ:
ZAA
OśENIE: Istnieje taki moment reakcji, w którym szybkość syntezy kompleksu enzym-substrat równa się
szybkości jego rozpadu ([EA] = const)
k+1[A][E] = k-1[EA] + k+2 [EA]
poniewa\
:
[E] = [E0]  [EA]
to:
k+1[A][E0] - k+1[A][EA] = k-1[EA] + k+2 [EA]
k+1[A][E0] = [EA] (k+1[A] + k-1 + k+2)
poniewa\
szybkość powstawania produktu wynosi: V0 = k+2 [EA]
zakładając, \
e:
Vmax = k+2[E0]
19
i:
Wartość Km jest miarą powinowactwa enzymu do substratu; większe Km  mniejsze powinowactwo. Km jest to
taka ilość substratu, przy której reakcja enzymatyczna przebiega z połową maksymalnej szybkości.
Aby uniknąć trudności w określaniu wartości Vmax i Km kinetykę reakcji przedstawia się w formie
wykresu Lineweavera-Burka (linearyzacja Lineweavera-Burka  jest to odwrotność końcowego wzoru w teorii
Michaelis a-Menten).
0Ò! 0Ò!
" Metody relaksacyjne w badaniach mechanizmów reakcji enzymatycznych.
Metody relaksacyjne opierają się na wywołaniu chwilowych zaburzeń w układzie znajdującym się w stanie
równowagi termodynamicznej i następnie obserwacji kinetyki ustalania się nowego stanu równowagi
termodynamicznej, czyli relaksacji. Szybkość ustalania się nowego stanu jest miarą szybkości reakcji
przebiegających w badanym układzie.
W badaniach biologicznych najczęściej stosowane są badania relaksacji ciśnieniowej i temperaturowej
(metody skoku ciśnienia lub temperatury).
" Hamowanie reakcji enzymatycznych.
Szybkość reakcji enzymatycznych mo\
e być znacznie ograniczona przez czynniki środowiskowe. Ich działanie
mo\
na określić jako:
niespecyficzne  pH, temperatura, metale ciÄ™\
kie itp. powodują najczęściej nieodwracalną inaktywację białek
enzymatycznych;
specyficzne  niektóre związki modyfikują cząsteczkę enzymu (blokada centrum aktywnego, modyfikacja
struktury przestrzennej), przy czym modyfikacja taka jest z reguły odwracalna.
Temperatura jest jednym z czynników istotnie wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych.
Wraz z jej wzrostem wzrasta szybkość katalizowanych przez enzymy reakcji. Jednak\
e w podwy\
szonej
temperaturze dochodzi na ogół do denaturacji cieplnej enzymów, a przez to do ich inaktywacji. Większość
enzymów posiada optimum swojego dziaÅ‚ania w temperaturze 30-50 °C. Natomiast ju\
kilkuminutowa
inkubacja w temp. 70 °C inaktywuje wiÄ™kszość znanych do tej pory enzymów, choć istniejÄ… te\
tak\
e enzymy,
które peÅ‚niÄ… aktywność nawet po inkubacji w 100 °C.
W niektórych przypadkach te same enzymy, ale izolowane z 2 ró\
nych organizmów charakteryzują się
ró\
ną termostabilnością. ą-amylaza z Bacillus stearotermophilius charakteryzują swą aktywność po inkubacji
w 90 °C, natomiast ten sam enzym izolowany z Aspergillus oryzae ulega peÅ‚nej inaktywacji ju\
po 15 min
inkubacji w 60 °C.
Denaturacja termiczna w odniesieniu do niektórych enzymów jest odwracalna. Przykładem jest tu
pirofosforaza nukleotydowa z Proteus vulgaris. Enzym ten traci całkowicie aktywność po 10 min inkubacji
w 70 °C, ale odzyskuje jÄ… caÅ‚kowicie po ochÅ‚odzeniu do 37 °C.
Inaktywacja enzymów mo\
e równie\
następować w temperaturach poni\
ej 10 °C. W tych przypadkach
zjawisko to ma charakter bardziej kompleksowy, gdy\
szybkość inaktywacji zale\
y tu równie\
od stÄ™\
enia
enzymu, stÄ™\
enia soli i pH środowiska. Taka inaktywacja dotyczy prawdopodobnie tylko enzymów
oligometrycznych, które w obni\
onej temperaturze dysocjujÄ… na podjednostki, a po ponownym podwy\
szeniu
temperatury podjednostki te nie asocjujÄ… siÄ™ ju\
w aktywny enzym (np. dekarboksylacja glutaminowa z E. coli).
Enzymów inaktywujących się w niskich temperaturach jest jednak bardzo mało; większość enzymów
ulega inaktywacji w podwy\
szonej temperaturze.
20
Istnieje mo\
liwość wpływania na termo-stabilność enzymów poprzez stosowanie związków
ochronnych, które wią\
ą się z enzymem, przez co obserwuje się mniejszy spadek jego aktywności. Stabilizująco
działają substraty i analogi strukturalne, jony metali, koenzymy, a tak\
e stabilizatory nieswoiste  albuminy
osocza, dekstran, glikol polietylenowy (PEG), glicerol.
y
RÓDA
A ENZYMÓW
1. Enzymy pochodzenia roślinnego:
- peroksydaza - chrzan
- proteinazy  fasola szparagowa
- ą-amylaza  jęczmień, słodkie ziemniaki
2. Enzymy pochodzenia zwierzęcego:
- katalaza  bydło
- lipaza  świnia
- lizozym  jaja kurze
- pepsyna  świnia
- ą-amylaza - świnia
3. Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego:
" enzymy wytwarzane przez bakterie:
- katalaza  Micrococcus lysodeiktus
- proteazy  Bacillus sp., Streptomyces sp.
- kolagenaza  Clostridium histoliticum, Rydopseudomonas spheroides
- Ä…-amylaza  Bacillus sp.
- ²-galaktozydaza  Escherichia coli
" enzymy wytwarzane przez grzyby:
- glukozydaza  Aspergillus niger
- lipaza  Aspergillus sp., Mucor sp., Rhizopus sp.
- Ä…-amylaza - Aspergillus sp.
- ²-amylaza - Aspergillus sp.
- amyloglukooksydaza - Aspergillus niger
- ²-1,3-glukanaza  Basidomycete sp., Sclereltina libertiana
- pektynazy - Aspergillus niger
- celulazy  Trichoderma viride, Basidomyces sp.
- proteazy - Aspergillus sp., Tritirachium sp.
Biorąc pod uwagę rodzaj oddziaływania między cząsteczkami enzymu i inhibitora inhibicję specyficzną
dzielimy na 3 typy:
1. inhibicja współzawodnicza (kompetycyjna)  polega na konkurencji pomiędzy inhibitorem
i substratem o centrum aktywne enzymu; inhibitory tego typu sÄ… zwykle podobne pod wzgl. struktury
chemicznej do substratu; inhibicjÄ™ tego typu mo\
na zwykle znieść przez zwiększenie stę\
enia substratu; przy
tego typu inhibicji zmniejsza się powinowactwo enzymu do substratu (Km rośnie), Vmax nie zmienia się
2. inhibicja niewspółzawodnicza (niekompetycyjna)  inhibitor tak wią\
e siÄ™ z enzymem, \
e zmienia
jego aktywność katalityczną; maleje Vmax powinowactwo pozostaje na tym samym poziomie
(Km = const)
3. inhibicja allosteryczna  inhibitor tak modyfikuje czÄ…steczkÄ™ enzymu, \
e zmienia się zarówno
powinowactwo enzymu do substratu (Km) jak i szybkość maksymalna (Vmax); przykładem tego typu inhibicji
mo\
e być inhibicja przez sprzę\
enie zwrotne, gdzie produkt reakcji hamuje jeden z pierwszych etapów tej
reakcji.
Na rysunku przedstawiono graficzną interpretację ró\
nych typów inhibicji na wykresie Lineweavera-Burka.
21
Wykonanie ćwiczenia
1. Określić wpływ zmiennego stę\
enia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej.
Przeprowadzić hydrolizę enzymatyczną skrobi stosując następujące stę\
enia substratu: 0,2 %, 0,4 %,
0,6 %, 0,8 %, 1,0 %. Na podstawie otrzymanych wyników przedstawić graficznie przebieg reakcji (wg metody
linearyzacji Lineweavera-Burke a) oraz wyznaczyć kinetyczne stałe reakcji Km i Vmax. (inhibitor: maltoza
0,025%)
2. Określić przebieg hydrolizy skrobi w obecności inhibitorów (0,05 % maltoza).
Przeprowadzić hydrolizę skrobi (0,2 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 %, 1,0 %) w obecności 0,05 % maltozy.
Otrzymane wyniki przedstawić graficznie w formie liniowej na rysunku wykonanym w p.1. Na tej podstawie
określić typ inhibicji.
Próby wÅ‚aÅ›ciwe (2 Å" ) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml enzymu.
Zerowe substratowe (1 Å" ) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml H2O.
Zerowe enzymatyczne (1 Å" ) 0,5 ml enzymu + 0,5 ml H2O.
Oznaczanie aktywności amylolitycznej.
W celu sprawdzenia aktywności amylolitycznej do probówki zawierającej 0,5 ml buforowanego
roztworu 1 % skrobi wprowadzić 0,5 ml badanego enzymu. Całość inkubować w łaz
ni wodnej przez 30 min
22
w 50 °C. NastÄ™pnie dodać 1 ml DNS (kwas 2,3,3-dinitrosalicylowy); powstaje barwny kompleks w 100 °C
z cukrami od pomarańczowego do brązowego; i gotować przez 10 min. Po tym czasie reakcję przerwać poprzez
schłodzenie próby pod bie\
ącą wodą, do probówek dodać 10 ml wody destylowanej i po wymieszaniu
prowadzić odczyt na spektrofotometrze przy długości fali A = 530 nm. Z krzywej wzorcowej odczytać
zawartość glukozy w próbce i na tej podstawie określić aktywność enzymu amylazy, wyra\
ajÄ…c jÄ… poprzez
szybkość przebiegu reakcji, czyli w tym przypadku jako ilość powstałej glukozy w jednostce objętości
i w jednostce czasu (np. mg/l/min)
IMMOBILIYACJA BIOKATALIYATORÓW
Cel ćwiczenia:
" Zapoznanie się z metodami unieruchamiania enzymów i komórek mikroorganizmów
" Immobilizacja komórek dro\
d\
y Saccharomyces ceresevisiae w \
elu alganinianowym oraz poprzez
mikrokapsułkowanie
Wprowadzenie
Większość procesów biotechnologicznych polega na przeprowadzeniu cyklu reakcji biochemicznych,
w których wyjściowy substrat jest przekształcany w produkty końcowe. Procesy takie wymagają
wieloskładnikowych kompleksów enzymatycznych, które mogą być wprowadzane do reakcji w formie
handlowych preparatów enzymatycznych. Najczęściej reakcje takie wymagają udziału wielu enzymów
zastosowanych w ściśle określonych stę\
eniach i wzajemnych proporcjach, co z technologicznego punktu
sterowania takim procesem jest bardzo trudne, a tak\
e kosztowne.
Dlatego te\
znacznie korzystniejsze jest im mobilizowanie całej komórki mikroorganizmu jako z
ródła
enzymów. Taki proces jest du\
o tańszy, gdy\
pomija się etapy izolacji i oczyszczania enzymów.
Immobilizacja oznacza zatem fizyczne lub chemiczne unieruchomienie biokatalizatora poprzez
związanie go z nośnikiem lub umiejscowienie w określonej przestrzeni bez u\
ycia makroskopowego nośnika.
Systemy oparte na wykorzystaniu im mobilizowanych biokatalizatorów wykazują wiele zalet
w porównaniu z systemem wolnych komórek i enzymów.
" mo\
liwość wielokrotnego u\
ycia i wykorzystania w procesach ciągłych
" mo\
liwość wprowadzenia do reakcji całego kompleksu enzymatycznego jednocześnie, co ułatwia
przeprowadzenie ciągów katalizowanych reakcji i polepsza wykorzystanie potrzebnych ko faktorów, które są
regenerowane przez kompleks enzymatyczny
" łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej
" wy\
sza reaktywność, przedłu\
ona trwałość katalityczna enzymu
" dodatni wpływ na biologiczne właściwości mikroorganizmów  komórki są wówczas mniej podatne na
efekty związków hamujących, mają większą stabilność termiczną i chemiczną a powstające tą drogą produkty
nie są zanieczyszczone białkami pochodzącymi z lizy komórek
" mo\
liwość wprowadzania do reakcji du\
ej koncentracji komórek co przyspiesza tempo procesu
" mo\
liwość zwiększania szybkości rozcieńczania bez obawy wymycia populacji mikroorganizmów, do
którego dochodzi podczas procesów z komórkami wolnymi
" obni\
one koszty procesów biotechnologicznych.
Typy immobilizowanych biokatalizatorów:
- preparaty pojedynczych enzymów katalizujących proste reakcje biochemiczne
- kompleksy 2 lub więcej enzymów (reakcje zło\
one)
- całe komórki bez zachowania ich funkcji \
yciowych
- \
ywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej.
Kryteria wyboru techniki immobilizacji \
ywych komórek:
- metoda immobilizacji powinna być wystarczająco łagodna, by zapewnić zdolność do regeneracji komórek
- proces powinien zapewnić regenerację zło\
a podczas długiego czasu działania bioreaktora
- technika immobilizacji powinna zapewnić osiągnięcie w bioreaktorze wysokiej koncentracji biomasy
i utrzymywanie jej na równym poziomie przez wydłu\
ony okres działania
- technika ta powinna być prosta i realtywnie tania
- system im mobilizowanych komórek powinien być trwały w danych warunkach pH i temperatury.
Po\
ądane cechy nośnika do immobilizacji komórek:
- neutralność wobec mikroorganizmu i środowiska
- odporność mechaniczna na działające w bioreaktorze:
23
" siły ściskania(ciśnienie hydrostatyczne)
" siły ścinające (podczas mieszania)
- odporność na atak mikrobiologiczny
- odporność na czynniki fizyczne, np. temperaturę
- odporność na czynniki chemiczne, np. kwasy, zasady, rozpuszczalniki organiczne, inhibitory, toksyny.
Metody immobilizacji
1. Wiązanie na powierzchni nośnika:
" Adsorpcja i adhezja dzięki siłom jonowym, wiązaniom wodorowym i innym oddziaływaniom
fizykochemicznym. Adsorpcja do podło\
a związana jest z oddziaływaniem sił Van der Waalsa i potencjału zeta
(powierzchniowy ładunek elektrostatyczny wynikający z rozdziału grup COOH i NH2 na powierzchni komórki:
adsorpcja następuje w wyniku odmienności ładunku komórki i nośnika. Adhezja komórek do ciał stałych
związana jest z naturalną właściwością mikroorganizmów, dzięki której mogą one tworzyć filmy biologiczne;
jest to zakodowana genetycznie zdolność do wytwarzania substancji klejących i cementujących (najczęściej
polisacharydów). Największymi zaletami tej metody są niskie koszty u\
ywanych materiałów i łatwość
wykonania. Wady: metoda mało uniwersalna, wiązanie z nośnikiem słabe i wra\
liwe na zmiany warunków
środowiska, np. pH, siły jonowej, temperatury. Na stopień i siłę adhezji du\
y wpływ ma rodzaj u\
ytych
mikroorganizmów oraz porowatość nośników. W metodach tych stosuje się nośniki organiczne, np.: węgiel,
antracyt, sephadeks, drewno i in. oraz nieorganiczne: szkło, spieki szklane, cegła, ziemia okrzemkowa, materiały
ceramiczne, kaolin, tlenki metali i inne.
" Wiązania kowalencyjne takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot i inne pomiędzy np.
aktywnymi grupami ściany komórkowej a uaktywnionym nośnikiem. W wiązaniu chemicznym wykorzystuje się
wiązania kowalencyjne wprowadzając do środowiska wielofunkcyjne czynniki sprzęgające (aldehydy, aminy),
które znacznie ograniczają stosowanie tej metody ze względu na swoją toksyczność. Stosuje się nośniki
silikonowe i ceramiczne.
2. Wiązanie w matrycy nośnika:
Metoda ta polega na otaczaniu komórek przez usieciowaną membranę lub matrycę polimerową. Jednym
z podstawowych kryteriów jest dobór takiego nośnika, którego wielkość porów jest mniejsza od średnicy
komórki, ale na tyle du\
a by substrat mógł penetrować do komórki. Jest to najpowszechniej stosowana metoda
immobilizacji, zwłaszcza w przemyśle spo\
ywczymi fermentacyjnym.
System ten mo\
na realizować następującymi metodami:
" pułapkowanie w \
elach naturalnych lub syntetycznych  przykłady nośników: agar, alginian, karagen,
poliakrylamid, poliuretan, polistyren. WiÄ…zanie w matrycy mo\
e następować poprzez powstawanie
poprzecznych wiązań jonowych w polimerach liniowych np. alginianu w obecności kationów poliwalentnych
(Ca2+, Al3+, Ba, Sr2+). ZwiÄ…zanie biokatalizatora z nosnikiem mo\
na uzyskać poprzez wytrącanie nośnika na
skutek zmian temperatury, pH lub zmianami rozpuszczalnika (\
elatyna, karaginian).
" pułapkowanie na włóknach  jest odmianą \
elowania przez wytrÄ…canie, lecz stosuje siÄ™ tu polimery
tworzące włókna, co daje bardziej rozwiniętą powierzchnię nośnika.
3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych:
" zamykanie w komórkach naturalnych, np. erytrocytach
" kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: kapsułki alginianowe, liposomy, kapsułki nylonowe,
polimocznikowe, z pochodnych celulozy. Metoda ta polega na sporzÄ…dzeniu emulsji biokatalizatora w
odpowiednim medium. Taką emulsję rozpyla się w specjalnym roztworze wywołującym powstawanie otoczki
wokół biokatalizatora, która selektywnie przepuszcza substraty i produkty
" zamykanie pomiędzy membranami lub w wę\
ach półprzepuszczalnych.
4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego:
" sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy u\
yciu
odczynników dwufunkcyjnych
" flokulacja komórek przy udziale  o wydajności tej metody decydują właściwości ściany komórkowej
" samoregulacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków
biomasy.
Przyczyny zmniejszania produktywności zło\
a:
1. Wymywanie enzymu lub komórek ze zło\
a, rozpuszczanie lub ścieranie się zło\
a.
2. Utrata aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu bądz
lizy komórek.
3. Pogorszenie się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się
zło\
a oraz zmiany charakterystyki przepływu roztworu substratu.
4. Zaka\
enia mikrobiologiczne.
24
Zastosowanie immobilizacji:
W przemyśle farmaceutycznym:
- produkcja antybiotyków  ponad 60 % światowej produkcji kwasu 6-aminopenicylinowego (6-APA), z którego
metodami chemicznymi lub enzymatycznymi otrzymuje się 16 ró\
nych antybiotyków lak tamowych,
otrzymywanych jest przy zastosowaniu im mobilizowanych biokatalizatorów;
- produkcja hormonów i witamin;
- inne leki.
Produkcja aminokwasów:
- kwas asparaginowy  transformacja Dumaranu do asparginianu poprzez komórki E. coli immobilizowane
w karaginianie, produkcja: L-alaniny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy.
W przemyśle spo\
ywczym:
- produkcja alkoholu etylowego, octu, usuwanie laktozy z mleka, hydroliza kazeiny, skrobii, białek, produkcja
witaminy B12, syropu fruktozowego, klarowanie win i soków.
W preparatyce i ochronie środowiska:
- produkcja aktywnych białek, peptydów,
- wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych,
- w ochronie środowiska (oczyszczanie ścieków).
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. Sprzęt i odczynniki:
- 200 mM CaCl2,
- 0,7 % i 6 alginian sodu,
- 6 skrobia rozpuszczalna,
- zawiesina komórek Saccharomyces cerevisiae,
- Kolbki Erlenmayera, zlewki, krystalizatory, pipety,
- kulki szklane i ceramiczne,
- strzykawka, lejek do immobilizacji,
- mieszadło magnetyczne,
Zadanie 1. Unieruchomienie komórek dro\
d\
y w alginianie
Wymieszać 6 % roztwór alginianu z zawiesiną komórek dro\
d\
owych w proporcji 1:1, a\
do uzyskania
homogennej zawiesiny. Umieścić roztwór CaCl2 wraz z elementem mieszającym na mieszadle magnetycznym i
wkraplać do niego przy u\
yciu strzykawki lub specjalnego lejka do immobilizacji, mieszaninę alginian-komórki
dro\
d\
owe.
Pozostawić utworzone kulki w roztworze CaCl2 na ok. 5-10 min. celem ich utwardzenia.
Zadanie 2. Unieruchomienie komórek w kapsułkach alginiuanowych.
Komórki zawiesić w 6 % roztworze skrobii rozpuszczalnej. Tak przygotowaną mieszaninę wkraplać
strzykawkÄ… do mieszajÄ…cego siÄ™ 0,7 % roztworu alginianu sodu.
Utworzone kapsułki przenieść do roztworu utwardzającego  200 mM roztwór CaCl2 i łagodnie
mieszać przez około 10 min.
25
METODY HODOWLI
DROBNOUSTROJÓW
CEL ĆWICZENIA
Zapoznanie się z metodami hodowli drobnoustrojów, ich
zastosowaniem oraz sposobami monitorowania ich przebiegu
1. PODZIAA
HODOWLI ZE WZGL
DU NA
KONSYSTENCJ
STOSOWANYCH POśYWEK
HODOWLANYCH
" hodowle na podło\
ach płynnych
" hodowle na podło\
ach stałych
2. METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW
" hodowle okresowe
" hodowle ciągłe
" hodowle ciągłe z recyrkulacją komórek (hodowle
modyfikowane)
" hodowle okresowo-dolewowe (hodowle z zasilaniem)
2.1. HODOWLE OKRESOWE
Najprostsza i najczęściej stosowana metoda hodowli.
Hodowle prowadzone do momentu wyczerpania się składników
pokarmowych w podło\
u lub nagromadzenia się w nim metabolitów
toksycznych dla mikroorganizmów.
26
2.2. HODOWLE CI
GA
E
Hodowle prowadzone z ciągłym dozowaniem świe\
ej po\
ywki
i jednoczesnym odprowadzaniem po\
ywki zu\
ytej z analogicznÄ…
szybkością (hodowle prowadzone przy stałej objętości płynu
hodowlanego)
" Å‚
;
" stan równowagi dynamicznej ustala się, gdy: D = n
ZALETY HODOWLI CI
GYCH
" wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany
warunków hodowli i fizjologię komórek
" du\
a wydajność bioprocesorów
" dobre wykorzystanie sprzętu stosowanego do hodowli
" mo\
liwość automatyzacji
WADY HODOWLI CI
GA
YCH
" mo\
liwość mutacji i degradacji szczepów
" trudność utrzymania warunków aseptycznych
" mo\
liwość zmiany warunków hodowli
(agregacja drobnoustrojów, obrastanie przewodów)
ZASTOSOWANIE HODOWLI CI
GA
YCH
" produkcja etanolu, kwasu mlekowego, kwasu octowego
" produkcja biomasy (bakterii, dro\
d\
y i glonów)
wykorzystywanej następnie do otrzymywania kultur
starterowych lub jako z
ródło białka
" oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego
27
2.3. HODOWLE CI
GA
E Z RECYRKULACJ
KOMÓREK
(HODOWLE MODYFIKOWANE)
" hodowle z zastosowaniem technik dializacyjnych oraz technik
mikro i ultra filtracyjnych
" hodowle o wysokiej koncentracji komórek
" hodowle z ciągłym dozowaniem świe\
ej po\
ywki i
jednoczesnym odbieraniem permeatu zawierajÄ…cego toksyny
lub labilny produkt
2.4. HODOWLE OKRESOWO-DOLEWOWE
" hodowle z okresowym wprowadzaniem świe\
ej po\
ywki lub
niektórych jej składników (FBC)
" hodowle z cyklicznym odbieraniem części hodowli (RFBC)
" hodowle z okresowym odbieraniem części płynu
hodowlanego i uzupełnianiem go świe\
ym podło\
em
ZASTOSOWANIE HODOWLI
OKRESOWO-DOLEWOWYCH
" produkcja alkoholi, kwasów organicznych, antybiotyków,
aminokwasów, witamin, alkaloidów
" produkcja białka jednokomórkowców
28
ZADANIA DO WYKONANIA
" OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK
W INOKULACIE
" obliczenie ilości inokulatu potrzebnego do uzyskania
poczÄ…tkowego stÄ™\
enia komórek 106 jkt/ml
" OZNACZENIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY W POśYWCE
I PA
YNIE HODOWLANYM
" obliczenie stopnia odfermentowania glukozy
" OZNACZENIE ST
śENIA BIOMASY
" BILANSE MATERIAA
OWE HODOWLI CI
GA
YCH
OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK
W INOKULACIE
“!
24-godzinny inokulat bakterii Lb. acidophilus
“!
Rozcieńczenie 10-krotnie w wodzie destylowanej
(0,1 ml zawiesiny bakterii + 0,9 ml wody)
dokładne wymieszanie roztworu
“!
naniesienie kropli rozcieńczonej zawiesiny bakterii w miejsce
krzy\
ujÄ…cych siÄ™ linii komory Thoma
“!
przykrycie szkiełkiem nakrywkowym
“!
policzenie komórek znajdujących się w 30 losowo wybranych
kwadratach (obiektyw 40x)
“!
obliczenie średniej liczby komórek występujących w 1 kwadracie (a)
OBLICZENIE CAA
KOWITEJ LICZBY śYWYCH KOMÓREK
W INOKULACIE
4 · 10 · ·
X  całkowita liczba komórek w 1 ml inokulatu
a  średnia liczba komórek w 1 kwadracie
b  rozcieńczenie próby
29
OBLICZENIE ILOÅšCI INOKULATU POTRZEBNEGO DO
UZYSKANIA POCZ
TKOWEGO ST
śENIA KOMÓREK
106 JTK/ML
objętość płynu w bioreaktorze wynosi 3000 ml
w 1 jego ml ma być 106 jtk
czyli w 3000 ml musi być 3Å"109 jtk
1 ml inokulatu mamy  (wartość obliczona)
X  3Å"109 jtk
· ·
ść
OZNACZANIE ZAWARTOÅšCI GLUKOZY
W POśYWCE I PA
YNIE HODOWLANYM
KOLORYMETRYCZN
METOD
MULLERA
pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora
“!
wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min
“!
zlanie superantantu do probówki
“!
pobranie 0,5 ml superantantu + 0,5 ml DNS-u
“!
ogrzewanie 5 min superantantu we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej
“!
schłodzenie w strumieniu wody + 5 ml wody destylowanej
“!
pomiar ekstynkcji przy długości fali 530 nm za pomocą
spektrofotometru
OBLICZENIE ZAWARTOÅšCI GLUKOZY
W POśYWCE I PA
YNIE HODOWLANYM
Zale\
ność pomiędzy ekstynkcją (y),
a zawartością glukozy w badanych płynach (x)
opisuje równanie
1/2
2
OBLICZENIE STOPNIA ODFERMENTOWANIA FLUKOZY
Znając zawartość glukozy w po\
ywce (100 %) oraz zawartość glukozy
w pobranym płynie (x %) oblicz stopień jej odfermentowania
30
OZNACZENIE ST
śENIA BIOMASY
pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora
“!
wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min
“!
zlanie superantantu do probówki
(do oznaczenia zawartości glukozy)
“!
zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej
(przemycie biomasy)
“!
wirowanie 5 min przy 5,5 tys obr./min
“!
zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej
dokładne wymieszanie
“!
pomiar transmitacji światła przechodzącego przez próby przy długości
fali 600 nm
BILANSE MATERIAA
OWE HODOWLI CI
GA
YCH
SZYBKOŚĆ ROZCIEC
CZANIA  D [1/h]

ŚĆ Ż

ŚĆ Ż .
31
TECHNOLOGIE KOMPOSTOWANIA.
" kompostowanie w warunkach naturalnych (w pryzmach na otwartym powietrzu)
" kompostowanie w warunkach sztucznych (w komorach, na płytach fermentacyjnych, w brykietach) ze
wstępną obróbką odpadów.
Innym ostatnio stosowanym podziałem technologii kompostowania jest podział na:
" kompostowanie odpadów zmieszanych
" kompostowanie wydzielonej frakcji odpadów organicznych.
WYKORZYSTANIE ODPADÓW KOMUNALNYCH W POLSCE
W 1996 r. usunięto 46,45 mln m3 stałych odpadów komunalnych, co stanowi 55 % ogólnej masy
wytwarzanych odpadów. Wykorzystanie odpadów komunalnych jest niewielkie i sprowadza się do:
1. wytwarzania kompostu (218,6 tys ton odpadów poddano kompostowaniu),
2. wykorzystania do celów energetycznych gazu wysypiskowego (produkcja energii elektrycznej),
3. wyselekcjonowania w systemie zbiórki i segregacji składników o charakterze surowców wtórnych:
" papier, makulatura,
" opakowania szklane, stłuczka szklana,
" metale \
elazne i nie\
elazne,
" tworzywa sztuczne.
Średnio w kraju wykorzystanie składników wyselekcjonowanych z odpadów komunalnych nie przekracza 0,5 %
ogólnej masy usuwanych odpadów.
MATERIAA
WYKORZYSTYWANY DO PRODUKCJI KOMPOSTU.
Surowiec do przygotowania kompostu powinien zawierać odpowiednio du\
ą ilość substancji organicznej, która
musi być większa ni\
30 %, dostateczną ilość azotu, a tak\
e brak związków toksycznych.
Do kompostowania stosuje siÄ™:
" odpady komunalne
Zawierają 35-50 % składników organicznych. Pozostałą część masy stanowią ró\
norodne odpady
mineralne i tworzywa sztuczne. Szacuje siÄ™, \
e w odpadach komunalnych znajduje siÄ™ ok. 1 mln ton
suchej masy organicznej, która mo\
e być kompostowana. Zawiera ona średnio ok. 1,5 % azotu.
" masa roślinna z terenów zieleni miejskiej, rekreacyjnej i przemysłowej
Zieleń miejska i osiedlowa zajmuje ok. 65000 ha na terenie całego kraju. Przyjmując 5 ton rocznej
produkcji masy roślinnej z hektara otrzymujemy ok. 325 tys. ton surowca o zawartości ok. 1,5 % azotu.
" odpady z zakładów przetwórstwa rolno-spo\
ywczego
" odpady z zakładów produkcji drewna i wyrobów
" osady z biologicznego oczyszczania ścieków
Głównymi z
ródłami osadów ściekowych są oczyszczalnie ścieków miejskich. Chemiczne
właściwości osadów z tych oczyszczalni są zbli\
one do osadów z miejskich oczyszczalni ścieków.
Do nawo\
enia gleb najkorzystniejsze są osady ze ścieków przemysłu rolno-spo\
ywczego. Osady stanowiÄ… ok. 1-
2 % oczyszczanych ścieków. Wymagają one obróbki: zagęszczenia, stabilizacji i odwodnienia. Przeciętna
zawartość azotu w osadach wynosi ok. 3 %. Mają one wyjątkowo korzystną zawartość koloidalnej substancji
organicznej i składników pokarmowych dla roślin. Do tych wad zaliczamy nadmierną koncentrację składników
szkodliwych dla środowiska, w tym głównie metali cię\
kich, ponadnormatywną obecność chorobotwórczych
organizmów, płynną, mazistą konsystencję, ucią\
liwość zapachową.
WARUNKI KOMPOSTOWANIA
" odpowiedni skład chemiczny materiału wyjściowego
" odpowiedni stosunek węgla organicznego do azotu (C:N)  materiał wyjściowy C:N=17-30:1, gotowy
kompost C:N=20-30:1.
" temperatura  pryzma zagrzewa siÄ™ do 60-70 °C.
Utrzymywanie tej temperatury przez kilka dni gwarantuje pełną higienizację kompostu
i zniszczenie organizmów chorobotwórczych.
32
" wilgotność  optymalny poziom zwilgocenia masy kompostowej wynosi 40-50%,
" utrzymywanie odpowiedniego pH (6,5-7,5),
" napowietrznienie
" rozdrobnienie materiału
PODSTAWOWE OPERACJE TECHNOLOGICZNE
1. Wa\
enie i rejestracja (z archiwizacjÄ…) dowo\
onych odpadów z terenu miasta na składowisko.
2. Hala przyjęć i segregacji odpadów na platformę przyjęć oraz ich załadunek za pomocą ładowarki
kołowej na taśmę linii segregacji. Segregacja mechaniczna w sicie i ręczna z podziałem na strumienie,
" odpady mineralne o frakcji do 20 mm, kierowane na składowisko odpadów,
" odpady o frakcji 20-100 mm, głównie odpady organiczne przeznaczone do kompostowania,
" odpady o frakcji powy\
ej 100 mm, głównie odpady surowcowe i balastowe, kierowane są na
sortowniczą segregacji pozytywnej i negatywnej skąd dalej na składowisko.
Zagęszczenie na prasie wysegregowanych odpadów nieorganicznych bale o wymiarach 80x100 cm do
składowania. Rozdrabnianie wysegregowanych odpadów organicznych. Mieszanie wysegregowanych odpadów
organicznych z osadami ściekowymi.
Zagospodarowanie wysegregowanych strumieni odpadów:
" surowce wtórne (szkło, metale)  układem przenośników taśmowych kierowane są do kontenerów
i dalej okresowo wywo\
one do zagospodarowania na rynku surowcowym,
" odpady niebezpieczne ze strumienia odpadów organicznych (baterie, lekarstwa, farby, opakowania po
środkach chemicznych)  układem przenośników taśmowych kierowane są do kontenerów i dalej
okresowo wywo\
one do zagospodarowania na rynku surowcowym,
" części organiczne ze strumienia o frakcji powy\
ej 100 mm  dotyczy przede wszystkim mokrych
kartonów i opakowań papierowych z zawartością części organicznej  części organiczne kierowane są
na linię odpadów organicznych, przeznaczonych do kompostowania.
3. Kompostowanie wysegregowanych i rozdrobnionych odpadów organicznych.
Wysegregowane odpady organiczne po rozdrobnieniu i zmieszaniu z osadami ściekowymi przewiezione
z oddziału za pomocą ładowarki kołowej do miejsca kompostowania pod wiatą. Miejsce to wyposa\
one jest
w instalacjÄ™ do nawadniania i napowietrzania (metodÄ… rurowÄ…) pryzm oraz odwodnienia (zbierania
i odprowadzania odcieków). Odpady formowane są w pryzmy kompostowe o podstawie ok. 6m, wysokości
2,8 m i długości 65 m. Tak uformowane odpady podlegają procesowi kompostowania przez okres ok. 4-
6 tygodni. Ogółem jest 10 linii pryzmowych, w tym 2 rezerwowe na za i wyładunek kompostowni. Pojemność
1 linii pryzmowej odpowiada tygodniowemu przerobowi odpadów organicznych.
4. Obróbka (uszlachetnianie) kompostu.
" sortowanie frakcyjne kompostu na sicie bębnowym o prześwicie 22 mm,
" oczyszczanie mechaniczne kompostu na stole balistycznym z zanieczyszczeń mineralnych tzw.
Twardych sprÄ™\
ystych (szkło, kamienie, ceramikę, metale, itp.),
" oczyszczanie kompostu z zanieczyszczeń nieorganicznych lotnych (tworzyw sztucznych i folii
opakowaniowych) metodÄ… pneumatycznÄ… w cyklonie.
" odsiew i wydzielone zanieczyszczenia w procesie uszlachetniania kierowane są na linię odpadów
nieorganicznych przed prasą i dalej na kwatery składowania odpadów.
5. Tymczasowe składowanie i dojrzewanie gotowego kompostu.
sprasowanych w bele odpadów organicznych oraz wysegregowanych odpadów mineralnych drobnych
w kwaterze ziemnej: odpady są formowane w warstwy o wysokości 2 m, ka\
da 2 m warstwa odpadów
przesypywana jest warstwą izolacyjną o grubości 0,2 m. Warstwę izolacyjną stanowią odpady mineralne
o frakcji do 20 mm i inne odpady mineralne oraz masy ziemne pozostałe z robót ziemnych przy budowie
kwatery.
33
ENZYMY Z GRUPY OKSYDO-REDUKTAZ
DYSMUTAZY NADTLENKOWE
PosiadajÄ… w swoich centrach jako grupy prostetyczne aktywne jony: \
elaza, manganu, niklu lub miedzi + cynku
(sÄ… metaloproteinami). Najszerzej spotykane sÄ… dysmutazy zawierajÄ…ce \
elazo lub mangan.
Mn-dysmutazy: Propioniobacterium sp, Thermus thermophilus.
Fe-dysmutazy: Propioniobacterium sp., Mycobacterium vaccae, E. coli, Pseudomonas ovalis.
Występują powszechnie u mikroorganizmów tlenowych.
Rozkładają anionowe rodniki ponadtlenkowe do tlenu cząsteczkowego i nadtlenku wodoru i w ten sposób
chronią organizmy przed niszczącym działaniem rodników ponadtlenkowych.
Co to jest rodnik?
To atomy lub cząsteczki posiadające na zewnętrznej orbicie pojedynczy elektron. Dą\
ąc do przyłączenia lub
oddania elektrony wykazujÄ… du\
ą aktywność chemiczną utleniając ka\
dy związek, z którym mają kontakt.
Preferowanym obiektem  ataku rodników są związki zawierające podwójne wiązanie. U organizmów \
ywych
system ten jest zabójczy  skuteczną obronę stanowi glutation.
Toksyczne rodniki ponadtlenkowe tworzÄ… siÄ™ w czasie cyklu redukcji chinonu
redukcja

utlenianie
utlenianie
Uwolnione rodniki ponadtlenkowe działają, jako czynniki redukujące lub utleniające i w ten sposób biorą udział
w rozkładzie ligniny, np. przez rozcinanie pierścieni, demetylację, itp. System ten rozkłada wiele innych
związków aromatycznych.
Rodnik ponadtlenkowy mo\
e działać, jako czynnik utleniający, tworzący wysoko reaktywny jon Mn3+:
O2" - + Mn2+ + 2H+ Mn3+ + H2O2
lub, jako czynnik redukujÄ…cy \
elazo z uwolnieniem tlenu czÄ…steczkowego:
O2" - + Fe3+ O2 + Fe2+
Dalej, 2-wartościowe jony \
elaza wchodzÄ… w reakcjÄ™ z nadtlenkiem wodoru i tworzÄ… ekstremalnie reaktywne
rodniki hydroksylowe:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO" + OH- (reakcja Fentona)
Rodniki ponadtlenkowe mogÄ… tak\
e tworzyć rodniki hydroksylowe:
O2" - + H2O2 HO" + OH- + O2 (reakcja Hober-Weisa)
Rodniki ponadtlenkowe w połączeniu z du\
ą ilością uwalnianego tlenu oraz wespół z rodnikami
hydroksylowymi tworzÄ… system OKSYDO-REDUKUJ
CY rozkładający wiele związków pierścieniowych.
System ten jest jednak zabójczy dla organizmów \
ywych, dlatego produkujÄ… one dysmutazy w celu neutralizacji
tych rodników:

2 2
34
Ogólnie zostało zaakceptowane, i\
u wszystkich dysmutaz jon metalu (M) katalizuje reakcjÄ™ dysmutacji
rodników ponadtlenkowych na drodze cyklicznego mechanizmu redukcyjno-utleniającego:

2
Usuwanie nadtlenku wodoru przeprowadza katalaza:
2 3
PEROKSYDAZY
Są to enzymy katalizujące utlenianie nadtlenkiem wodoru ró\
nych substratów, w tym
aromatycznych. W reakcji dochodzi do redukcji nadtlenków. Peroksydazy zawierają w swojej cząsteczce Fe, Mn
lub Se. Najpierw tworzony jest kompleks \
elaza z wodą a następnie utlenianie donatora wodoru AH2 do
produktu A. Donatorami wodoru mogą być łańcuchy alifatyczne:
Fe3+ (H2O) + H2O2 Fe3+ (H2O2) + H2O
Fe3+ (H2O2) + AH2 Fe3+ (OH) + AH + H2O
AH + Fe3+ (OH) Fe3+ (H2O) + A
Do najbardziej znanych enzymów z tej grupy nale\
y peroksydaza glutationowa, odkryta w 1970 r. Jest to enzym
zale\
ny od selenu, gdy\
selen, jako jedyna grupa prostetyczna, wchodzi w skład centrum aktywnego w formie
selenocysteiny. Enzym ten ma 4 identyczne podjednostki.
Peroksydaza ligninowa (Fe) katalizuje wiele reakcji utleniania w alkilowym łańcuchu bocznym związków
ligninowych. Do utleniania potrzebuje nadtlenku wodoru. Rozrywa wiÄ…zania CÄ…-C² w Å‚aÅ„cuchach bocznych,
wiązania eterowe i utlenia benzylowe grupy alkoholowe do ketonów lub aldehydów. Przy utlenianiu ligniny
peroksydaza współdziała z alkoholem weretrylowym.
OKSYDAZA CYTOCHROMOWA
Enzym z grupy oksydaz zawierajÄ…cy Fe i Cu, u\
ywajÄ…cy tlen, jako akceptor wodoru. Stanowi ostatnie ogniwo
łańcucha oddechowego. Znana jest pod nazwami kompleks cytochrom a i cytochrom a3. Występuje u wszystkich
organizmów tlenowych.
MONOOKSYGENAZY
KatalizujÄ… wbudowanie jednego atomu czÄ…steczkowego tlenu do substratu, podczas gdy 2 jest redukowany do
wody.
DIOKSYGENAZY
Katalizują wbudowanie 2 atomów cząsteczkowego tlenu (z atmosfery) do substratu. Substratami są często
katechol i kwas protokatechinowy. Przy wbudowaniu tlenu do cząsteczki zostaje rozerwany pierścień
aromatyczny. W ten sposób następuje rozerwanie pierścieni benzenowych, katecholowych i innych.
LAKKAZA
Jest oksydoreduktazą. Produkują ją grzyby, szczególnie tzw.  białej zgnilizny drewna . Katalizuje utlenianie
takich monofenoli jak fenol, tyrozyna, naftol i krezol oraz utlenia difenole a tak\
e kwas indoliooctowy
i askorbinowy. Fenole zawierające dłu\
sze łańcuchy boczne są lepszymi substratami. Kompleksy:
Enzym-Cu2+ +AH2 Enzym-Cu2+ + (AH2)+
Enzym-Cu2+ + Cu+ + O2 + H+ Enzym-Cu2+ + H2O
AH2  substrat; (AH2)+ - substrat utleniony
35
CHARAKTERYSTYKA ODPADÓW KOMUNALNYCH
" odpady domowe
" odpady z obiektów u\
yteczności publicznej
" odpady z terenów zieleni
" śnieg i lód
" urobek ziemny
" gruz
" odpady gospodarczo-bytowe
PORÓWNANIE METOD KOMPOSTOWANIA
ZALETY WADY
PRYZMY
" pracochłonne, produkujące zapachy
" elastyczna zmiana przepustowości
" bardzo du\
a powierzchnia terenu
" proste urzÄ…dzenia
kontakt operatora z pryzmami
STOS NAPOWIETRZANY
" pracochłonne, produkujące zapachy
" elastyczna zmiana przepustowości
" bardzo du\
a powierzchnia terenu
" proste urzÄ…dzenia
kontakt operatora z pryzmami
REAKTOR MIESZANY
" pełne natlenienie mieszaniny " stała objętość, brak elastyczności
" pełne wymieszanie kompostu " większa powierzchnia terenu
" przyjmuje ró\
ne materiały strukturotwórcze " kontakt operatora z pryzmami
REAKTOR BEZTLENOWY
" nie musi być intensywnie mieszany
" konieczność tlenowego dojrzewania
" przyjmuje ró\
ne materiały strukturotwórcze
odzysk biogazu
KLASY KOMPOSTU DOJRZAA
EGO WEDA
UG NORMY BN-89/9103-09
JEDNOSTKA
MASY
OZNACZENIA KLASA I KLASA II KLASA III
j. m.
1. CECHY CHEMICZNE: ZAWARTOŚĆ NIE MNIEJ NIś
Zawartość substancji
% s. m. 40 30 20
organicznej
Zawartość azotu
% s. m. 0,8 0,6 0,3
ogólnego
Zawartość potasu
% s. m. 0,2 0,1 0,1
K2O
Zawartość fosforu
% s. m. 0,6 0,4 0,3
P2O5
Zawartość wody % 25-40 25-40 50
Odczyn (pH w H2O) pH 6,5-8,0 6,5-8,0 6,0-9,0
2. ZAWARTOŚĆ METALI CI
śKICH ZAWARTOŚĆ NIE WI
CEJ NIÅ›
MIEDy
Cu mg/kg s. m. 300 600 800
CYNK Zn mg/kg s. m. 1500 2500 2500
NIKIEL Ni mg/kg s. m. 100 200 200
CHROM Cr mg/kg s. m. 300 500 800
OA
ÓW Pb mg/kg s. m. 350 500 800
KADM Cd mg/kg s. m. 5 15 25
36
ROZKA
AD MATERII ORGANICZNEJ I SYNTEZY PRÓCHNICY
37
Technologia kompostowania metodÄ…  Brikollare
38
KOMPOSTOWNIA SYSTEMU ROZDRABNIARKOWEGO [Skaranowski, 1999]
1. Przenośnik stalowo-członowy 6. Przerzucarka kompostu
2. Przesiewacz wstępny 7. Instalacja napowietrzania pryzm kompostowych
3. Rozdrabniarka młotkowa 8. Filtr kompostowy
4. Separator elektromagnetyczny 9. Przesiewacz wibracyjny
5. Mieszalnik homogenizujący z sitem bębnowym 10. Odsiewacz cząsteczek twardych
KOMPOSTOWNIA SYSTEMU DANO [Skaranowski, 1999]
1. Przenośnik płytowy 9. Sito wibracyjne 16. Pojemnik na złom \
elazny
2. Przenośnik taśmowy odpadów 10. Przenośnik taśmowy 17. Pojemnik na części twarde
3. Przenośnik taśmowy odpadów kompostu 18. Przenośnik taśmowy
4. Biostabilizator 11. Oddzielacz części twardych kompostu uszlachetnionego
5. Przenośnik taśmowy balastu 12. Oddzielacz 19. Pojemnik na odsiewy
6. Przenośnik taśmowy elektromagnetyczny 20. Przenośnik taśmowy
kompostu 13. Sito bębnowe kompostu surowego
7. Przenośnik taśmowy balastu 14. Przenośnik taśmowy 21. Wentylator wyciągowy gazów
8. Przenośnik taśmowy balastu kompostu dojrzałego
15. Pojemnik na złom \
elazny
39
KOMPOSTOWNIA SYSTEMU HERHOFF [Skaranowski, 1999]
KOMPOSTOWNIA MOBILNA (ORGANIC 90) [Jurasz, 1998]
1. Kompostownik  Organic 90; 2. Rozdrabniarka; 3. A
adowarka
40
KONTENEROWE URZ
DZENIE DO KOMPOSTOWANIA  SCHEMAT TECHNOLOGII HORTSMANN
[Jurasz, 1998]
41
BADANIE CZYSTOÅšCI MIKROBIOLOGICZNEJ WODY PITNEJ I POWIETRZA
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest oznaczenie stanu sanitarno-biologicznego wody pitnej i powietrza.
Zadania do wykonania
1. Oznaczyć czystość mikrobiologiczną wody pitnej metodą tradycyjną oraz metodą filtrów
membranowych
a) Metoda tradycyjna
Wodę pobierz do jałowej kolby, a następnie dodaj do niej kroplę roztworu tiosiarczanu sodu niezbędnego
do inaktywacji chloru. W celu określenia czystości mikrobiologicznej z badanej wody wykonaj posiewy
w kierunku:
" ogólnej liczby bakterii mezofilnych  posiew na agar od\
ywczy
Jałową pipetą pobierz 1ml badanej wody i przenieś na 2 równoległe płytki Petriego. Płytki zalej następnie
upłynnionym podło\
em agarowym (agarem od\
ywczym, bulionem od\
ywczym lub bulionem wzbogaconym)
i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24-48 h. Posiewy wykonuj bezpoÅ›rednio z pobranej wody lub po jej
rozcieńczeniu zale\
nie od przewidywanego stopnia jej zakwaszenia (po konsultacji z prowadzącym ćwiczenia).
" ogólnej liczby bakterii psychrofilnych  posiew na agar od\
ywczy
Posiew wykonaj w analogiczny sposób jak posiew mający na celu oznaczenie ogólnej liczby bakterii
mezofilnych. Posiane pÅ‚ytki inkubuj w temp. 20 °C przez 72 h.
" obecności bakterii z grupy coli ogólnego  posiew na podło\
e z LBP, tj. podło\
e laktozowe z purpurÄ…
bromokreaolowÄ…
W celu oznaczenia obecność bakterii z grupy coli posiej 100 ml wody na podwójne stę\
one podło\
e aLBP 
50 ml wody do kolbki zawierającej 50 ml podło\
a i po 10ml do 5 probówek z 10 ml po\
ywki LBP. Zaszczepione
próby inkubuj w temp. 37 °C przez 24-48 h.
b) Metoda filtrów membranowych
Zmontuj aparat do filtracji. Za pomocą jałowej pęsety przenieś specjalny filterek na porowatą powierzchnię filtra
zestawu filtracyjnego. Zamocuj lejek, a następnie przeprowadz
filtracjÄ™ wody w celu oznaczenia:
" ogólnej liczby bakterii mezofilnych
Do lejka wlej ok. 100ml jałowej wody i 1ml wody badanej. Włącz pompkę układu filtracyjnego. Po zakończeniu
filtracji wyłącz ja i przenieś filtr na przygotowaną płytkę (Perti-Pad) zalaną uprzednio podło\
em pozwalajÄ…cym
na oznaczenie ogólnej liczby bakterii, pÅ‚ytki inkubuj w pozycji odwróconej w temp. 37 °C przez 24-48 h.
" ogólnej liczby bakterii psychrofilnych  posiew na agar od\
ywczy
Posiew wykonaj w analogiczny sposób jak posiew mający na celu oznaczenie ogólnej liczby bakterii
mezofilnych. Posiane pÅ‚ytki inkubuj w temp. 20 °C przez 72 h.
" ogólnej liczby bakterii z grupy coli
Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce zawierającej podło\
e Endo i inkubuj je w temp.
37 °C przez 24-48 h.
" ogólnej liczby bakterii coli typu fekalnego
Filtracji poddaj 100ml badanej wody. Filterki umieść na płytce zawierającej podło\
e MF i inkubuj je w temp.
44 °C przez 24-48 h.
" ogólnej liczby bakterii z rodzaju Streptococus
Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce selektywnej na streptokoki i inkubuj je w temp.
37 °C przez 24-48 h.
2. Oznaczyć czystość mikrobiologiczną powietrza metodą tradycyjną oraz z zastosowaniem
próbnika powietrza.
a) Metoda tradycyjna czyli sedymentacyjna metoda Kocha (metoda płytkowa)
W celu określenia stanu sanitarno-higienicznego powietrza w wybranym miejscu pomieszczenia ustaw 2 płytki
z agarem od\
ywczym i 1 płytkę z brzeczką + agar. Zdejmij wieczka z płytek i pozostaw je na 15 min. W trakcie
ekspozycji ogranicz ruchy wokół miejsca z ustawionymi płytkami. Płytki zamknij i inkubuj w temperaturze:
" 20 °C przez 72 h  pÅ‚ytka z agarem od\
ywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych)
" 37 °C przez 24-48 h  pÅ‚ytka z agarem od\
ywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych)
" 20 °C przez 72 h  pÅ‚ytka z brzeczkÄ… (ogólna liczba dro\
d\
y i pleśni).
42
b) Metoda z zastosowaniem próbnika powietrza
Próbniki powietrza to specjalnie skonstruowane aparaty do kontroli jakości mikrobiologicznej powietrza.
Aparaty te sÄ… wyposa\
one w czujniki przepływu powietrza, które zapewniają pobór określonej ilości powietrza
gwarantując tym samym powtarzalność wyników. W próbnikach zamontowuje się specjalne płytki z zestalonym
podło\
em  bulionem do oznaczenia ogólnej liczby bakterii oraz z brzeczką słu\
ącą do oznaczania ogólnej
liczby dro\
d\
y i pleśni.
Ustaw aparat na pobór 100 l powietrza. Metalową pokrywkę próbnika przetrzyj alkoholem. Zdejmij wieczko ze
specjalnej płytki i umieść ją w próbniku. Przykręć pokrywkę i włącz aparat. Po przepuszczeniu 100 l powietrza
wyjmij płytkę i zamknij ją.
W celu określenia stanu sanitarno-biologicznego powietrza dokonaj analogicznych posiewów jak w metodzie
tradycyjnej czyli 2 posiewów na płytki z agarem od\
ywczym (zestalonym bulionem) oraz 1 posiewu na płytkę
z brzeczką + agar. Po wykonaniu płytki inkubuj w temperaturze:
" 20 °C przez 72 h  pÅ‚ytka z agarem od\
ywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych)
" 37 °C przez 24-48 h  pÅ‚ytka z agarem od\
ywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych)
" 20 °C przez 72 h  pÅ‚ytka z brzeczkÄ… (ogólna liczba dro\
d\
y i pleśni).
43
ZADANIA
1. Oblicz parametry Km i Vmax 30 min reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi w stÄ™\
eniach 0,2; 0,4; 0,6;
0,8 i 1,0 % w wyniku której otrzymano produkt końcowy (glukozę) w następujących odpowiednich dla
stÄ™\
eń substratu ilościach: 0,7; 1,0; 1,3; 1,7 i 1,94 [mg/ml].
2. Mając dane równania prostych regresji zale\
ności odwrotności szybkości przebiegu reakcji od stę\
enia
substratu:
y = 0,05x + 0,025
y = 0,066x + 0,02
wyciÄ…gnij wnioski o rodzaju inhibicji.
3. Podaj model kinetyczny reakcji wykorzystania laktozy przez bakterie Escherischia coli rosnÄ…cych na
po\
ywkach zawierających laktozę w ilości 10; 5; 2,5 i 1 g/l. Szybkość wykorzystania tego cukru
wynosiÅ‚a odpowiednio 2,5; 2; 1,5 i 1 g/l Å" h. Oblicz przewidywanÄ… szybkość wykorzystania laktozy,
przy poczÄ…tkowym jej stÄ™\
eniu 1,5 g/l.
4. Wyznacz parametry Km i Vmax oraz określ typ inhibicji aktywności alkalicznej fosfatazy przez fosforany,
mając do dyspozycji następujące dane:
StÄ™\
enia substratu Szybkość reakcji Szybkość reakcji z inhibitorem
[A] x 103 M V0 Vi
5,85 0,833 0,488
4,76 0,800 0,425
3,51 0,763 0,345
2,34 0,667 0,274
1,17 0,500 0,159
5. Oblicz jaka ilość inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3l po\
ywek hodowlanych aby po inokulacji
w ich w ka\
dym ml było 106 komórek.
6. WiedzÄ…c, \
e szybkość rozcieńczenia to stosunek V po\
ywki doprowadzanej do reakcji do V po\
ywki
wypełniającej bioreaktor oblicz, jaka powinna być szybkość dodania po\
ywki maltozy wprowadzonej do
bioreaktora z 3 l po\
ywki hodowlanej w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczenia wynosiła 0,05 l/h.
szybkość = x/3 l
x = 0,09 Å" 5
x = 0,45 [l]
x = 450 [ml]
x Å" 5 h = ilość po\
ywki
7. Oblicz, jaką V świe\
ej po\
ywki nale\
y wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h hodowli
wymienić całą V roboczą bioreaktora (5 l po\
ywki) oraz wyznacz szybkość rozcieńczania.
X  1 h
5 l  20 h
x = 0,25 l = 250 ml
V = 250/5000 = 0,05 [h-1]
Ile ml inokulum o c = 4,3Å"109 nale\
y dodać do 3000 ml aby uzyskać 106 komórek?
4,3Å"109  3000
1Å"106  x
x = 3:4,3 = 0,7
W 1 ml ma być 108, czyli w 3000 musi być 3Å"109
1 ml (inokulatu  c.obl)
x  3Å"109
x = (3Å"109 Å" 1 ml)/zawartość obliczeniowa
44
8. Mając daną gęstość komórek w kulturze macierzystej wynoszącą 2x1010 kom/ml oblicz, jaka ilość
inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3 l po\
ywki hodowlanej w bioreaktorze, aby po inokulacji w ka\
dym
jej ml było 108 komórek.
3000Å"108 = 3x1011 kom
2Å"1010 kom  1ml
30Å"1010  x ml
x = 15 ml  trzeba przenieść do bioreaktora
9. Szybkość rozcieńczania D [1/h]
D = obj. po\
ywki wprowadzanej do reaktora [ml/h]/ obj. po\
ywki w naczyniu hodowlanym [ml]
WiedzÄ…c, \
e szybkość rozcieńczania to stosunek objętości po\
ywki doprowadzanej do reaktora do obj. po\
ywki
wypełniającej bioreaktor, oblicz jaką ilość po\
ywki nale\
y wprowadzić do bioreaktora z 3 l po\
ywki hodowlanej
w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczania wynosiła 0,03 h-1.
0,03
X = 90 [ml/h]
CZYLI
XÅ"5h 90 · 5 450 ml
10. Oblicz, jaką objętość świe\
ej po\
ywki nale\
y wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h
hodowli wymienić całą objętość roboczą bioreaktora  5 l płynu hodowlanego oraz wyznacz szybkość
rozcieńczania.
5000 ml  20 h
x  1 h
x = 250 ml/h
D = 250 [ml/h]/5000 [ml] = 0,05 [l/h]
45