Wykład IX
Przegląd struktur RNA pozwala wyróżnić charakterystyczne motywy struktury III rzędowej, które utrzymują się dzięki oddziaływaniom stabilizującym.
Dla tRNA charakterystycznym motywem jest pseudociągłe złącze dwóch pętli typu A, a oddziaływaniami są: staking interkalacyjny i nietypowe (nie Watsona Cricka) wiązania wodorowe.
Poza złączen 2 helis często spotykane jest złącze 3 helis typu A.
Inne motywy strukturalne:
- pseudowęzeł - bardzo prosta struktura, zwinięcie RNA do formy typu kompaktowego. Pseudowęzeł (tu w wersji H). Szpilka do włosów zawiera w pętelce kilka nukleotydów, które mogą parować na sposób Watsona Cricka z pojedynczą nicią.
Struktura ta jest złożona z dwóch układów typu helikalnego (jedna helisa pozostała ze spinki do włosów, druga utworzyła się w wyniku oddziaływania pętelki z pojedynczą nicią) oraz trzech pętli.
W zależności od układu wiązań wodorowych jedna z pętli może być zredukowana do zera, ogólny motyw pseudowęzła typu H może być zredukowany do 2 trzonów heliakalnych i dwóch pętelek.
Podwójne pseudowęzły - jeden lokuje się w środku drugiego. Ilość możliwych kombinacji jest b duża, co zapewnia bogactwo motywów strukturalnych.
-a milon - niesparowana na sposób Watsona Cricka adenina oddziałuje z parą zasad GC od strony małej bruzdy. Taki motyw może być realizowany na kilka sposobów zależnie od ustawienia A w stosunku do pary GC i różnego układu wiązań wodorowych stabilizujących.
W nietypowe wiązania wodorowe zaangażowane są jako akceptory 1N i 3N adeniny, proton grupy aminowej guaniny i grupa ketonowa cytozyny. Pozostałe wiązania wodorowe wynikają z tego, że RNA zawiera w pozycji 2' cukru grupę OH, co zapewnia dodatkowo ich powstawanie.
- zamek rybozowy - związane 2 obszary heliakalne; ściągnięte do siebie i utrzymywane przez wiązania wodorowe (3N adeniny lub guaniny, gr. ketonowej 2 U lub C oraz grup hydroksylowych w pozycji 2')
Wiązania wodorowe z udziałem grupy 2'OH - zapewniają dodatkowo różnorodność struktur RNA; nie ma ich w DNA.
Dla RNA nie funkcjonuje określenie struktury IV rzędowej RNA, choć mogą oddziaływać z innymi cząsteczkami RNA lub białkami.
Zdeponowanych struktur RNA - ponad 1000. Białkowych ponad 20000.
Z termodynamicznego punktu widzenia taki duży układ jest bardzo niestabilny, szczególnie jeśli chodzi o DNA. Proces degradacji DNA jest bardzo duży (modyfikacje chemiczne, które wymuszają zmiany struktury przestrzennej). Może prowadzić do utraty zawartej w DNA informacji genetycznej.
Procesy spontaniczne (zachodzące bez wpływu środowiska):
- dezaminacja cytozyny do uracylu (b niebezpieczne, bo U paruje z A, powstaje mutacja punktowa),
- depurynacja nukleotydów
Procesy wywołane przez związki chemiczne, mutageny modyfikujące zasady i powodujące złe parowanie. Np. zmiana formy aminowej w iminową adeniny przez mutagen, która paruje z C.
Niektóre czynniki mutagenne nie modyfikują chemicznie zasad, ale są to np. interkalatory (pochodne o charakterze pierścieniowym, kancerogeny), które wchodzą pomiędzy zestakingowane pary zasad (staking interkalacyjny) i modyfikują strukturę DNA, co może spowodować niewłaściwe odczytanie informacji genetycznej.
Procesy wywołane promieniowaniem UV lub jonizującym
Dimeryzacja tyminy. Dwie pirymidyny sąsiadujące ze sobą na tej samej nici ulegają tej reakcji pod wpływem UV. Cząsteczka po zaabsorbowaniu kwantu promieniowania uzyskuje energię, następuje wzbudzenie elektronowe - elektron przechodzi z niższego poziomu energetycznego na wyższy (towarzyszą temu wzbudzenia oscylacyjne i rotacyjne). Taka wzbudzona cząsteczka ma inny typ reaktywności. Powstaje dimer, który zaburza strukturę DNA i może powodować przekłamania w odczytywaniu informacji genetycznej.
Systemy naprawy DNA
- bezpośrednie przywrócenie nieuszkodzonego DNA w wyniku działania enzymów naprawczych. Uszkodzenie przez reakcję fotochemiczną lub chemiczną .
Np. rozcinanie dimeru T; enzymy fotoreakcyjne katalizują reakcję przecięcia połączeń między dwoma T. Enzymy fotoreakcyjne wiążą się z tym dimerem i pod wpływem promieniowania światła widzialnego (nie UV) rozcina wiązania pomiędzy dwoma T.
- naprawa przez wycięcie
Też dla niekomplementarnej pary zasad. Niekomplementarna zasada wycinana z nowosyntetyzowanej nici. Układ odróżnia starą nić od nowej, bo niektóre sekwencje na starej nici są metylowane. System naprawczy składa się z układu enzymatycznego, na który składa się m.in. endonukleaza specyficzna w stosunku do danego typu uszkodzenia, polimeraza, ligaza
Proteomika zajmuje się pełnym charakteryzowaniem protonów
Inaczej: Genomika - nie do końca poprawnie.
Proteomika strukturalna - scharakteryzowanie struktur wszystkich białek kodowanych przez gonomy. U człowieka: ok. 300 tys białek kodowanych przez 30 tys genów.
Oprócz metod eksperymentalnych wymagane są rozwinięte metody bioinformatyczne (katalogowanie i łatwy dostęp)
Zespoły badawcze LSF (large skill facility) - badają struktury białek, powiązane z firmami farmaceutycznymi. Zespoły krystalografów, techników NMRowych i teoretyków zajmujących się modelowaniem.
Na podstawie analizowanych struktur można podać oddziaływania między białkami oraz mechanizmy zachodzenia reakcji biochemicznych i pewnych procesów.
W ramach opisanych struktur białkowych wybiera się tzw. tarcze - receptory podatne na określone środki farmakologiczne.
Projektowanie leków - bardzo wydajne w porównaniu do szukania metodą prób i błędów.
Białka - polimery liniowe; zasadniczo 20 aminokwasów, które mogą być modyfikowane (ostateczne ilość większa)
α-aminokwasy posiadają 2 grupy funkcyjne: karbosylową i aminową, które są połączone z węglem Cα.
Grupa aminowa jednego aminokwasu reaguje z grupą karboksylową drugiego, powstaje wiązanie peptydowe i tworzy się łańcuch.
Wolne aminokwasy:
Grupa aminowa proponowana - ładunek dodatni; grupa karboksylowa deprotonowana - ładunek ujemny. W pH fizjologicznym najczęściej jon obojnaczy. pH w którym mamy nienaładowaną cząsteczkę aminokwasu typu jonu obojnaczego, nazywamy punktem izoelektrycznym. Białka też posiadają punkt izoelektryczny, który wynika z deprotonacji lub protonacji reszt bocznych.
Jeśli znamy pK grupy karboksylowej i pK grupy aminowej, to jest to ½ ich sumy, o ile aminokwas nie zawiera reszt zasadowych w łańcuchu bocznym. Wtedy za jonizację jest przede wszystkim odpowiedzialna druga grupa zasadowa, której pK jest z reguły wyższy (ale np. Hys ma niższy).
Ponieważ włączenie aminokwasu likwiduje obie grupy funkcyjne, o własnościach białek decydują reszty boczne.
Reszty boczne dzielimy na kilka typów ze względu na własności fizykochemiczne.
- Reszty hydrofobowe - reszty typu węglowodorów nienasyconych, które powodują, że takie aminokwasy w łańuchu peptydowym unikają wody i wolą oddziaływać z innymi resztami hydrofobowymi.
- reszty hydrofilowe - preferują kontakt z wodą; wśród nich: aminokwasy naładowane lub nienaładowane
- reszty kwasowe - mogą ulegać deprotonacji. Aminokwasy kwaśne: Glu, ASP
- reszty zasadowe - mogą się protonować. Lys, Arg, Hys
pK dysocjacji - charakterystyczne dla kwasów organicznych: ok. 4
pK protonacji - dla Arg i Lys: ok. 10, Hys ma pK protonacji ok. 6, czyli w obszarze pH fizjologicznego, na strukturze białkowej może być uprotonowana.
Inne aminokwasy silnie hydrofilowe: Asn, Gln, mają ugrupowanie CONH2. Są ważne dla stabilności określonych struktur i kompleksów białek. Mogą tworzyć silne podwójne wiązania wodorowe; grupa aminowa jest donorem protonu, a grupa karboksylowa akceptorem.
Aminokwasy zawierające tlen: Ser, Thr (raczej słabo hydrofilowe)
Zawierające siarkę: Met, Cys (najbardziej rekatywny aminokwas; szczególnie utlenianie grupy cysteinowej może prowadzić do powstawania mostka cysteinowego S-S, który jest silnym kowalencyjnym czynnikiem stabilizującym białko).
Pro iminokwas - hydrofobowy; ma drugorzędową grupę aminową, która tworzy się przez utworzenie pierścienia z węglem delta łańcucha (pierścień 5-członowy nienasycony)
Aminokwasy mające boczny promotor, czyli układ cząsteczkowy odpowiedzialny za absorpcję promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV: Phe, Tyr, Trp. One nie tylko absorbują, ale też emitują w procesie fluorescencji. Białka mogą więc fluoryzować, co jest ważne przy badaniu ich przemian. Najsilniej absorbuje i fluoryzuje Trp, nieco słabiej Tyr, bardzo słabo Phe. Jeżeli białka fluoryzują i zawierają Trp, to jest to przeważnie fluorescencja pochodząca od niego, bo energia wzbudzenia z Tyr jest przekazywana na Trp.
Dla aminokwasów aromatycznych może zachodzić oddziaływanie warstwowe, staking π-π (w odróżnieniu od stakingu π-kation, np. przy zbliżeniu się dodatnio naładowanej reszty Lys, typowe oddziaływanie ładunku z układem elektronowym, jedno z ważnych oddziaływań stabilizujących).
Za absorpcję promieniowania w zakresie UV (ok. 200nm) jest również odpowiedzialne wiązanie peptydowe.
We wszystkich aminokwasach z wyjątkiem Gly, węgiel Cα jest asymetryczny, powoduje powstawanie chiralności, tj. niepokrywanie się ze swoim odbiciem zwierciadlanym i możliwość występowania izomerów optycznych, enancjomerów. Taka para skręca płaszczyznę polaryzacji światła (spolaryzowanego liniowo) w dwie strony o ten sam kąt. Enzymy, które włączają aminokwasy do łańcucha są stereospecyficzne, a więc włączają tylko jeden typ izomerów optycznych. Wszystkie białka syntetyzowane w procesie translacji zawierają aminokwasy L.
Jeżeli występują inne węgle asymetryczne (np. Ile), białko składa się tylko ze stereoizomerów, gdzie wokół każdego centrum aktywnego występuje forma jednego typu.
Reszty boczne aminokwasów mogą ulegać obrotom wokół wiązań pojedynczych, czyli mogą występować w różnej konformacji. De jej wyznaczania - NMR. Populacje konformerów występują w równowadze dynamicznej.
Pro - aminokwas cykliczny; 5-członowy pierścień charakteryzowany przez podanie kątów; można zastosować model pseudorotacyjny, gdzie konformację określają dwa paramteryL kąt pseduroatcji i maksymalnego wychylenia jednego atomu pierścienia z płaszczyzny pozostałych. Pro wykazuje równowagę konformacyjną dwóch form: konf E (kąt ps-rot bliski 0), konf S (kąt bliski 180).
Tautomeria
Pierścień Hys - proton przy aznocie może być w dwóch różnych pozycjach (?). Też w równowadze dynamicznej te dwie formy.
Wiązanie peptydowe
Częściowo podwójne; długość ok. 1,33A C-N. W połowie pomiędzy pojedynczym, a podwójnym. Rotacja zahamowana, choć możliwei przejścia typu trans-cis, ale bariera na to przejście wysoka, rzędu 100 kJ/mol
Wiązanie płaskie - 2 atomy wiązania i 4 podstawniki tworzą jedną płaszczyznę.
Korzystne energetycznie jest ustawienie transoidalne.
Kąt, który opisuje konformacje wokół wiązania peptydowego - kąt omega; zwykle ok. 180st.
Na jednym końcu łańcucha wolna grupa aminowa, na drugim wolna grupa karboksylowa, nić jest ukierunkowana. Koniec aminowy - N koniec, karboksylowy - C koniec. Uszeregowanie aminokwasów (struktura I rzędowa) określana od N końca do C końca.
Żeby rozwiązać strukturę przestrzenną, która warunkuje funkcje białka, musimy znać strukturę I rzędową. Sekwencja zapisywana przez notację (skróty trzyliterowe lub jednoliterowe).
Metody sekwencjonowania
- metoda degradacji Edmana
- spektrometria masowa; b. wydajna, powszechnie stosowana w proteomice.
Peptydy oligoaminokwasowe (2, 3, 4) mogą często spełniać ważną rolę biologiczną. Np. antybiotyki, przekaźniki hormonów. Nie są to jednak jeszcze białka.
O białkach można mówić od ok. 30 aminokwasów. Dopiero wtedy pojawia się możliwość przyjęcia jednej zdefiniowanej struktury przestrzennej. Tu silnie stabilizują strukturę mostki dwusiarczkowi.
Średnio białko globularne - ok. 300-400 aminokwasów. Są jednak białka bardzo długie, kilka tys. Aminokwasów, np. białka strukturalne, kolageny.
Metoda Edmana: najpierw białko trzeba pociąć na fragmenty enzymami - protezami, które tną wiązanie peptydowe na styku dwóch określonych aminokwasów, np. trypsyna (tnie łańcuch od strony C-końca Arg i Lys), chymotrypsyna. Można też ciąć chemicznie, np. bromocyjnanianem. Mamy kawałki różnej długości, które następnie sekwencjonujemy. Metoda Edmana działa dla peptydów o długości nie przekraczającej 50 aminokwasów (najlepiej 20-30). Następnie szeregujemy kawałki na zakładkę. Metoda Edmana: w sekwenatorach, białko zaczepia się w warstwie filmu (matrycy koloidowej), przez film przepuszcza się odpowiedni gradient. Białko zaczepione końcem C, a N koniec ulega modyfikacji chemicznej izocyjanianem fenylu, a następnie odszczepia się znakowany aminokwas przez odcięcie selektywnie wiązania peptydowego przy tym aminokwasie, uwalnia się go i określa rodzaj przez czas retencji np. podczas chromatografii HPLC, gdzie czas wymywania w jednoznaczny sposób określa typ aminokwasu. Proces wysoce zautomatyzowany.
Spektormetria masowa. Można określic stosunek masy cząsteczkowej do ładunku.