Preparacja aldolazy z mięśni królika według metody

Taylora i wsp.

1. Odczynniki, szkło i aparatura wykorzystywane przy wykonywaniu ćwiczenia:

- zamrożone mięśnie królika

- woda destylowana

- lód

- 5% roztwór amoniaku

- nasycony roztwór siarczanu amonu (sporządzony na poprzednich zajęciach)

- papierek wskaźnikowy

- roztwory do oznaczania aktywności aldolazowej:

- 10 mM bufor Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.2

- 100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 2.6 mM siarczan hydrazyny, pH 7.5

- 30 mM FDP

- wirówka preparatywna Beckman J-21 B, rotor JA-14

- duże probówki wirówkowe

- spektrofotometr

- kuwety kwarcowe

- zlewki, cylindry, pipety, bagietki

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było zapoznanie się z metodą preparacji aldolazy z mięsni królika za pomocą metody Taylora i wsp.

3. Przebieg doświadczenia

Zamrożone mięśnie królika (50g) rozmrożono, pokrojono na mniejsze kawałki i zmielono na maszynce. Następnie mięśnie zhomogenizowano w wodzie. Homogenat przeniesiono do zlewki umieszczonej w łaźni lodowej i mieszając bagietką ekstrahowano białka przez 20 min. Przelano mieszaninę do probówki wirówkowej i zrównoważono na wadze względem mieszaniny przygotowanej przez inną grupę ćwiczeniową.

Tkankę oddzielono od roztworu białek poprzez wirowanie mieszaniny w wirówce J-21 B przez 20 min 14000 obr/min.

W tym czasie umyto zlewkę i schłodzono ją wraz z cylindrem miarowym w łaźni lodowej.

Uzyskany po wirowaniu mieszaniny supernatant przesączono do przygotowanego cylindra miarowego przez lejek zawierający watę szklaną.

Pobrano o,5 ml przesączu do probówki chemicznej opisanej jaki „przesącz 1” mieszaninę utrzymywano w obniżonej temperaturze, tj. w łaźni lodowej.

Przystąpiono do pomiaru aktywności aldolazy zawartej w pobranej próbce przesączu. Jednocześnie kontynuowano preparacje.

Odczytano objętości pozostałego w cylindrze przesączu, zanotowano wartość w tabeli 1.

Przelano przesącz do schłodzonej zlewki i przeniesiono pod włączony wyciąg.

Miareczkowano przesącz, za pomocą amoniaku do pH 7-7,5, kontrolując ilość dodanego amoniaku

Obliczono objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu, jaką należało dodać do miareczkowanego przesączu, aby uzyskać 50% jego wysycenia.

Do miareczkowanego przesączu dodawano małymi porcjami nasycony roztwór siarczanu amonu. Przesącz powinien być cały czas trzymany w łaźni lodowej i mieszany bagietką. Co pewnien czas sprawdzano pH mieszaniny i wyrównywano je do poziomu 7-7,5.

Otrzymaną wysoloną zawiesinę białek mieszano w łaźni lodowej przez 15 min.

Przelano zawiesinę do probówki wirówkowej i zrównoważono na wadze względem mieszaniny przygotowanej przez inną grupę ćwiczeniową.

Mieszaniny wirowano w wirówce J-21 B przez 25 min, 14000 obr/min.

Uzyskany podczas wirowania supernatant przelano do schłodzonego cylindra miarowego.

Pobrano 0,5 ml przesączu do probówki chemicznej opisanej jako „przesącz 2”, mieszaninę utrzymywano w łaźni lodowej.

Przystąpiono do pomiaru aktywności aldolazy zawartej w pobranej próbce przesączu. Kontynuowano preparacje.

Odczytano objętość pozostałego w cylindrze przesączu i zanotowano wartość w Tabeli 1.

Przelano przesącz do zlewki schłodzonej w łaźni lodowej.

Policzono objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu, jaką należy dodać do otrzymanego przesączu, aby uzyskać 52% jego wysycenia.

Do miareczkowanego przesączu dodawano małymi porcjami nasycony roztwór siarczanu amonu. Przesącz powinien być cały czas trzymany w łaźni lodowej i mieszany bagietką. Co pewien czas sprawdzano pH mieszaniny i wyrównywano je do poziomu 7-7,5.

Otrzymaną mieszaninę pozostawiono do krystalizacji, która będzie przebiegać w temp ~5̊C przez tydzień.

4. Obliczenia

4.1. Ustalenie objętości (NH₄)₂SO₄ (V_{siarczan_amonu}¹) jaką należy dodać do przesączu o pH ok.7,5 aby otrzymać roztwór 50%.

-roztwór przesycony

- nie zawiera siarczanu amonu

4.2. Ustalenie objętości (NH₄)₂SO₄ (V_siarcz.²) jaką należy dodać do przesączu, zawierającego 50% (NH₄)₂SO₄ o pH ok.7,5 aby otrzymać roztwór 52%.

-roztwór przesycony

- nie zawiera siarczanu amonu

4.3. Pomiar absorbancji aldolazy przy λ=240nm oraz λ=280nm , wyznaczenie stężenia i określenie aktywności enzymu testem hydrazynowym. Pomiar pierwszego przesączu

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera:

ɛ = 0,91 [ml/(mg*cm)]

l = 1 [cm]

V_2ald=0,1 ml

V₂ = 3ml + 0,1ml = 3,1ml

(stężenie białek w supernatancie po pierwszym wirowaniu)

V_3ald = 70 μl

V₃ = 70μl + 1500μl + 200μl = 1770μl

aktywność aldolazowa

zmiana absorbancji przy długości fail 240 nm w określonym czasie

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydrazonu

droga optyczna

4.4 Całkowita masa białek dla przesączu 1:

4.5 Wydajność preparacji

4.6. Pomiar absorbancji aldolazy przy λ=240nm oraz λ=280nm, wyznaczenie stężenia i określenie aktywności enzymu testem hydrazynowym. Pomiar drugiego przesączu

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera:

ɛ = 0,91 [ml/(mg*cm)]

l = 1 [cm]

V_2ald = 0,1ml

V₂ = 3ml + 0,1ml = 3,1ml

(stężenie białek w supernatancie po drugim wirowaniu)

V_3ald = 70 μl

V₃ = 70μl + 1500μl + 200μl = 1770μl

4.7 Całkowita masa białek dla przesączu 2

4.8 Wydajność

Zestawienie wyników:

Vp^1 [ml]	Vsiarcz^1[ml]	Vp^2 [ml]	Vsiarcz^2[ml]
92	92	147	6,1

Tabela 1. Objętości przesączy wraz z dodanymi ilościami siarczanu amonu [ml]

	V2 [µl]	A280	C^2białek [mg/ml]	V3 [µl]	ΔA240/min	C^3białek [mg/ml]	Akt^3ald [U/ml]	Akt^3tot [U]	Akt^3spec [U/ml]
Przesącz 1	100	0,7843		70	0,0515
Przesącz 2	100	0,3306	0,3633	70	0,0156	14,2*10^-3			0,4014

Tabela 2. Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych

	Cbiałek^1[mg/ml]	Aktald^1[U/ml]	Akt^1tot [U]	Akt^1spec [U/ml]	M^1białek [mg]	Wydajność preparacji [%]
Przesącz 1					2458	4,92%
Przesącz 2					1656	3,31%

Tabela 3. Obliczenia dla pobranych próbek przesączu (0,5 ml)

5. Wnioski:

Preparacja białka:

Metoda Taylora:

- wykorzystuje stężony roztwór siarczanu(VI) amonu w celu wytrącenia mieszaniny białek

- zakłada krystalizację aldolazy jako sposób oczyszczania tego białka

Metoda Poehota:

- wykorzystuje stężony roztwór siarczanu(VI) amonu w celu wytrącenia mieszaniny białek

- proponują sączenie molekularne (chromatografia żelowa) oraz chromatografię powinowactwa i dializę w celu usunięcia soli

- charakteryzuje się większą wydajnością preparacji oraz możliwością otrzymania dokładniej oczyszczonego preparatu, jednakże jest bardziej pracochłonna

Obie metody łączy ze sobą początkowy etap preparacji. Stosuje się tam m. in. wysalanie, które pozwala na wyizolowanie białek. Zniszczona zostaje otoczka solwatacyjna białek i następuje wytrącenie molekuł.

W przeprowadzonym doświadczeniu wykorzystano metodę Taylora, oraz dla każdego przesączu mierzono aktywność białek testem hydrazydowym. Pomiary aktywności pierwszego przesączu pozwoliły zauważyć, że zostały w nim zachowane nie zniszczone białka. W pomiarach przeprowadzonych dla drugiego przesączu również otrzymano pomiary wykazujące aktywność aldolazy.

Literatura:

[1] Taylor JE., Green AA., Cori G.T, Crystalline aldolase, Journal of Biological Chemistry,173, 1948, 591-604
[2] Penhoet EE., Kochman M., Rutter WJ.,Isolation of Fructose Diphosphate Aldolases A, B, and C,Biochemistry, 8, 1969, 4391-4395

---